2.

Bahan dan metode

2.1. sampel
Air liur, air mani, dan sampel urin dikumpulkan dari 20 pendonor yang sehat, dan sampel air
liur dibuat dengan menjilati kertas saring. Bakteri kulit dikumpulkan dari 20 pendonor yang
sehat dengan menyeka kulit dengan kapas basah. Sampel cairan vagina dikumpulkan dari 9
pendonor sehat dengan kapas swabbing. Izin tertulis diperoleh dari semua peserta yang
memberikan sampel.
jenis bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah S. salivarius ATCC 13419, S.
mutans ATCC 35668, S. mitis ATCC 6249, S. sanguinis ATCC 10556, Bacillus subtilis
ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 35218, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Serratia
marcescens ATCC 8100, dan Staphylococcus aureus ATCC 25923. jenis tersebut dibeli dari
Microbiologics (St. Cloud, MN). Streptokokus yang dikultur di Mitis-salivarius agar (BHI,
Difco Laboratories, Detroit, MI), dan bakteri yang tersisa dikultur dalam Nutrient agar (BHI).
2.2. ekstraksi DNA
Untuk ekstraksi DNA, kami menggunakan 50 ml cairan tubuh, 5-mm x 5 mm kertas filter,
atau dalam 50 ml air. Bakteri kontrol disuspensikan dalam 50 ml air. Sampel direbus pada 98
0
C dalam tabung mikro-centrifuge. Untuk melisiskan sel bakteri, sampel diinkubasi dengan
100 ml dari 200 U / ml mutanolysin (Sigma, St. Louis, MO) dan 20 ml dari 100 mg / ml
lisozim (Sigma) pada 50 C selama 60 menit, dilanjutkan dengan pengobatan dengan 20 ml
Proteinase K (Qiagen, Tokyo, Jepang), dan 180 ml Buffer ATL (Qiagen) pada 56 8C selama
60 menit. Kami lalu menambahkan 200 ml Buffer AL (Qiagen) sebelum inkubasi pada suhu
70 0C selama 10 menit dan menambahkan 200 ml etanol. DNA dimurnikan menggunakan Kit
QIAamp Mini (Qiagen) sesuai dengan protokol produsen dan dielusi dengan 150 ml air, yang
kemudian terkonsentrasi sampai 30 ml.
2.3. kondisi PCR
Primer oligonukleotida yang digunakan dalam penelitian ini dirancang oleh Hoshino dkk. [9]
dan tercantum dalam Tabel 1. PCR dilakukan pada 20 ml campuran reaksi yang mengandung
0,5 polymerase U AmpliTaq Emas DNA (Applied Biosystems, kota Foster, CA), 0,5 mM
oligonukleotida primer, DNA Template, dan Gold STAR 10 x Buffer (Promega, Madison,
WI). PCR amplifikasi dilakukan dalam sistem GeneAmp PCR 9700 (9600 modus emulasi;
Applied Biosystems) diprogram untuk 11 menit pada 95 0C dan 35 siklus 1 menit pada 94 0C
untuk denaturasi, 1 menit pada 65 0C untuk anil, dan 1 menit di 72 0C untuk ekstensi. Kondisi
PCR yang identik diterapkan untuk kedua set primer. Produk PCR diidentifikasi oleh 2,0%
elektroforesis gel agarosa setelah pewarnaan dengan SYBR Green (Takara, Kyoto, Jepang).

2.4. Konvensional a-amilase deteksi

Metode pati-agarosa digunakan sebagai bentuk konvensional deteksi amilase. Salah satu
tablet Uji Neo-Amilase (Daiichi Kimia Murni, Tokyo, Jepang) hancur dan ditangguhkan
dalam 50 ml 1,0% larutan gel agarosa. Larutan kemudian dituangkan ke gelas dan gel dengan
pendinginan. Sebuah spesimen dipotong 5-mm x 5 mm ditempatkan pada gel dan diinkubasi
pada 37 0C. Hasil positif didefinisikan sebagai deteksi dicerna pati setelah 2 jam.

2.5. spesimen forensik

Kami menggunakan sampel berikut sebagai sampel forensik tiruan untuk menguji aplikasi
forensik metode kami; 10 dari puntung rokok, 10 kapas gauzes menyeka kulit menjilat, enam
dari noda air liur disimpan selama 6 tahun di atas kertas saring, dan noda campuran semen
dan air liur (10: 1 berdasarkan volume) pada kertas filter. Kami Juga digunakan penyeka air
liur dari 3 anjing dan satu kucing sebagai hewan umum dan memeriksa apakah S. salivarius
dan S. mutans yang terdeteksi pada hewan menggunakan metode kami. Kami berusaha untuk
mengekstrak DNA dari 2-mm x 2 mm dan 5 mm x 5 mm dari puntung rokok, dan 5-mm x 5
mm kasa, dan kertas saring.
tabel 1
Urutan primer yang digunakan dalam penelitian ini.

Gambar. 1. Sensitivitas metode PCR, diperiksa dengan menggunakan DNA kromosom

dimurnikan dari (a) salivarius S. dan (b) S. mutans. Jumlah DNA template yang digunakan di
setiap jalur adalah sebagai berikut: jalur M, 100-bp penanda massa molekul; jalur 1, 1 ng;

jalur 2, 100 pg; jalur 3, 50 pg; jalur 4, 25 pg; lane 5, 10 pg; jalur 6, 5 pg; jalur 7, 2,5 pg; lane
8,1 pg; jalur 9, 500 fg.