LAPORAN PRAKTIKUM HPI

(SB091523)
Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas Hydrophila pada Ikan yang Terserang Penyakit
serta Cara Pewarnaan Bakteri Aeromonas Hydrophila

Nama Kelompok
Musallamah

1507 100 023

Evi Kurnia Sari

1507 100 039

Hutami Tri R

1508 100 008

Novita Mardhia A

1508 100 024

Kelompok IV
Asisten Dosen
Nanin Dwi Rinawati
Dyah Eka W

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER
SURABAYA
2011
BAB I
PENDAHULUAN
1.1

Latar Belakang
Penyakit yang menyerang ikan tropis tawar pada umumnya adalah bakteri.Infeksi bakteri

biasanya timbul apabila ikan menderita stres.Kematian banyak terjadi pada ikan yang menderita
stres karena serangan bakteri yang menyebabkan infeksi.
Bakteri Aeromonas hydrophila salah satu bakteri yang mengakibatkan penyakit dan
mampu menyebabkan kegagalan budidaya ikan air tawar.Bakteri ini menyerang berbagai jenis
ikan air tawar seperti Lele Dumbo, (Clariusglariepinus), Ikan mas (Cyprinus carpio), Gurami
(Osphronemus gouramy) dan Udang Galah (Macrobracium rusenbergil). Bakteri A.hydrophila
dapat menimbulkan wabah penyakit dengan tingkat kematian tinggi (80-100%) dalam waktu 1-2
minggu (Purwaningsih, 2007)
Bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipelajari. Tingkat sel kontras itu dapat
ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud dengan pewarnaan disini adalah perlakuan
dengan zat warna yang mengikat secara selektif baik seluruh sel maupun komponen sel tertentu,
sehingga dapat menghasilkan penyerapan cahaya yang jauh lebih besar.
1.2

Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara isolasi dan kultur

bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta cara pewarnaan bakteri
Aeromonas hydrophila.
1.3

Permasalahan
Permasalahan yang dibahas dalam praktikum ini adalah bagaimana cara isolasi dan kultur

bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta bagaimana cara
pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1

Bakteri Aeromonas hydrophila

Bakteri Aeromonas hydrophila umumnya hidup di air tawar yang mengandung bahan

organik tinggi. Ciri utama bakteri A. hydrophila adalah berbentuk batang, berdiameter 0,3 - 1,0
mikrometer dan panjang 1,0 -3,5 mikrometer, bersifat Gram negatif, hidup pada temperatur
optimal 22 - 28C, gelatinase positif (Holt et al., 1994). Selain itu bakteri ini juga bersifat
fakultatif aerobik (dapat hidup dengan atau tanpa oksigen) yang mengubah karbohidrat menjadi
asam dan gas, tidak berspora, bersifat motil (bergerak aktif) karena memiliki flagel
(Monotrichous flagella) yang keluar dari salah satu kutubnya, koloni bakteri ini pada media agar
benvarna putih kekuningan, bentuk bulat cembung, oksidase sitokrom dan reaksi katalase
positif.Bakteri ini senang hidup di lingkungan perairan bersuhu 15 - 30C dan pH antara 53-9
(Ghufran dan Kordi, 2004).A. hydrophila merupakan bakteri agen penyebab penyakit BHS
(Bacterial Hemorrhagic Septicemia) atau MAS (Motil Aeromonad Septicemia) (Irianto, 2006).
Berikut adalah klasifikasi Aeromonas hydrophila (Holt et. al. 1998):
Filum

: Protophyta

Kelas

: Schizomycetes

Ordo

: Pseudanonadeles

Family

: Vibrionaceae

Genus

: Aeromonas

Spesies

: Aeromonas hydrophila

2.2

Penyakit MAS (Motile Aeromonas Septicaemia)

Salah satu jenis ikan air tawar, lele yang terkena bakteri ini mengalami gejala warna

tubuh menjadi gelap, kulit kesat dan timbul pendarahan. Lele bernafas megap-megap di
permukaan air(Anonim1, 2009).
Menurut Sugianti (2005) gejala yang menyertai serangan bakteri ini antara lain ulser yang
berbentuk bulat/tidak teratur dan berwarna merah keabu-abuan, inflamasi dan erosi di dalam
rongga dan di sekitar mulut seperti penyakit mulut merah (red mouth disease). Tanda lain adalah

haemorhagi pada sirip dan eksopthalmia (pop eye) yaitu mata membengkak dan menonjol
(Nitimulyo et al., 1993). Selain itu ciri-ciri lainnya adalah pendarahan pada tubuh, sisik terkuak,
borok, nekrosis, busung, dan juga ikan lemas sering di permukaan atau dasar kolam
(Dana dan Angka, 1990).

2.2.1

Pencegahan Penyakit MAS

Lingkungan harus tetap bersih, termasuk kualitas air harus baik (Anonim1, 2009).Berikut

adalah standarisasi budidaya Lele dalam mencegah perkembangan Bakteri A. hydrophila.Tanah

yang baik untuk pembuatan kolam pemeliharaan adalah jenis tanah liat/lempung, tidak berporos,
berlumpur dan subur. Mutu air yang digunakan untuk perkolaman harus memenuhi syarat
sebagai berikut: Idealnya untuk tumbuh dan berkembangbiak ikan dalam kolam ialah : Oksigen
sebanyak 0,3 ppm, Karbondioksida kurang dari 12,8 mg/liter, Amoniak terikat 147,29 157,56
mg/liter. Keasaman air ideal antara pH 6,5-9., suhu 20 0C, dengan suhu optimal antara 25-280C.
Sedangkan untuk pembentukan larva diperlukan kisaran suhu antara 26- 30 0C dan untuk
pemijahan 24- 280C (Anonim2, 2009).
2.2.2

Pengobatan Penyakit MAS

Penanggulangan bakteri Aeromonas dapat dilakukan dengan menggunakan antibiotik

melalui perendaman, penyuntikan atau dicampur dengan pakan.Perendaman dilakukan dalam

larutan Kalium Permanganat (PK) 10-20 ppm selama 30-60 menit atau 3-5ppm selama 12-24
jam. larutan 5-10 ppm selama selama 12-24 jam, Oxytetracycline 5 ppm selama 24 jam, Imequil
5 ppm selama 24 jam, 5-8 m3 air untuk waktu yang tidak terbatas (Kordi, 2004).
Pengobatan dapat dilakukan melalui makanan antara lain pakan dicampur Terramycine
dengan dosis 50 mg/kg ikan/hari, diberikan selama 7-10 hari berturut-turut atau dengan
Sulphonamid sebanyak 100 mg/kg ikan/hari selama 3-4 hari. (Anonim 2, 2009). Sedangkan

penanngulangan dengan cara penyuntikan dilakukan dengan Oxytetracycline 20-40 mg/kg ikan,
Kanamycin 20-40 mg/kg ikan atau Streptomycine 20-60 mg/kg ikan (Kordi, 2004).
2.3

Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan bakteri terdapat 2 metode yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan

bertingkat.
a. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana bertujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan untuk
mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri
bakteri.Pewarnaan sederhana dibagi menjadi 2 yaitu pewarnaan langsung dan tidak
langsung. Pada pewarnaan langsung memiliki prinsip bakteri diwarnai oleh reagen
tunggal.pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan,selama asam nukleat
bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat
dan mengikat kation kromogen. Pewarnaan tak langsung (basa atau positif) memiliki
prinsip memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam memiliki
negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena
negative charge pada permukaan bakteri.oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat
dengan latar belakang berwarna (Irianto, 2006).
b. Pewarnaan Bertingkat
Pengecatan bertingkat menggunakan lebih dari satu macam bahan cat.Bahan yang
digunakan dalam pewarnaan adakalanya terpisah, atau adalanya dicampur dan digunakan
dalam satu larutan.Pengecatan bertingkat digunakan untuk penggolongan bakteri dan
penampakan struktur tubuh sel bakteri (Irianto, 2006).

2.3.1

Pewarnaan Langsung
Pewarnaan langsung bertujuan untuk mewarnai apusan bakteri dengan satu jenis zat

pewarna sederhana yang bersifat basa. Prinsip pewarnaan langsung, bakteri diwarnai oleh reagen
tunggal. Pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan, selama asam nukleat
bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan
mengikat kation kromogen. Lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarna yang

digunakan. Karbol fuchsin membutuhkan 15-30 detik,Kristal violet 2-60 detik,dan Methilen Blue
1-2 menit (Irianto, 2006)
Pewarnaan ini dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan.Bahan dan
alat sudah disiapkan dalam keadaan steril, agar bakteri yang akan diamati tidak terkontaminasi
dengan

peralata-peralatan

yang

digunakan.

Kaca

obyek

yang

bersih

dan

tidak

berlemak.Penggunaan aquades adalah untuk menghindari tercampurnya mikroorganisme yang

akan diamati dengan mikroorganisme lain yang terbawa dari bahan dan peralatan praktikum.
Penggunaan kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak adalah agak lemak tidak mempengaruhi
proses fiksasi bakteri dengan zat kimia tertentu. Kemudian jarum ose dipijarkan dan diambil
sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air dikaca obyek dan
dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering. Pemijaran jarum ose digunakan untuk
sterilisasi jarum ose agar tidak terkena kontam dari mikroorganisme lain. Selanjutnya metilen
blue diteteskan sebanyak 5 tetes pada kaca obyek dan dibiarkan zat pewarna tersebut menutupi
seluruh permukaan apusan dan dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.
Pencucian dilakukan diatas staining jar dengan menggunakan tetesan air dari pipet dan tidak
langsung dibuang di saluran pembuangan karena dikhawatirkan mikrorganisme yang digunakan
terbawa oleh air dan mencemari perairan. Kaca obyek dikeringkan dengan cara meletakkan di
atas kertas saring atau tissue. Cara ini dilakukan agar sisa-sisa air setelah pencucian tidak
mengganggu pengamatan dengan mikroskop. Apusan ditetesi dengan minyak emersi dan
preparat siap untuk diamati dibawah mikroskop. Minyak imersi berguna untuk menjernihkan
kaca obyek dan kaca penutup agar memfokuskan gambar yang diamati dimikroskop. Hasil yang
diperoleh adalah pada bakteri E.coli dengan pengamatan dimikroskop perbesaran 1000 terlihat
bahwa bakteri ini berbentuk basil atau batang, selnya berwarna biru dengan background
berwarna ungu. Pada bakteri Bacillus sp. dengan pengamatan dimikroskop perbesaran 1000
terlihat bahwa bakteri ini berbentuk basil atau batang, selnya berwarna biru dengan background
berwarna ungu(Irianto, 2006).
2.3.2

Pewarnaan Tidak Langsung

Pewarnaan tidak lansung dapat juga disebut pewarnaan negatif atau pewarnaan

asam.Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam
memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena
negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat

dengan latar belakang berwarna. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau
perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu
bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat (Hadiotomo,
1990).
Pewarnaan ini dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Bahan
dan alat sudah disiapkan dalam keadaan bersih, agar bakteri yang akan diamati tidak
terkontaminasi dengan peralatan - peralatan yang digunakan meneteskan tinta cina pada kaca
obyek yang bersih dan tidak berlemak. Penggunaan kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak
adalah agak lemak tidak mempengaruhi proses fiksasi bakteri dengan zat kimia tertentu.
Kemudian jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan
digeser-geserkan pada air dikaca obyek. Pemijaran jarum ose merupakan teknik sterilisasi
insenerasi yaitu dengan pemanasan kering. Perlakuan ini bertujuan untuk mengurangi
kontaminasi oleh bakteri-bakteri lainnya yang tidak diinginkan. Jarum ose dipijarkan pada api
bunsen. Inokulasi tinta cina pada kaca obyek dengan bakteri. Selanjutnya kaca obyek yang lain
diambil, lalu diletakkan ujungnya dengan kedudukan miring di pinggir tetesan zat pewarna yang
telah diinokulasikan bakteri. Kaca obyek lain didorong pada kaca objek yang terdapat tinta cina
dan bakteri, sehingga tetesan tinta cina tersebar merata membentuk apusan tipis dipermukaan
kaca obyek pertama, hal ini dilakukan supaya didapatkan film zat warna yang tipis sama
rata.Lalu keringkan kaca obyek dengan cara meletakkan di atas kertas saring atau tissue. Cara ini
dilakukan agar sisa-sisa air setelah pencucian tidak mengganggu pengamatan dengan mikroskop.
Apusan ditetesi dengan minyak emersi dan diamati dibawah mikroskop. Minyak imersi berguna
untuk menjernihkan kaca obyek dan kaca penutup agar memfokuskan gambar yang diamati
dimikroskop Hasil yang diperoleh adalah pada bakteri Escherichia coli dengan perbesaran 1000
pada mikroskop terlihat bahawa bentuknya basil atau batang dengan warna sel yang transparan
dan warna background hitam. Pada bakteri Bacillus sp. dengan perbesaran 1000 pada mikroskop
terlihat bahwa bentuknya basil atau batang dengan warna sel yang transparan dan warna
background hitam (Irianto, 2006).

2.3.3

Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial yang penting dan

yang paling luas digunakan.Pewarnaan ini digunakan untuk mengidentifikasi bakteri gram positif
dan gram negative berdasarkan warna akhir yang terbentuk yaitu gram positif berwarna ungu dan
gram negatif berwarna merah.Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen.
Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai
dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya
warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan
warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna
tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna
dasar. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu
tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan
mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam
keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai
dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.
c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Pewarnaan ini dimulai dengan meneteskan tinta cina
pada kaca.
(Hadiotomo, 1990)

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung
asam tekoat.
c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
(Hadiotomo, 1990)
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya.Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
(Hadiotomo, 1990)
2.4

Patogenesis Penyakit
Menurut Botterelli dan Ossiprandi 1999 yang diacu dalam Hidayat 2006, sebagaimana

halnya bakteri enteropatogenik, terdapat dua mekanisme patogenesa infeksi bakteri Aeromonas
hydrophila, yaitu:
a. Tissue adherence. Mekanisme ini diperantarai oleh S-Layer. S-Layer membantu penempelan
dan kolonisasi bakteri pada mukosa usus. Proses ini juga dibantu oleh struktur filamentous
(fimbriae) atau membranous (adhesins) yang memiliki aktivitas hemagglutinasi, terutama
ditemukan pada strain mesofilik.
b. Toxin production. Toksin Aeromonas dapat diklasifikasikan menjadi endotoksin dan
eksotoksin. Cytotoxins dan enterotoxins (termasuk aktivitas haemolytic) merupakan yang
paling penting dalam patogenitas (Hidayat 2006).

2.4.1

Patogenitas Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila yang patogen, diduga memproduksi faktor-faktor eksotoksin dan

endotoksin, yang sangat berpengaruh pada patogenitas bakteri ini. Eksotoksin merupakan
komponen protein terlarut, yang disekresikan oleh bakteri hidup pada fase pertumbuhan

eksponensial. Produksi toksin ini biasanya spesifik pada beberapa spesies bakteri tertentu baik
Gram positif maupun Gram negatif, yang menyebabkan terjadinya penyakit terkait dengan toksin
tersebut. Endotoksin adalah toksin yang merupakan bagian integral dari dinding sel bakteri Gram
negatif. Aktivitas biologis dari endotoksin dihubungkan dengan keberadaan lipopolisakarida
(LPS). LPS merupakan komponen penyusun permukaan dari membran terluar (outer membrane)
bakteri Gram negatif (Syamsir 2008). Eksotoksin yang diproduksi oleh Aeromonas hydrophila
meliputi hemolisin, protease, elastase, lipase, sitotoksin, enterotoksin, gelatinase, kaseinase,
lecithinase dan leucocidin. Hemolisin merupakan enzim yang mampu melisiskan sel-sel darah
merah dan membebaskan hemoglobinnya. Protease adalah enzim proteolitik yang berfungsi
untuk melawan pertahanan tubuh inang untuk berkembangnya penyakit dan mengambil
persediaan nutrient inang untuk berkembangbiak (Angka 2001). Aeromonas hydrophila dapat
memanfaatkan albumin, kasein, fibrinogen, dan gelatin sebagai substrat protein.Dengan
demikian dapat disimpulkan bahwa bakteri ini bersifat proteolotik (Shotts et al. 1985), sehingga
berpotensi besar sebagai patogen. Adanya enzim proteolitik akan merusak dinding intenstin,
sehingga terjadi penebalan dinding, udem dan semi transparan (Munro 1982). Ketika Aeromonas
hydrophila masuk ke dalam tubuh inang, maka toksin yang dihasilkan akan menyebar melalui
aliran darah menuju organ. Enterotoksin merupakan suatu toksin ekstraseluler bakteri yang
khususnya menyerang saluran gastrointestinal. Lechitinase adalah enzim yang menghancurkan
berbagai sel jaringan dan terutama aktif melisiskan sel-sel darah merah, sedangkan leucocidin
adalah enzim yang dapat membunuh sel-sel darah putih (Pleczar & Chan 1988). Hirono dan Aoki
(1991) menambahkan bahwa Aeromonas hydrophila dapat memproduksi toksin ekstraselular
acetylcholinesterase, phospholipids, acyltransferase, dan protease.
Bakteri Aeromonas hydrophila memiliki struktur dinding sel berupa Lipopolisakarida
(LPS) yang dikenal sebagai endotoksin. Menurut Syamsir (2008), LPS dapat menyebabkan
peradangan, demam, penurunan kadar besi, dan pembekuan darah. Angka (2001) menambahkan
bahwa LPS dapat menyebabkan shock pada inang. Endotoksin akan dilepaskan ke lingkungan
hanya apabila bakteri tersebut mati dan mengalami lisis. Disamping mampu memproduksi
eksotoksin dan endotoksin sebagai faktor virulensi, Aeromonas hydrophila patogen juga
memiliki kemampuan untuk menempel pada sel tubuh ikan melalui aktifitas adhesins (Trust et al.
diacu dalam Austin & Austin 1993).Adhesins ini bersifat sangat selektif, hanya mampu
mengenali rantai polimer D-mannosa dan L-sucosa yang terletak pada permukaan sel eukariot.

Dengan menempelnya Aeromonas hydrophila pada permukaan sel inang, kemungkinan besar sel
inang tersebut akan terinfeksi (Austin & Austin 1993).
2.4.2 Ciri-Ciri ikan yang Terserang Aeromonas hydrophilla
Aeromonas hydrophila telah dihubungkan dengan beberapa penyakit pada ikan, termasuk
busuk ekor, busuk sirip, dan haemorrahagic septicaemia.Haemorrahagic septicaemia ditandai
oleh adanya luka kecil pada permukaan, sering mengarah pada pengelupasan sisik, pendarahan
pada insang dan dubur, borok, bisul, exophthalmia (mata membengkak), dan pembengkakan
perut.Pada bagian dalam, dimungkinkan adanya cairan ascitic di dalam rongga peritoneal,
kekurangan darah merah, dan pembengkakan ginjal dan hati (Miyazaki dan Kage, 1985).Agen
etiologik dipindahkan secara horisontal (antar binatang selain dari induk dan keturunan) tetapi
tidak secara vertikal (dari induk ke keturunan).Bakteri memperbanyak diri di dalam usus,
menyebabkan

suatu

radang

haemorrhagic

mucuous-desquamative

(pengeluaran

lendir

berlebihan).Metabolit beracun Aeromonas hydrophila diserap dari usus dan menginduksi

keracunan.Pendarahan pada kapiler terjadi di permukaan sirip dan di submukosa perut.Sel
hepatik dan epitel dari tubulus ginjal menunjukkan adanya degenerasi.Glomeruli dihancurkan
dan jaringan menjadi berdarah, dengan eksudat dari serum dan fibrin (Miyazaki dan Jo, 1985).
Aeromonas menghasilkan banyak produk yang bersifat toksik bagi sel-sel lain. Beberapa
dilepaskan dari sel aktif dalam bentuk terlarut, sedang yang lain tetap berasosiasi dengan
permukaan sel, dan yang lainnya dilepaskan saat kematian sel. Tiga protein ekstraselular
Aeromonas yang diketahui berkaitan dengan patogenitas telah dikloning, disekuen, dan
dikarakterisasi secara biokimia. Protein tersebut yaitu aerolysin, GCAT (Glycerophospholipid
Cholesterol Acyltransferase), dan serin protease (Rodriguez et al., 1992).
Penjangkitan penyakit biasanya berhubungan dengan perubahan kondisi lingkungan.
Stres, overcrowding (populasinya padat), suhu tinggi, perubahan suhu secara mendadak,
penanganan yang kasar, transfer ikan, rendahnya oksigen terlarut, rendahnya persediaan
makanan, dan infeksi fungi atau parasit, berpengaruh pada perubahan fisiologis dan menambah
kerentanan terhadap infeksi.

Gambar :

Morfologi infeksi Aeromonas

hydrophila pada ikan

(Sumber: Hayes, 2000)

BAB III
METODOLOGI
3.1

Alat dan Bahan

3.1.1

Alat

Peralatan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah cawan petri, tabung reaksi, jarum
ose, bunsen, alas lilin, kapas, kaca obyek, kaca penutup.
3.1.2

Bahan
Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah alkohol, medium TSA, biakan

bakteri Aeromonas hidrophila, ikan mas, Kristal violet, lugol, safranin, methanol, akuades.
3.2

Cara Kerja

3.2.1

Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari Ikan mas

Diambil ikan yang diduga terserang parasit bakteri Aeromonas hydrophila.Di scrapping

bagian luar tubuh ikan yang diduga terserang Aeromonas hydrophila.Di lakukan metode streak
pada medium agar yang telah steril. Di inkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang
terbentuk.
3.2.2

Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari biakan

Di siapkan biakan bakteri Aeromonas hydrophila.Di lakukan metode streak pada medium

agar yang telah steril. Di inkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang terbentuk.
3.2.3

Pewarnaan Gram Bakteri Aeromonas hydrophila

Dipersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Air diteteskan pada kaca obyek yang

bersih dan tidak berlemak. Jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan
sedikit dan digeser-geserkan pada air dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus
sampai kering. Crystal violet diteteskan pada kaca obyek, dibiarkan selama 3-4 menit. Cuci
kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Lugol atau iodine diteteskan, dibiarkan selama
3-4 menit.Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Direndam apusan dalam
metanol selama 30 detik.Dicuci apusan pada air mengalir.Warnai dengan safranin selama 1 menit
sebagai warna pembanding, Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Digambar
hasil pengamatannya.
BAB IV
ANALISA DATA DAN PEMBAHASAN
4.1

Analisa Data

4.1.1

Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari Ikan mas

No
1.

Perlakuan

Diambil ikan yang diduga terserang Ikan yang di gunakan adalah ikan mas
parasit

2.

Pengamatan

bakteri

Aeromonas

hydrophila
Di scrapping bagian luar tubuh ikan Yang diambil adalah pada bagian yang terkena luka
yang diduga terserang Aeromonas
hydrophila

3.

Di lakukan metode streak pada

medium agar yang telah steril

4.

Di inkubasi salama 48 jam

5.

Di amati koloni yang terbentuk

4.1.2

Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari biakan

No
1.

Koloni yang terbentuk

Perlakuan
Disiapkan

biakan

Aeromonas hydrophila

Pengamatan
bakteri

2.

Di lakukan metode streak pada

medium agar yang telah steril

3.

Di inkubasi salama 48 jam

4.

Di amati koloni yang terbentuk

4.1.3

Pewarnaan Gram Bakteri Aeromonas hydrophila

No.
1.

medium rusak,dan koloni tidak tumbuh

Perlakuan

Pengamatan

Dipersiapkan alat dan bahan yang Alat : Jarum ose, bunsen, kaca obyek
diperlukan
Bahan : Kultur murni (Aeromonas hydrophila), Zat
warna asam (Kristal violet, iodin atau lugol,

2.

safranin), Metanol
Air diteteskan pada kaca obyek Terdapat gumpalan air pada kaca obyek

3.

yang bersih dan tidak berlemak

Jarum ose dipijarkan dan diambil Sedikit biakan bakteri terangkat pada jarum ose
sedikit

biakan

bakteri,

dicampurkan sedikit dan digesergeserkan pada air dikaca obyek dan

dibiarkan kering di atas api spirtus
sampai kering
4.

Crystal violet diteteskan pada kaca Crystal violet memberikan warna ungu
obyek, dibiarkan selama 3-4 menit

5.

Cuci kelebihan zat pewarna dengan Kelebihan warna memudar

air secara hati-hati

6.

Lugol

atau

iodine

diteteskan,

dibiarkan selama 3-4 menit

7.

Cuci kelebihan zat pewarna dengan Kelebihan warna memudar

air secara hati-hati

8.

Direndam apusan dalam metanol Preparat terendam dalam alkohol

9.
10.

selama 30 detik
Cuci apusan pada air mengalir
Kelebihan alkohol hilang
Warnai dengan safranin selama 1 Safranin memberikan warna merah
menit sebagai warna pembanding, Kelebihan warna memudar
Cuci kelebihan zat pewarna dengan
air secara hati-hati

11.

4.2

Digambar hasil pengamatannya

Aeromonas hydrophila

Pembahasan
Praktikum yang berjudulisolasi dan kultur bakteri A.hydrophila pada ikan yang terserang

penyakit serta cara pewarnaan bakteri A. hydrophilaini bertujuan untuk mengetahui bagaimana
cara isolasi dan kultur bakteri A. hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta cara
pewarnaan bakteri A. hydrophila.
4.2.1

Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari Ikan mas

Langkah awal yang dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan bahan

yang dibutuhkan.Kemudian diambil ikan yang diduga terserang parasit bakteri A. hydrophila,

setelah itu discrapping bagian luar tubuh ikan yang diduga terserang A. hydrophila.Bagian yang
discrapping adalah bagian tubuh ikan yang terkena luka.Hal ini dimaksudkan agar pada bagian
ikan yang luka terdapat bakteri yang menginfeksi ikan.Kemudian dilakukan metode streak pada
medium agar yang telah steril.Dilakukan metode streak dengan tujuan agar dapat diamati koloni
bakteri yang terbentuk serta morfologi dari koloni tersebut.

Gambar 4.1 Cara membuka cawan Petri saat penggoresan

Gambar 4.2 cara streak dengan teknik gores kuadran

Teknik goresan yang kita pergunakan adalah teknik goresan kuadran. Prinsipnya adalah
sama dengan yang lainnya yaitu pengenceran dimana goresan pertama paling padat kemudian
menjadi semakin tersebar sampai pada goresan ke empat yang terletak ditengah-tengah media.
Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi mikroorganisme, koloninya
yang terpisah berasal dari satu sel. Setelah itu diinkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang
terbentuk. Tujuan diinkubasi adalah agar bakteri dapat tumbuh dan membentuk koloni.
Aeromonas hydrophila bersifat gramnegatif, oksidasi positif dan katalase positif(Krieg
dan Holt 1984).Bakteri ini juga mampumemfermentasikan beberapa gula sepertiglukosa,
fruktosa, maltosa, dan trehalosa.Hasilfermentasi dapat berupa senyawa asam atausenyawa
asam dengan gas. Pada nutrient agar setelah 24 jam dapat diamati koloni bakteridengan
diameter 1-3 mm yang berbentukcembung, halus dan terang (Isohood dan Drake2002).
Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa koloni yang terbentuk adalah bulat, berwarna
putih dan tepinya tidak beraturan seperti terlihat pada gambar dibawah ini.Ciri-ciri koloni

Aeromonas adalah pada media agar benwarna putih kekuningan, berbentuk bulat cembung,
oksidase sitokrom dan reaksi katalase positif.

Gambar 4.3 Koloni yang terbentuk dari isolasi bakteri pada ikan
Bakteri merupakan mikroorganisme yang sangat sederhana, tidak mempunyai nucleus
tetapi memiliki nukleoid yang terbentuk seperti nukleus dan sifatnya berbeda dengan organisme
yang mempunyai inti sel. Bakteri termasuk organisme yang mempu menguraikan bahan organik
menjadi unsur anorganik sederhana yang bisa dimanfaatkan organisme produsen dalam proses
fotosentesis. Seperti telah kita ketahui bahwa satuan ukuran bakteri adalah micron, namun ketika
ditumbuhkan dalam media umumnya akan membentuk koloni. Koloni inilah yang memudahkan
kita melakukan pengamatan secara langsung dan visual.Setelah waktu inkubasi bakteri yang
tergores pada media di harapkan tumbuh dan menyebar dan bisa terpisah membentuk kolonikoloni terpisah.Menururt Tarigan (1988) kebutuhan mikroorganisme untuk pertumbuhan dapat
dibedakan menjadi dua kategori, yaitu: kebutuhan fisik dan kebutuhan kimiawi atau kemis.
Aspek-aspek fisik dapat mencakup suhu, pH dan tekanan osmotik.Sedangkan kebutuhan kemis
meliputi air, sumber karbon, nitrogen oksigen, mineral-mineral dan faktor penumbuh.Dalam
pertumbuhannya setiap makhluk hidup membutuhkan nutrisi yang mencukupi serta kondisi
lingkungan yang mendukung demi proses pertumbuhan tersebut, termasuk juga bakteri. Menurut
Darkuni (2001) pertumbuhan bakteri pada umumnya akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan.
Pengaruh faktor iniakan memberikan gambaran yang memperlihatkan peningkatan jumlah sel
yang berbeda dan pada akhirnya memberikan gambaran pula terhadap kurva pertumbuhannya.
Kebutuhan-kebutuhan tersebut dipenuhi dari media pertumbuhan yang kita gunakan dan
pengkondisian pada saat inkubasi.Pertumbuhan merupakan proses bertambahnya ukuran atau
subtansi atau masa zat suatu organisme, misalnya kita makhluk makro ini dikatakan tumbuh
ketika bertambah tinggi, bertambah besar atau bertambah berat. Pada organisme bersel satu
pertumbuhan lebih diartikan sebagai pertumbuhan koloni, yaitu pertambahan jumlah koloni,
ukuran koloni yang semakin besar atau subtansi atau masssa mikroba dalam koloni tersebut

semakin banyak, pertumbuhan pada mikroba diartikan sebagai pertambahan jumlah sel mikroba
itu sendiri seperti pada gambar di bawah ini.

Gambar 4.4 pertumbuhan bakteri pada media agar

4.2.2

Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari biakan

Langkah awal yang dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan bahan

yang dibutuhkan.Kemudian menyiapkan biakan bakteri A. hydrophila.Di lakukan metode streak

pada medium agar yang telah steril.Dilakukan metode streak dengan tujuan agar dapat diamati
koloni bakteri yang terbentuk serta morfologi dari koloni tersebut. Di inkubasi salama 48 jam
dan di amati koloni yang terbentuk. Pada saat pengamatan ternyata medium tidak tumbuh
koloni.Hal ini kemungkinan disebabkan karena pada saat melakukan streak bakteri jarum ose
yang digunakan terlalu panas sehingga biakan bakteri yang diambil mati sehingga tidak tumbuh.
Selain itu dimungkinkan disebabkan oleh umur kultur bakteri terlalu lama atau tua sehingga
dimungkinkan mati.
4.2.3

Pewarnaan Gram Bakteri Aeromonas hydrophila

Langkah awal yang dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan bahan

yang diperlukan.Air diteteskan pada kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak. Jarum ose
dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air
dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering. Crystal violet diteteskan
pada kaca obyek, dibiarkan selama 3-4 menit. Penambahan kristal violet berfungsi sebagai
pewarna bakteri.Kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati. Lugol atau
iodine diteteskan, dibiarkan selama 3-4 menit. Penambahan Lugol berfungsi untuk mematikan
bakteri. Kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Direndam apusan
dalam metanol selama 30 detik.Metanol berfungsi untuk fiksasi. Kemudian dicuci apusan pada
air mengalir. Kemudian diwarnai dengan safranin selama 1 menit sebagai warna pembanding,

kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Penambahan safranin
berfungsi untuk memperjelas pewarnaan bakteri. Setelah itu digambar hasil pengamatan.Hasil
pewarnaan menunjukkan bahwa bakteri hasil pewarnaan adalah bakteri Aeromonas hydrophila.
Aeromonas adalah jenis bakteri yang bersifat metropolitan, oksidasif, anaerobik fakultatif, dapat
memfermentasi gula, gram negatif, tidak membentuk spora, bentuk akar, dan merupakan
penghuni asli lingkungan perairan.Aeromonas hydrophila adalah bakteri gram negatif. Hal ini
sesuai dengan pernyataan Holt et all tahun 1994 yang menyatakan bahwa bakteri Aeromonas
hydrophila umumnya hidup di air tawar yang mengandung bahan organik tinggi. Ciri utama
bakteri A. hydrophila adalah berbentuk batang, berdiameter 0,3 - 1,O mikrometer dan
panjang 1,O -3,5 mikrometer, bersifat Gram negatif, hidup pada temperatur optimal 22 2gC, gelatinase positif (Holt et all., 1994). Selain itu bakteri ini juga bersifat fakultatif
aerobik (dapat hidup dengan atau tanpa oksigen) yang mengubah karbohidrat menjadi asam
dan gas, tidak berspora, bersifat motil (bergerak aktif) karena memiliki flagel (Monotrichous
flagella) yang keluar dari salah satu kutubnya, bakteri ini senang hidup di lingkungan
perairan bersuhu 15 - 30C dan pH antara 53-9 (Ghufran dan Kordi, 2004). A. hydrophila
merupakan bakteri agen penyebab penyakit BHS (Bacterial Hemorrhagic Septicemia) atau
MAS

(Motil Aeromonad

Septicemia) (Irianto, 2005).Ketika diwarnai bakteri Aeromonas

berwarna merah. Hal ini disebabkan karena Aeromonas adalah jenis bakteri gram negatif. Ketika
penambahan kristal violet baik bakteri gram positif ataupun gram negatif dapat terwarnai duaduanya dimana warna yang terbentuk adalah warna biru. Ketika penambahan metanol maka
bakteri gram negatif pada bagian lipidnya akan terdegradasi sehingga bakteri gram negatif yang
tadinya terwarnai menjadi tak berwarna. Kemudian penambahan lugol berfungsi untuk
membunuh bakteri. Selanjutnya ditambahkan safranin, penambahan safranin akan mewarnai
bakteri gram negatif yang tadinya tidak berwarna. Sedangkan bakteri gram positif sudah tidak
bisa menyerap warna lagi karena sudah terwarnai pada penambahan kristal violet.

Gambar 4.5 hasil pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit pada budidaya
ikan air tawar. Bakteri tersebut menyerang ikan mas yang merupakan salah satu komoditas
unggulan air tawar dan dapat menginfeksi ikan pada semua ukuran yang dapat menyebabkan
kematian sampai 80%. Penanggulangan bakteri Aeromonas terutama A. hydrophila yang
menginfeksi ikan mas dengan menggunakan antibiotik sudah banyak dilakukan, tetapi usaha
tersebutdapat mengakibatkan terjadinya resistensi terhadap bahan-bahan kimia (antibiotik) dan
penggunaan vaksin masih memungkinkan ikan dengan mudah diserang oleh bakteri atau
penyakit lain.A. hydrophila telah dihubungkan dengan beberapa penyakit pada ikan, termasuk
busuk ekor, busuk sirip, dan haemorrahagic septicaemia.Haemorrahagic septicaemia ditandai
oleh adanya luka kecil pada permukaan, sering mengarah pada pengelupasan sisik, pendarahan
pada insang dan dubur, borok, bisul, exophthalmia (mata membengkak), dan pembengkakan
perut.Pada bagian dalam, dimungkinkan adanya cairan ascitic di dalam rongga peritoneal,
kekurangan darah merah, dan pembengkakan ginjal dan hati (Miyazaki dan Kage, 1985).

Gambar 4.6 hasil pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila (Literatur)

Pencegahan dalam budidaya perairan dapat dilakukan dengan beberapa langkah yaitu:
1. Hindari perpindahan ikan dari satu kolam ke kolam lain. Ikan secara bertahap membangun
resistansi terhadap bakteri local tapi dapat membawa organisme virulen bila dipindahkan.
2. Sediakan kondisi lingkungan optimal, berikan perhatian khusus pada mempertahankan tingkat
oksigen dan penanganan ikan yang hati-hati. Perawatan dengan menggunakan alat sangat
menolong saat mensortir, penanganan atau pemindahan bibit ikan.
3. Sebisa mungkin hindari penggunaan antibiotik, meskipun antibiotik dan disinfektan seringkali
terbukti ampuh digunakan dengan ditambahkan pada air sebanyak 2-4 ppm seperti acriflavin
dan prophylactic (Warren, 1991). Penggunaan antibiotik dapat menyebabkan resistensi pada
patogen.
4. Sebagai pengganti antibiotik, gunakan vaksin yang bersifat spesifik Aeromonas, probiotik,
atau bioaktif yang terbukti ampuh untuk meningkatkan kekebalan tubuh ikan.

(Anonim3, 2011).

BAB V
KESIMPULAN
Kesimpulan yang diperoleh dari parktikum ini adalah isolasi dan kultur bakteri pada ikan
dapat dilakukan dengan metode streak dengan teknik gores kuadran. Teknik pewarnaan bakteri
Aeromonas hydrophila dapat dilakukan dengan 4 tahapan yaitu penambahan Kristal violet,
penambahan lugol, fiksasi dengan methanol dan penambahan safranin.Bakteri Aeromonas
merupakan jenis bakteri yang bersifat metropolitan, oksidasif, anaerobik fakultatif, dapat
memfermentasi gula, gram negatif, tidak membentuk spora, bentuk akar, dan merupakan
penghuni asli lingkungan perairan.Aeromonas hydrophila juga merupakan salah satu bakteri
penyebab penyakit pada budidaya ikan air tawar.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim1.2009.

Hama

dan

Penyakit

Ikan

Lele.

Diakses

dari

http://1001peluangusaha.wordpress.com pada tanggal 14 Januari 2011 Pukul 15.00 WIB

Anonim2.

2009.

Standar

Operasi

dan

proses

Budidaya

Ikan

Lele.

Diakses

darihttp://r1organik.com pada tanggal 14 Januari 2011 Pukul 17.00 WIB

Anonim3. 2011. Mengantisipasi Serangan Bakteri Aeromonas pada Ikan. Diakses dari
http://benihikan.net/penyakit/mengantisipasi-serangan-bakteri-aeromonas-pada-ikanpatin-dan-manusia/ pada tanggal 15 Januari pukul 17.00 WIB
Angka, Sri Lestari. 2005. Kajian Penyakit Motil Aromonad Septicema (MAS) pada ikan lele
dumbo

(Clarias

sp.);

Patologi,

Pencegahan

dan

Pengobatannya

dengan

Fitofarmaka. Disertasi Sekolah Pasca Sarjana Intitut Pertanian Bogor.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.

Hayes,

J.,

2000.

Aeromonas

hydrophila.Oregon

State

University.

http://hmsc.oregonstate.edu/classes/MB492/hydrophilahayes Tanggal akses: 13

December 2006
Irianto. 2006. Patogen Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press.Yogyakarta.
Kordi, K dan H. Ghufran.2004.Penanggulangan Hama dan PenyakitIkan.PT Rineka Cipta
dan PT Bina Adiaksara. Jakarta
Miyazaki, T. and Kaige, N. 1985.A histopathological study on motile aeromonad disease in
Crucian carp.Fish Pathology. Edisi 21: halaman 181185.
Miyazaki, T. and Jo, Y. 1985.A histopathological study on motile aeromonad disease in ayu.Fish
Pathology. Edisi 20: halaman 5559.
Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998.Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.