MENGENAL ALAT-ALAT

MIKROBIOLOGI

YANG

DIGUNAKAN

DALAM

PRAKTIKUM

Bahan dan Alat

A. Alat :
1.
2.
3.
4.
5.

Mikroskop
Autoclave
Inkubator
Oven
Referigerator

6. Laminar Air Flow

7. Water Bath
8. Colony Counter
9. Needle
10. Ose

Prosedur Kerja
Prosedur kali adalah mengamati alat-alat yang akan digunakan dalam labratorium
mikrobiolgi, serta dapat memahami prinsip kerja dan fungsi dari m.asing- masing alat.
HASIL PENGAMATAN
No
.
1.

Nama Alat dan Gambar

Fungsi Alat

Cara Kerja Alat

Cawan Petri

Prinsip kerjanya yaitu,

medium diletakkan di
dalam cawan petri
kemudian
ditutup
dengan menggunakan
penutup cawan

2.

Neraca Analitic

Untuk
menimbang

1 | Page

Digunakan
untuk
membiakkan
sel.

Dikalibrasi wadah
Ditimbang media

3.

Bunsen

Sebagai
sterilisasi

4.

Colony counter

Prinsip
kerjanyaa dalah
menghitung
mikroba secara
otomatis dengan
bantuan
pulpen/tombol
hitung.

2 | Page

alat Dihidupkan, kemudian

dipanaskan alat yang
akan di sterilkan.

Cara menggunakannya
adalah setelah kita onkan, kita simpan cawan
petri
yang
berisi
bakteri atau
jamur
kedalam kamar hitung,
mengatur
alat
penghitung
pada
posisi
dan
mulai
menghitung
dengan
menggunakan
jarum
penunjuk
sambil
melihat jumlah pada
layar bidang.

5.

Ph meter

`1Q

6.

Spektrofotometer

Mengukur
kerapatan
bakteri

7.
Mikroskop Binokuler

3 | Page

Ditekan tombol power.

Dikalibrasi buffer.

Dihidupkan selama 15
sel menit
Di setel transmitan
sampai angka 0,0
Dimasukkan blanko
Dikeluarkan
Dimasuk kanlarutan
Disetel absoban.

Untuk
mengamati
dengan
jelas
mikroorganisme,

Dihubungkan
kabel
power ke stop kontak.
Tekan tombol power
Dihidupkan lampu
Di letakkan preparat
pada meja benda.
Diatur focus lensa.

8.
Pipet milimeter

9.
4 | Page

Untuk
memindahkan
cairan
dalam
skala
kecil
biasanya kurang
dari 1000 l

Di atur jumlah cairan

yang akan diambil,
dengan
memutar
tombol.

Untuk

Dihubungkan

kabel

Hot Plat Strirer

10.
Ose

11.

Pipet Tetes

5 | Page

menghomogenkan larutan

power ke stop kontak

Diletakkan Erlenmeyer
yang sudah terisi bahan
yang
ingin
dihomogenkan
Di atur derajat panas
Dimasukkan
magnet
pengaduk
Di atur rotasi.

Untuk
mengambil
mikroba

Disentuhkan
pada
bagian
mikroba
kemudian
menggosokkan
pada
kaca preparat untuk
diamati atau di oles ke
media.

Untuk
mengambil
cairan
dengan
ketelitian yang
akurat

Letakkan
dahulu
larutan kedalam Beker
gelas lalu tekan S untuk
menghisap, tekan E
untuk
mengeluarkan
cairan

12.
Gelas Bekeer

13.
Laminar Air Flow

14.
Autoklaf

Untuk
Dimasukkan
mengaduk,
kedalam gelas.
mencampur,
memanaskan
cairan
serta
untuk mencegah
kontaminasi

cairan

Untuk menghin Dihubungkan

dari kontaminasi stop kontak.
media
oleh
bakteri ruangan

kabel

Untuk sterilisasi Dicek air yang ada

alat gelas
diautoklaf
Di hidupkan selama 1520 menit dengan suhu
121 C
Dimasukkan alat gelas
yang akan di sterilkan.

6 | Page

15.
Sentrifuse

16.
Refrigerator (Lemari Es)

7 | Page

Untuk
mengheterogenkan larutan.

Ditekan tombol power.

Di atur rotasi yang
diinginkan.

Untuk
menyimpan, dan
mengawetkan
media yang lebih

Dengan memasukkan
medium
secara
langsung kedalamnya,
kemudian
mengatur
suhunya sesuai dengan
ketentuan

17
Inkubator shaker

18.
Water bath

A. Pengertian Media

8 | Page

Untuk
1.Hubungkan
kabel
menginkubasi
power ke stop kontak.
sesuai suhu yang 2.Putar tombol power
diinginkan
kearah kiri (lampu
power hijau menyala).
3.Atur suhu dalam
incubator
dengan
menekan tombol set.
4.Sambil
menekan
tombol set, putarlah
tombol di sebeklah
kanan atas tombol set
hingga mencapai suhu
yang di inginkan.
5. Setelah suhu yang
diinginkan
selesai
diatur, lepaskan tombol
set.
6.Inkubator
akan
menyesuaikan setingan
suhu secara otomatis
setelah beberapa menit
Memanaskan
Ditekan tombol power.
media padat
Di atur temperature
yang di inginkan.

Media merupakan suatu campuran bahan-bahan tertentu dengan aquadest yang

dapat menimbulkan mikro organisme pada derajat keasaman dan inkubasi tertentu,
atau bahan yang di gunakan untuk memperkembangakan mikro organisme di
laboratorium secara invitro. Sebelum di gunakan media harus dalam keadaan steril,
artinya tidak di tumbuhi oleh mikroba lain yang tidak di harapkan.
Persyaratan-persyaratan agar media dapat di tumbuhi dan mikroba dapat
berkembang dengan baik yaitu :
a. Dalam media harus terkandung semua unsur hara yang di perlukan untuk
pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri.
b. Media harus mempunyai tekanan osmosa dan PH yang sesuai dengan kebutuhan
mikroba.
c. Media harus keadaan steril.
Bentuk susunan dan sifat media di tentukan oeh senyawa penyusun media,
persentase campuran dn tujuan penggunaan. Bentuk media di tentukan oleh ada
tidaknya penambahan zat pemadat seperti agar-agar, gelatin, dsb. Bentuk media di
kenal 3 jenis yaitu :
1. Media Pemadat
2. Media Cair
3. Media Semisolid
Sesuai dengan fungsi fisiologis dari masing-masing komponen yang terdapat
dalam media, maka susunan media pada jenis memiliki kesamaan isi yaitu :
-

Kandungan air
Kandungan nitrogen
Kandungan sumber air
Faktor pertumbuhan

Berdasarkan susunan pembentukan, media di bedakan menjadi :

1. Media alami yaitu media yang di susun oleh bahan-bahan alami, seperti :
kentang, tepung, daging,telur, dsb.
2. Media sintesis, yaitu media yang di susun oleh senyawa kimia, seperti : media
untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri Clostridium
3. Media semi sintesis, yaitumedia yang tersusun oleh campuran bahan-bahan
alami dan bahan-bahan sintesis
Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembngbiakan mikroba,
tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain misalnya sulasi, seleksi, evaluasi, dan
diferensiasi biakan yang di dapatkan.
Berdasarkan sifat-sifatnya, media dapat di bedakan menjadi :

9 | Page

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Media umum
Media pengaya
Media selektif
Media diferensial
Media penguji
Media perhitungan

B. Jenis-jenis Media
1. Media Umum / Media Dasar
Merupakan media pembiakan sederhana yang mengandung zat-zat yang umum
diperlukan oleh sebagian besar mikroorganisme dan dipakai juga sebagai komponen
dasar untuk membuat media biakan lainnya.
Secara rutin media ini selalu tersedia dilaboratorium, contohnya : Nutrient Broth,
Nutrient Agar, dll.
Nutrient Agar
Komposisi :
Ekstark sapi = 3 gram
Pepton = 5 gram
Agar = 15 gram
PH = 6,8
Aquadest = 1000 mL

Alat

Kertas timbang
Cawan petri
Neraca analitik
Erlen Meyer
Sendok
Gelas ukur

Kontrol Kualitas ;
a.

Kontrol Positif :

Stephylococus Echerichia coli

- Kontrol Negatif : Media yang tidak ditanami

Prosedur Kerja
-

Di timbang 20 gram Nutrient Agar, kemudian media di larutkan dengan aquadest

sebanyak 500mL dalam Erlenmeyer (Erlenmeyer di beri label).

10 | P a g e

Erlenmeyerdi beri media di tutup rapat kemudian panaskan kurang lebih 10 menit
pada suhu 50 derajat celcius.

Mdia di dinginkan kemudian media tersebut di bagi 2. Mulut erlenmeyer di sumbat

dengan kapas, di tutup dengan kertas dan ikat dengan tali.

Media di sterilkan dalam Autoclave selama 15 menit dengan suhu 121 derajat
celcius.

Erlenmeyer pertama di perkirakan suhunya 80 derajat celcius, di tambahkan darah

vena sebanyak 3 cc dengan cara di semprotkan melalui dinding Erlenmeyer.

Media di kocok (jangan sampai terbentuk busa) dan di tuang ke dalam cawan petri
sebanyak detengah dari volume cawan petri.
2. Enriched Media
Adalah perbenihan yang telah di tambahkan factor-factor pertumbuhan seperti darah,
vitamin, eksrak ragi, dsb sehingga bakteri yangsulit di tumbuhkan dapat di biak di
perbenihan ini.
Media yang termasuk dalam Enriched Media yaitu Blood Agar dan Coklat Agar.
Blood Agar
Media ini di gunakan untuk menumbuhkan mikro organisme yang sulit untuk dibiakan
dan juga untuk di membedakan kelompok mikro organisme yang melisis atau tidak
melisiskan butir darah merah.
Agar darah terdiri dari bahan dasar yang mengandung 5% darah domba. Lisis butir
darah merah terlihat sebagai wiayah jernih di sekitar koloni. Bila proses lisis sempurna
akan terlihat di wilayah yang benar-benar jernih dan jenis hemalisisnya di sebut beta
hemolisis. Bila proses lisis tidak sempurna dan media berwarna kehijauan maka jenis
hemolisisnya di sebut Alpha Hemolisis. Bakteri yang tidak mampu melisiskan butir
darah dan tidak menyebabkan perubahan nyata pada media tersebut di sebut gamma
hemolisi. Kelompok mikro organisme yang sering di bedakan berdasarkan kemampuan
melisiskan butir darah merah adalah sreptococcus dan staphylococcus, proses hemolisis
di sebabkanoleh enzim yang di lepas mikro organisme.
Komposisi :

Heart extract = 10 gram

11 | P a g e

Tryphtose = 10 gram

Nacl = 5 gram

Agar-agar = 15 gram

PH = 6,9

Aquadest
Alat ;

Kertas timbang

- Cawan petri

Neraca analitik

- Erlen Meyer

Sendok

- Gelas ukur

Alat ;
-

Timbangan analitik

Gelas ukur

Erlen Meyer

Sendok Reagen

Autoclave
Petridich

Alat Pemanas

Prosedur Kerja
-

Larutkan 40 gram bahan tersebut dengan 1 liter aquadest

Sterilkan dengan menggunakan autoclave 115 derajat celcius selama 25 menit

Setelah di sterilkan, dinginkan pada suhu 50derajat celcius kemudian tambahkan 48% darah domba, aduk rata

Tuang dalam petridich steril kurang lebih 200

cc secara aseptis. Hindari gelembung udara dan simpan dalam lemari es.
Kontrol Kwalitas ;

12 | P a g e

- Kontrol Positif :

Streptococcus pyogenes

Sterptococcuc Pneumoniae
- Kontrol Negatif : Media yang tidak ditanami
Coklat Agar
Kegunaannya adalah untuk menumbuhkan bakteri yang sulit tumbuh pada perbenihan
sederhana dan biasanya di pakai untuk menumbuhkan golongan Neisseriae dan
Hemorhylus influenza. Prosedur kerjanya sama dengan pembuatan Blood Agar, hanya
setelah penambahan darah, di panaskan kembali sampai 80-90% selama 5-15 menit
sampai berwarna coklat. Semua ini di kerjakan dalam water bath.
Bahan dari coklat agar sama dengan bahan pada media Blood Agar. Mengapa medianya
berwarna coklat ? hal tersebut di sebabkan oleh suhu yang lebih sehingga kepanasan
dan media berwarna coklat. Mengapa media ini kecoklatan ? hal tersebut di karenakan
bakteri N. Conarhoe dan Haemophylus suka di coklat agar.
3. Media Selektif
Pada perbenihan ini, hanya bakteri tertentu yang bisa tumbuh dengan baik, sedangakan
bakteri lainnya dapat terhambat pertumbuhannya karena telah di tambahkan zat atau
bahan tertentu yang bersifat menghambat.
Media yang termasuk dalam selektif media yaitu Taurocholate Citrate Broom Thymul,
Blue Suchrose Salt Agar (TCBS), Mac Conkey (MC), Salmonella Shigella Agar (SSA),
Endo Agar (EA).
Taurocholate Citrate Broom Thymul, Blue Suchrose Salt Agar (TCBS)
(TCBS) adalah media selektif untuk Vibrio Cholera.
Komposisi :
- Yeast extract = 5 gram
- Bacteriological Peptone = 10 gram
- Sodium thiosulphate = 10 gram
- Sodium Citrate = 10 gram

13 | P a g e

- Ox bile = 8 gram
- Sucrose = 20 gram
- Sodium Chloride = 10 gram
- Broom Thymol Blue = 0,04 gram
-Thymol Blue = 0,04 gram
- Agar = 14 gram
- Aquadest = 1000mL
- PH = 8,6
Alat ;
Timbangan analitik
Erlen Meyer

- Gelas ukur
- Sendok reagen

Alat Pemanas
Prosedur Kerja
-

Ditimbang 88 gram dehydrate medium kemudian masukkan ke dalam erlenmeyer

dan larutkan 1000mL aquadest.

Bila belum larut panaskan di atas nyala api sampai suhunya 45-50 derajat celcius.

Jangan menggunakan autoclave, kemudian tuangkan pada petridisk.

Medium TCBS Oxid sempurna dan tidak membutuhkan bahan tambahan atau tambahan
darah steril, dan media ini lebih menguntungkan dari media lanryl sulphate tellurite agar
yang membutuhkan tambahan lebih lanjut setelah pensterilisasian penampakan koloni
dari organisme. Pada media TCBS setelah 24 jam inkubasi pada suhu 35 derajat celcius.
Bakteri Koloni
Vibrio parahaemolyticus kuning, tipis

14 | P a g e

Vibrio Alginiliticus biru, kekuning-kuningan

Vibrio Metchnicovin kuning(3,5mm)
Vibrio Flufialis kuning (3,4mm)
Vibrio Vulnivicus biru, kehijauan (2,3mm)
Vibrio mimicus biru, kehijauan (1mm)
Jenis Entrococcus
Jenis proteus kuning, kehijauan (1mm)
Jenis Pseudomonas biru, kehijauan (1mm)
Kontrol Kwalitas ;
- Kontrol Positif :

Vibrio Colera

- Kontrol Negatif :

Escheristia coli di hambat pertumbuhannya

Mac Conkey Agar (MCA),

Pembenihan ini bersifat selektif untuk hasil gram negative baik Enterobacteriateae
maupun yang non fermented basilgram negative, sedangakn bakteri lainnya umumnya
tidak tumbuh / tumbuh dengan tidak subur.
Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garam empedu dan nerah netral.
Media ini menghambat pertumbuhan bakteri garam poditif yang di sebabkan oleh garam
empedu dan kristal violet, bakteri gram negatif yang tumbuh di bedakan dalam
kemampuannya memfermentasekan aktosa.
Koloni dari bakteri yang memfermentasekan laktosa berwarna merah bata dan di
kelilingi oleh endapan garam empedu. Endapan ini di sebabkan oleh enguraian laktosa
menjadi asam yamg bereaksi dengan garam empedu.
Bakteri yang tidak memfermentasekan laktosa biasanya bersifat pathogen. Golongan
bakteri ini tidakmemperlihatkan perubahan pada media. Warna koloni di lihat pada
bagian koloni terpisah.
Komposisi :

15 | P a g e

Peptone Yeast extract = 17 gram

Protease Pepton

Lactosa
0,001gram

= 3 gram

Agar = 13,5 gram

-

= 10 gram

Netral Red = 0,03 gram

-

Crystal Violet =

Bile salt no 3

= 1,5 gram

Aquadest = 1000ml

Sodium Cloride

= 5 gram

PH = + 7,4

Alat ;
-

Erlen Meyer

Sendok tanduk

- Gelas ukur

Tabung Reaksi

- Tabung Durham

Beaker Gelas

- Botol semprot

Prosedur Kerja
-

Timbang bahan tersebut di atas, masukkan dalam beaker gelas 50 mL dan larutkan
dengan aquadest dan masukkan dalam Erlen meyer.

Homogenkan dengan cara di panaskan di dalam pemanas selama 15 menit,

kemudian mulut Erlenmeyer di sumbat dengan menggunakan kapas, yang dilapisi
kertas, kemudian sumbatan tersebut di tutup kembali dengan menggunakan kertas, lalu
di ikat.

Sterilkan media tersebut di dalam autoclave pada suhu 121 derajat celcius selama 15
menit

Dinginkan dengan tuangkan ke dalam petridish dan simpan dalam lemari es.
Media dalam MCA ini mempunyai keistimewaan memilih bakteri enteric gram negative
yang memfrementasekan laktosa, karena media ini mengandung laktosa, crystal violet
dan netral rerbile salt. Kemampuan Ecoli memfregmentasekan laktosa menyebabkan
penurunan PH, sehingga mempermudah absorbsi netral red untuk mengubah koloni
menjadi merah bata.

16 | P a g e

Mikroba lain yang dapat tumbuh pada media ini antara lain : Enterobacter, proteus,
salmonella, shigella, aerobacter, enterococcus.
Endo Agar
Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, Na-s\ulfat dan fiksin-busa. Sifat
pertumbuhan koloni pada EA adalah :
1. Bakteri yang tidak memfregmentasikan laktosa
Terlihat sebagai koloni yang terang tembus, tidak berwarna dan di kelilingi oleh media
yang berwarna merah muda. Kelompok media ini menyebabkan indicator fuksin-fuksin
yang berwarna.
2. Bakteri yang memfregmentasikan laktosa
Trelihat sebagai koloni yang berwarna merah metalik dan di kelilingi oleh media yang
berwarna kemerahan. Perubahan warna media di sekeliling koloni bakteri bukan di
sebabkan oleh pengiraian asam, tetapi oleh reaksi penengahnya yaitu asetaldehida
dengan Na-dulfiat, bakteri gra positif di hambat pertumbuhannya oleh sulfiat dan
fuksin. Beberapa pertumbuhan koloni pada agar ini.
Koloni Mikro organisme
Tidak berwarna, bening lactosa-negative, salmonella, shigella
Merah dengan kilau logam lactosa-positif, E.coli
(Metallic Sheen )
Merah mudam mukoid Enteribacter, klebsiella, citrobacter
Komposisi :
-

Dipotassium phuspate = 3,5 gram

Peptic digest of animal tissuerotease = 10 gram

Agar = 15 gram

Lactosa = 10 gram

17 | P a g e

Sodium sulfite = 2,5 gram

Basic Fuchsin = 0,5 gram

Alat :

Kertas timbang

Neraca analitik

Sendol

Cawan Petri

Erlenmeyer

Gelasukur
Prosedur Kerja

Timbang Endu Agar sebanyak 20, 75 gram

Dilarutkan dalam Erlenmayer dengan aquadest sampai 500mL, kemudian panaskan

kurang lebih 15 menit

Tuang dalam cawan Petri yang sudah di sterilkan kemudian di inkubasi selama 24
jam dengan suhu 121 derajat celcius
Salminella Shigella Agar (SSA)
Perbenihan ini mirip MCA, hanya penggunaanya lebih khusus lagi untuk basil gram
negative pathogen enteric, sehingga di pakai untuk isolasi dari specimen yinja terutama
salmonella shigella yang keduanya memperlihatkan pertumbuhan koloni yang tidak
berwarna. Sebagai bahan penghambat utama adalah garam empedu dan brilliant green
yang tidak hanya mengam,bat bakteri asam positif saja tetapi menekan pertumbuhan
basil pathogen non enteric lainnya.
Komposisi:

Ekstark sapi = 5 gram - Proteose peptone = 5 gram

Laktosa = 10 gram - Garam bile no.3 = 8,5 gram

18 | P a g e

Natrium sitart = 8,5 gram - Ferrik sitrat = 1 gram

Agar = 13,5 gram Merah netral = 0,025 gram

Hijau brilliant = 0,33 gram - Aquadest = 1000mL

PH
Alat :

Tabung reaksi

Petridisk

Sendok tanduk

Autoclave

Erlenmeyer

Gelas ukur

Timbangan analitik
Prosedur Kerja

Timbang bahan tersebut, kemudian masukkan dalam beaker glass 50 ml dan larutkan
dengan aquadest, lalu masukkan ke dalam Erlenmeyer
Homogenkan dengan cara di panaskan diatas pemabas selama 15 menit
Sterilkan media tersebut di dalam autoclave pada suhu 121 derajat celcius selama 15
menit
Diingimgan dan tuang ke dalam petridish dan simpan dalam lemari es
Kontrol Kwalitas
- Kontrol Positif : Salmpnella typhimurium
Salmonella enteridis
- Kontrol Negative : Enterococcus raecallis
19 | P a g e

Manitol Salt Agar (MSA)

Persenyawaan utama dalam media ini adalah NaCL 7,5 %, mannitol, dan merah fenol.
Media ini terutama di gunakan untuk membedakan staphylococcus yang bersifat
pathogen dan yang tidak pathogen.
Media ini mengandung kadar NaCL tinggi, sehingga akan menghambat pertumbuhan
bakteri, namun staphylococcus tidak di hambat pertumbuhannya. Staphylococcus aureus
akan membentuk zona kuning. Sedangak S. epidermis akan membentuk zona merah.
Warna kuning di sebsbkan oleh fermentasi mannitol disertai permukaan asam,
sedangkan warna merahdi sebabkan oleh mennitol yang tidak di frementsikan. Merah
fenol merupakan indicator untuk melihat adanya pembentukan asam.
Pada umumnya S. Aureus bersifat pathogen,sedangkan S. Epidermis bersifat tidak
pathogen.
Komposisi:
-

Ekstark sapi = 1 gram

- Proteose peptone no.3 = 10 gram

NaCL = 75 gram

- D-Mannitol = 75 gram

Agar = 15 gram

- Merah fenol = 0,025 gram

Aquadest = 1000mL

- PH = 7,4

Alat :
-

Cawan petri

Gelas kimia

Tabung reaksi

Autoclave

Erlenmeyer

Rak tabung

Neraca analitik

20 | P a g e

Prosedur Kerja
-

Larutksn 60 gram dehydrate medium dalam 1000ml aquadest dingin.

Kocok dan panasi sampai mendidih ( jangan terlalu lama mendidih) sampai larut
sempurna
Tidak usah steril, tuang pada kotak Petri dalam beaker glass 50 ml
Medi Diferensial
Merupakan media yang mengandung zat-zat kimia tertentu untuk membedakan berbagai
tipe bakteri. Media ini berperan dalam pembentukan PH karena aktivitas mikroba dan
membedakan organisme tersebut berdasarkan perubahan PH.
Media yang termasuk dalam differential media yaitu Eosin Methylene Blue Agar
(EMBA)
Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)
Komposisi :

Pancreahc digest of gelatin = 10 gram

Jaciose = 10 gram

Dipottasium Phuspate = 2 gram

Eosin = 0,4 gram

Methylem blue = 0,065 gram

Agar = 15,0 gram

Aquadest = 1000ml
Alat :

Cawan petri

Batang pengaduk

21 | P a g e

Tabung reaksi

Tabung durham

Botol semprot

Autoclave

Erlenmeyer

Rak tabung

Timbangan analitik

Sendok tanduk

Kapas

Tali
Prosedur Kerja

Ditimbang media EMBA sebanyak 18,7 gram kemudian masukkan ke dalam

Erlenmeyer.
Larutkan dengan aquadest 500ml kemudian panaskan kurang lebih 15 menit.

Tuang dalam cawan Petri yang sudah di sterilkan kemudian di inkubasi selama 24
jam dengan suhu 121 derajat celcius.

Pada media EMBA mengandung laktosa dan pewarnaan Methylen blue yang dapt
memberikan perbedaan di antara enteric yang memfrementasikan lactosa dengan yang
tidak sama baiknay seperti identifikasi bakteri E.coli. Media EMBA menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif sehingga bakteri gram negative lebih subur. Contoh
bakteri yang tidak memfrementasikan lactosa yaitu Staphylococcus aureus. P.
aerugimnosa dan Salmonella.
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 8

MODUL

3 Teknik Isolasi Bakteri

POKOK BAHASAN :
1. Pengenceran Suspensi Bakteri dari Sumber Isolat/Lingkungan
2. Teknik Isolasi Bakteri (Solid and Liquid Medium)
22 | P a g e

TUJUAN PRAKTIKUM :
1. Memahami persiapan dan pelaksanaan pengenceran suspensi
bakteri sebelum melakukan
kegiatan isolasi bakteri;
2. Mengenal dan memahami teknik-teknik Isolasi Bakteri(Solid and
Liquid Medium).
TINJAUAN PUSTAKA :
1. TEKNIK PENGENCERAN SUSPENSI BAKTERI
Pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari
lingkungan dilakukan sebagai
upaya untuk mendapatkan kuantitas bakteri dalam jumlah yang
dapat terhitung. Seperti yang
telah diketahui bahwa dalam sampel lingkungan komunitas bakteri
berada dalam kuantitas yang
sangat melimpah. Selain mendapatkan kuantitas yang dapat
terhitung, pengenceran suspensi
bakteri dari sampel/ sumber isolat dari alam juga diperlukan dalam
rangka memudahkan dalam
pengamatan koloni, terutama dalam kegiatan bertahap pemurnian
isolat (sub-kultur). Koloni
yang tumbuh terpisah dalam kuantitas yang dapat dihitung
memudahkan peneliti untuk
memilih koloni yang akan dipisahkan (disub-kultur).
Pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari
lingkungan pada umumnya
dilakukan dengan teknik pengenceran berseri (series of dilution).
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 9
Sumber : faculty.irsc.edu

2. TEKNIK ISOLASI BAKTERI

Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolat dilakukan dengan cara
mengambil sampel
mikrobiologi dari lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut
kemudian dibiakkan
dengan menggunakan media universal atau media selektif,
tergantung tujuan yang ingin dicapai.
Jika menggunakan media universal akan diperoleh biakan mikroba
campuran. Untuk proses
identifikasi maupun isolasi jenis tertentu saja, dilakukan proses
pembuatan isolat tunggal dari
isolat campuran tersebut. Isolat tunggal atau biakan murni
merupakan biakan yang asalnya dari
pembelahan satu sel tunggal.
Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari isolat
campuran. Dua di antaranya
yang sering digunakan adalah teknik cawan gores dan teknik cawan
tuang. Prinsip dari kedua
23 | P a g e

teknik tersebut sama, yaitu mengencerkan biakan campuran hingga

setiap individu spesies dapat
dipisahkan, sehingga setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil
dari pembelahan satu sel.
a. Metode Cawan Gores Kuadran (Strike Plate)
Metode ini praktis, hemat biaya dan waktu, hanya membutuhkan
keterampilan. Hasil
penggoresan diharapkan tampak seperti gambar di bawah ini.
Gambar : Teknik Pengerjaan Pengenceran Suspensi Bakteri
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 10

Gambar : Pembagian Kuadran dalam Teknik Strike Plate

Kesalahan-kesalahan yang umum dilakukan dalam metode ini antara
lain : (1) tidak
memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga
pengenceran kurang optimal, (2)
penggunaan inokulum yang terlalau banyak sehingga menyulitkan
pemisahan sel waktu
digores.
b. Metode Cawan Tuang (Pour Plate)
Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan
untuk mendapatkan
koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah
membutuhkan waktu dan
bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan
keterampilan tinggi. Biakan
campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah
dicairkan dan
didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga
diperoleh koloni tunggal.
0
III
II
I
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 11
Gambar : Pengerjaan Isolasi Bakteri dengan Teknik Pour Plate
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 12

PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM :

1. TEKNIK PENGENCERAN SUSPENSI BAKTERI
Alat :
Mortar Keramik dan Penumbuk
Tabung Reaksi
Rak Tabung Reaksi
Pipet Volumetrik
Vortex
Busen

24 | P a g e

Autoclave
Bahan :
Sumber Isolat/ Sampel Lingkungan
NaCl Fisiologis/ Air Laut
Spiritus
Kapas
Kasa
Tissue
Plastik Tahan Panas
Karet Gelang
Kertas Label
Prosedur :
1. Masukkan NaCl Fisiologis/Air Laut ke dalam masing-masing tabung
reaksi dengan
ketentuan sebagai berikut : satu tabung pertama diisi dengan 5 mL
NaCl Fisiologis/Air
Laut dan enam tabung berikutnya masing-masing diisi dengan 4,5 mL
NaCl Fisiologis/Air
Laut;
2. Sterilisasi Seri Tabung pengenceran di atas beserta Mortar Keramik
dan Penumbuknya
serta Pipet Volumetrik ke dalam Autoclave;
3. Gerus sumber isolat/ sampel lingkungan dengan bantuan NaCl
Fisiologis/ Air laut steril
di atas Mortar Keramik steril,
4. Timbang 1 (satu) gram sampel (di atas alumunium foil), kemudian
masukkan ke dalam
tabung I, vortex sebentar agar suspense homogen;
5 mL @ 4,5 mL
I II III IV V VI VII
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 13

5. Ambil sebanyak 0,5 mL suspensi dari tabung I dengan

menggunakan Pipet Volumetrik
steril, kemudian masukkan ke dalam tabung II, vortex sebentar agar
suspense homogen;
6. Lakukan langkah No. 5 untuk tabung III, IV, V, VI, dan VII.
2. ISOLASI BAKTERI (Solid and Liquid Medium)
Alat :
Cawan Petri Steril
Erlenmeyer steril
Jarum Ose
Pipet Volumetrik
L-Glass
Bunsen
25 | P a g e

Vortex
Inkubator
Shaking Incubator
Autoclave
Bahan :
Medium Nutrient Agar (NA) [+ Bahan
tambahan] Steril
Medium Nutrient Broth (NB) [+ Bahan
tambahan] Steril
Seri Pengenceran 10 -6
Tissue
Plastik Wrap
Prosedur :
A. L-Glass Spread (Solid Medium)
1. Tuangkan Medium Nutrient Agar (NA) yang telah mencair
(dipanaskan/ dicairkan
terlebih dahulu di atas Hot Plate) sebanyak 20 mL ke dalam Cawan
Petri steril, ratakan;
2. Diamkan dan biarkan memadat di dekat bunsen;
3. Tuangkan sebanyak 100 CL suspense dari Tabung Pengenceran ke
VII ke atas Plate Agar
yang sudah padat, Ratakan dengan L-Glass di dekat Bunsen;
I II III IV V VI VII
10 0 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6
@ 0,5 mL
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 14

4. Seal Cawan Petri dengan Plastik Wrap;

5. Inkubasi dengan posisi terbalik di dalam incubator (10/25/60 0C)
selama 24 48 jam;
6. Amati dan Hitung Koloni yang tumbuh.
B. Ose-wire Strike (Solid Medium)
1. Buatlah Peta Kuadran di Balik Cawan Petri dengan menggunakan
Spidol Marker;
2. Tuangkan Medium Nutrient Agar (NA) yang telah mencair
(dipanaskan/ dicairkan
terlebih dahulu di atas Hot Plate) sebanyak 20 mL ke dalam Cawan
Petri steril, ratakan;
3. Diamkan dan biarkan memadat di dekat bunsen;
4. Dengan Jarum Ose, ambil 1 loop suspense dari Tabung
Pengenceran ke VII, goreskan ke
atas Agar Plate di daerah sektor 0;
5. Pijarkan Jarum Ose dan biarkan dingin. Goreskan Jarum Ose pada
sektor 0 disusul
gerakan ke tepi luar sektor 1 lalu kembali ke sektor 0. Lakukan bolakbalik sebanyak 3
26 | P a g e

kali. Kemudian selesaikan penggoresan di sektor I tanpa menyentuh

sektor 0 kembali
hingga seluruh permukaan sektor I penuh goresan yang tidak
bertumpang tindih.
6. Putar cawan petri hingga sektor I berada di sebelah kiri anda.
Ulangi kegiatan 5 untuk
sektor II dan III. (jangan lupa untuk memijarkan kembali Jarum ose
setiap akan berpindah
sektor).
7. Seal Cawan Petri dengan Plastik Wrap;
8. Inkubasi dengan posisi terbalik di dalam incubator (10/25/60 0C)
selama 24 48 jam;
9. Amati Koloni yang tumbuh pada jalur goresan di masing-masing
sektor.
C. Kultur Cair (Liquid Medium)
1. Ambil sebanyak 1 mL suspense bakteri dari Tabung Pengenceran ke
VII dengan
menggunakan Pipet Volumetrik steril, tuangkan ke dalam 100 mL
medium NB (Cair);
2. Goyangkan secara perlahan agar suspense bercampur;
3. Inkubasi pada incubator (10/25/60 0C) dengan shaking 150 rpm
selama 24 48 jam;
4. Amati kekeruhan medium (sebagai indicator tumbuhnya bakteri)
dan hitung densitasnya
dengan spektofotometri pada panjang gelombang 600 nm.
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 15

PARAMATER YANG DIAMATI :

1. Teknik Isolasi Bakteri : L-Glass Spread (Solid Medium)
No Sumber Isolat Inkubasi Jumlah Koloni Terhitung (cfu)
Suhu (0C) Lama Waktu

2. Teknik Isolasi Bakteri : Ose-wire Strike (Solid Medium)

No Sumber Isolat Inkubasi Jumlah Koloni Terhitung (cfu) per sektor
Suhu (0C) Lama Waktu 0 I II III

3. Kultur Cair (Liquid Medium)

No Sumber Isolat Inkubasi Absorbansi pada
3 600
Densitas
Suhu
(0C)
Lama Waktu Agitasi (rpm)

27 | P a g e