Bagus Paramajati(130342615405) & Hilda Wardani S.N.

(130342615346)
Offering : HW & HL (Genetika Kamis Pagi)
Kel : 16
REKAYASA GENETIKA
Terdapat 3 sumber yang menyatakan tentang arti rekayasa genetika :
1. Rekayasa genetika adalah manipulasi sifat genetik suatu organisme dengan cara
mengintroduksi atau mengeleminasi gen-gen tertentu (Micklos, dkk, 1990).
2. Rekayasa genetika adalah manipulasi genetik dalam sel untuk menghasilkan sesuatu
sifat yang dikehendaki, kadang-kadang disebut teknologi rekombinan DNA
(Rasmussen, dkk, 1990).
3. Rekayasa genetika adalah teknik mengubah konstitusi genetik sel atau individu
dengan cara pemindahan selektif, insersi atau dengan cara modifikasi gen baik yang
individual maupun yang berupa perangkat gen (Klug, dkk, 1994).
Dari kutipan tiga pendapat tersebut memperlihatkan bahwa pada rekayasa genetika ada
manipulasi atas materi genetik dengan cara menambah atau menghilangkan gen tertentu.
Dengan demikian tanpa manipulasi atas materi genetik dengan cara seperti itu, suatu macam
bioteknologi seperti kultur jaringan, bahkan kultur sel, tidak layak dikategorikan sebagai
teknik rekayasa genetika.
Berbagai fenomena genetika alami, jika dicermati sebenarnya menjadi model alami dari
teknologi rekayasa genetika. Fenomena genetika alami itu antara lain crossing over, gene
pick up, transduksi, insersi, delesi, translokasi, fusi dan fisi. Dan terjadi
pemutusan,penyambungan,serta perpindahan bagian materi genetik yang dapat berakibat
terjadinya penambahan atau peniadaan suatu atau beberapa gen.
PROSES REKAYASA GENETIKA
A. Teknik-teknik rekayasa genetika
Menurut Smith dan Byars (1990) terdapat berbagai teknik yang digunakan dalam
rekayasa genetika, misalnya transfer vector, injeksi mikro, fusi protoplas, dan elektroporesi.
Selain teknik-teknik itu, Klug dkk (19949 menambahkan juga teknik kopresipitasi kalsium
fosfat dan endositosis.
1. Transfer Vektor
Transfer vector merupakan cara memasukkan suatu gen ke sel baru dengan
menggunakan pembawa (carrier) khusus. Transfer semacam ini memanfaatkan prose alami
seperti yang terjadi pada transfer DNA oleh bakteri dan virus. Vektor-vektor yang digunakan
untuk memasukkan gen kedalam suatu sel baru adalah plasmid berkteriofag dan kosmid atau
cosmid. Ada juga yang disebut vektor Shuttle vectors atau vektor ulang-alik.
Syarat-syarat DNA agar dapat dijadikan sebagai vektor antara lain :
1. Molekul DNA itu harus mampu melakukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen
DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara
membawahi suatu ori
2. Molekul DNA itu seharusnya mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim restriksi
khusus yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA.

3. Molekul DNA itu seharusnya membawahi suatu penanda yang dapat dimanfaatkan
untuk identifikasi sel-sel inang yang mengandungnya.
4. Molekul DNA itu seharusnya mudah terbebas kembali dari sel inang.
Ada beberapa sifat lain yang di harapkan :
5. Berat molekulnya rendah
6. Adanya kemampuan untuk memberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada
sel inang.
a. Plasmid
Contoh plasmid misalnya ColE1 dan RSF2124. Plasmid-plasmid itu terbentuk secara
alami in vivo. Plasmid-plasmid itu terdapat pada E. Coli (plasmid RSF2124 merupakan
derivat dari plasmid ColE1).
b. Bakteriofag
Bakteriofag yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E.Coli
adalah fag . Seluruh gen fag sudah diidentifikasi dan dipetakan urut-urutan genom
secara keseluruhan juga sudah diketahui.
Bakteriofag lain juga digunakan sebagai vektor, dan salah satu di antaranya adalah
M13 (Klug, dkk, 1994). Materi genetic M13 berupa DNA unting tunggal. Dalam hal ini
jika M13 menginfeksi suatu sel bakteri, DNA unting tunggal yang disebut sebagai RF
(Replication Form). Susunan dari molekul RF terdiri dari suatu unting tunggal (+) yang
mengandung satu unting segmen DNA yang diinsersikan. Klon DNA unting tunggal yang
di hasilkan oleh M 13 dapat digunakan untuk pengurutan DNA atau sebagai templet
untuk perubahan urut-urutan klon akibat mutasi.
c. Cosmid / Kosmid
Kosmid adalah vektor yang dibangun/dibuat di laboratorium memanfaatkan uruturutan cos dan fag yang berguna untuk pemasukan/pengumpulan kromosom ke dalam
kepala fag dan yang memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah kosmid) utnuk fungsi
resistensi terhadap antiobiotik serta replikasi (Klug, dkk, 1994).
d. Vektor ulang alik (shuttle vectors)
Selain vektor-vektor transfer seperti plasmid, bakterio fag , dan kosmid yang
digunakan untuk pengklonan DNA, vektor lain yang dimanfaatkkan untuk memanfaatkan
untuk memasukkan molekul-molekul DNA rekombinan ke dalam sel prokariotik maupun
eukariotik. Vektor-vektor semacam itu disebut vektor ulang alik atau shuttlr vectors.
Vektor ulang alik atau shuttlr vectors adalah vektor pengklon yang dapat bereplikasi di
dalam dua atau lebih mahkluk hidup inang.
B. Injeksi mikro, fusi proptoplas, elektroporesi, kopresipitasi kalsium fosfat dan
endositosis, serta proyeksi mikro
Pada injeksi mikro digunakan jarum mikroskopis, untuk memasukkan DNA melalui
membrane sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Pada fusi protoplas terjadi pelarutan dua
membrane sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel dapat digabung menjadi satu.
Berkaitan dengan fusi protoplas, suatu system transformasi sederhana sudah
dikembangkan yang memanfaatkan liposom yang tersusun dari suatu lipida kationik. Dalam
hal ini terbentuklah vesikula-vesikula milamellar, DNA dalam larutan secara spontan dan
efisien membentuk kompleks dengan liposom-liposom itu.
Pada teknik elektroporesi digunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di
membrane sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Berkenaan

dengan elektroporesi, pada pendedahan singkat kejutan listrik berkekuatan 4000-8000V, selsel memperoleh DNA eksogen dan larutan sekitar. Perlakuan kosmid sebelum kejutan listrik
akan meningkatkan frekuensi efisiensi transformasi.
Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya butir-butir
kopresipitasi kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis. Cara tersebut
merupakan cara umum untuk memasukkan suatu DNA ke dalam sel-sel mamalia, sekalipun
tingkat keberhasilan teknik antara 1-2%.
Pada teknik proyektil mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel. Bahkan
dinyatakan teknik tersebut merupakan suatu cara yang sama sekali baru untuk memasukkan
asam nukleat ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Hal yang perlu
diperhatikan pada teknik proyektil mikro tidak dibutuhkan kultur sel ataupun perlakuan
jaringan resipien.
C. Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan
1. Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuclease restriksi yang mengenal
dan memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik.
2. Segmen-segmen tersebut digabung ke molekul DNA lain dengan bantuan vektor.
Vektor dapat bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan
identifikasi molekul DNA yang terbentuk.
3. Vektor yang sudah terinsersi sefmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Di dalam sel
tersebut molekul DNA rekombinan (yang tersusun dan segmen yang terinsersi)
direplikasikan menghasilkan berlusin-lusin salinan yang disebut klon-klon.
4. Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang, dimurnikan dan
dianalisis.
5. Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskannya kepada seluruh
turunan, menghasilkan suatu populasi sel-sel yang identik yang semuanya
membawahi urut-urutan yang diklon.
6. Secara potensial, DNA yang diklon dapat ditranskripsikan, RNAd-nya ditranslasikan
serta produk-produk gennya diisolasi dan dikaji.
D. Peran Enzim Endonuklease Retriksi
Pada urutan pertama proses yang menjadi prosedur dasar teknik DNA rekombinan yang
diperantai oleh vektor enzim endonuklease dibutuhkan untuk memotong molekul DNA dalam
rangka pembuatan fragmen DNA. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibentuk tanpa
bantuan enzim endonuklease restiksi. Penanaman endunuklease restiksi di beri nama
berdasarkan macam makhluk hidup tempat enzim tersebut diisolasi secara konvensional
digunakan sistem tiga huruf dalam posisi huruf miring yang diikuti dengan suatu angka
romawi.
Enzim endonuklease retriksi terbagi menjadi dua kelompok atau tipe (Russel, 1992). Tipe
I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya
memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim endonuklease
restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim
endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe
ini memotong DNA di dalam urutan (Russel,1992). Enzim endonuklease restriksi bermanfaat
untuk pembentukan molekul DNA rekombinan.

Untuk pengenalan ezim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang
melewati titik tengah urutan pengenalan (Russel, 1992). Dalam urutan basa 53 pada unting
DNA sama dengan urutan basa 53 pada komplementernya.

Enzim endonuklease restriksi sudah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang
berbeda (Russel, 1992). Oleh karena itu setiap enzim memotong DNA pada suatu pasangan
nukleotida yang spesifik untuk enzim yang bersangkutan, jumlah potongan yang dibuat
enzim pada suatu molekul DNA tertentu tergantung pada jumlah berapa kali urutan
pengenalan ditemukan pada DNA.
Enzim endonuklease restriksi tipe II menghasilkan ujung-ujung lancip yang memiliki nilai
khusus pada pengklonal fragmen-fragmen DNA jika kedua ujung tajam hasil pemotongan
bertemu dalam larutan, maka akan berbentuk pasangan basa yang sempurna (ikatan kimia
antar gula dan asam fosfat akan terbentuk di bawah pengaruh enzim DNA ligase.
Peluang jumlah tapak pemutusan pada suatu DNA oleh enzim endonuklease restriksi II
dapat dihitung dalam kaitannya dengan jumlah pasangan nukleotida pada setiap urutan
pengenal, sepanjang keberadaan tiap pasangan nukleotida bersifak acak. Peluang jumlah
tersebut ditunjukkan pada tabel berikut.
Pasangan nukleotida pada tapak

Probabilitas kejadian

restriksi
4

(1/4)4 = 1 dalam 256 bp

(1/4)5 = 1 dalam 1024 bp

(1/4)6 = 1 dalam 4096 bp

(1/4)8 = 1 dalam 65, 476 bp

11

(1/4)11

E. Seleksi Klon Rekombinan

Pada urutan dari fragmen DNA restriksi yang ditranskripsikan menjadi RNA atau
membuat peta urut-urutan hasil hibridisasi dengan fragmen-fragmen restriksi. Oleh karena
itu, Southern mengembangkan suatu metode untuk mendeteksi fragmen-fragmen di dalam sel
agarose yang komplementer denga urutan RNA atau DNA tertentu, metode ini dikenal
dengan Southern Blotting. Pada inti metode ini mentransfer makro molekul dari gel yang
berarti telah di pisahkan secara elektroforesis ke suatu permukaan membran.

MANFAAT DAN RESIKO REKAYASA GENETIKA

Manfaat rekayasa genetika dapat dilihat kaitannya dengan analisis genetik, diagnosis
atas penyakit manusia, terapi gen, sidik jari DNA, serta bioteknologi (Klug dkk, 1994).
Analisis Genetika
Para ahli genetika menggunakan teknik-teknik DNA rekombinan untuk analisis
genetik (Klug dkk, 1994). Teknik-teknik ini memungkinkan pengadaan suatu kumpulan klon
yang meliputi keseluruhan klon, demikian pula memungkinkan pemetaan genetika maupun
fisik yang lengkap, serta memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseluruhan
kromosom. Peta fisisk yang dihasilkan memperlihatkan seluruh gen pada genom yang di
tandai oleh urutan nukleotida, tanpa pula memperhatikan mutan bahkan sering tanpa
dukungan pengetahuan awal tentang fungsi atau fenotip dari gen-gen yang dipetakan.
Diagnosis molekuler atas penyakit manusia
Pemanfaatan urutan DNA yang diklon memungkinkan pengamatan langsungterhadap
genotip dari pada pengamatan atas suatu produk gen yang belum di kenal atau yang tidak
terekspresi. Contoh deteksi molekuler dapat dilakukan atas Thelessemia dan Sickle cell
anemia.
Terapi gen
Kemampuan mengisolasi dan mengklon gen-gen spesifik manusia yang pada mulanya
dikembangkan sebagai suatu penelitian. Proses terapi semacam ini di sebut terapi gen.
Metode ini dikembangkan untuk memasukkan gen ke dalam sel manusia, termasuk
pemanfaatan vektor virus maupun fusi sel dengan vesikula buatan yang mengandung urutan
DNA yang diklon, transfer kimiawi yang mendorong pengangkutan gen melewati membran
sel jika sudah dilakukan. Panduan terapi gen sudah disusun dan mencakup beberapa
persyaratan (Klug dkk., 1994) yang akan dikemukan lebih lanjut.
Gen harus diisolasi dan ditransfer.
Cara transfer gen yang efektif harus ada.
Jaringan target harus dapat dicapai, sebagai contoh percobaan terapi gen yang pertama
menggunakan sel-sel darah putih ataupun prekursornya sebagai jaringan target.
Terapingen tidak boleh menyakiti pasien dan sudah tidak ada cara terapi lain yang
efektif.
Sidik Jari DNA

RFLP sudah digunakan untuk membedakan salinan gen yang normal dari yang mudah
dan dapat digunanakn sebagai penanda genetik, karena polimorfisme tersebut diwariskan
dalam pola kodominan. Fenotip dari penanda-penanda ini berupa susunan atau deretan
fragmen DNA berbagai ukuran yang ada pada southern blott, sesudah DNA dipotong dengan
suatu enzim endonuklease restriksi.
Bioteknologi
Masing-masing jaringan dikendalikan oleh banyak gen, mengubah bentuk tubuh
maupun intelegensi manusia pada saat sekarang masih jauh dari jangkauan teknologi genetika
yang diketahui. Rekayasa genetika dalam pertanian menjanjikan masa depan yang cerah
namun ada keterbatasan bioteknologi pertanian. Menurut Micklos dan freyer (1990) kesulitan
analisis ygenetik tanaman disebabkan oleh :
1. Pertumbuhan tanaman yang lambat dan umur pergantian generasi yang lama
2. Besarnya genom tanaman, termasuk banyaknya kromosom poliploid
3. Dan dimilikinya kotak kayu yaitu dinding sel berupa selulose yang mengelilingi
tanaman.
PERTANYAAN
1. Jelaskan apa yang membedakan antara enzim endonuklease retriksi?
Jawaban : Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada
DNA dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari
urutan. Enzim endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk
pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu
urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA di
dalam urutan. Enzim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri
yang melewati titik tengah urutan pengenalan. Dalam urutan basa 53 pada unting
DNA sama dengan urutan basa 53 pada komplementernya.
2. Bagaimana transfer vektor pada bakteriofag dalam teknik rekayasa genetik ?
Jawaban : Menurut Klug dkk, bakteriofag lain juga digunakan sebagai vektor, dan
salah satu di antaranya adalah M13Materi genetic M13 berupa DNA unting tunggal.
Dalam hal ini jika M13 menginfeksi suatu sel bakteri, DNA unting tunggal yang
disebut sebagai RF (Replication Form). Susunan dari molekul RF terdiri dari suatu
unting tunggal (+) yang mengandung satu unting segmen DNA yang diinsersikan.
Klon DNA unting tunggal yang di hasilkan oleh M 13 dapat digunakan untuk
pengurutan DNA atau sebagai templet untuk perubahan urut-urutan klon akibat
mutasi.