BAB III

METODE PENELITIAN

III.1. Subyek Penelitian

III.1.A. Populasi
Kultur cell line kanker payudara T47D.
III.1.B. Sampel
Suspensi sel-sel T47D di dalam media kultur dengan kepadatan 1,5 x 10 4
sel/100L dalam setiap sumuran (microwell plate) 96 dan diinkubasi pada suhu 37 0 C 5%
CO2 selama 24 jam di inkubator.

III.2. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif dengan metode penelitian
eksperimental murni dan rancangan penelitian yang digunakan adalah randomized post
test control group design. Kontrol positif menggunakan doksorubisin yang merupakan
obat antikanker. Sebagai kontrol negative digunakan media kultur sel.

III.3. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
1. Micropipette
2. Tabung reaksi
3. Counting chamber (improved Naubauer)
4. Cover glass

5. Mikroskop
6. Alat penghitung sel
7. Inkubator
8. microwell plate
9. Neraca timbangan
10. Sentrifugator (mixer)
11. ELISA reader
Bahan-bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
1. Larutan stok senyawa uji (7-O-karboksimetil-5-hidroksi-3,4dimetoksiisoflavon)
2. Doksorubisin (5mg dalam 1 mL media kultur RPMI)
3. Suspensi sel-sel T47D dalam media kultur dengan kepadatan 1,5 x 104 sel/100L
4. Larutan PBS (phosphate-buffered saline)
5. Tripsin
6. Media kultur
7. Minyak imersi
8. Garam tetrazolium-MTT
9. DMSO (dimetil sulfoksida)
10. SDS (natrium dodesil sulfat)

III.4. Jalan Penelitian

Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memasukkan suspensi sel MCF-7 atau T47D
dalam media kultur RPMI dengan kepadatan 1,5 x 10 4 sel/100L ke dalam masingmasing sumuran (microwell plate) 96 dan diinkubasikan pada inkubator dengan suhu 370

C 5% CO2 selama 24 jam. Selanjutnya dibuat larutan stok senyawa uji (7-hidroksi-3,4dimetoksiisoflavon) dan kontrol positif (doksorubisin) dengan melarutkan 5 mg senyawa
turunan isoflavon dalam 1 mL larutan DMSO. Larutan senyawa uji selalu dibuat baru
sebelum uji aktivitas dilakukan. Dari larutan stok senyawa uji dan doksorubisin
selanjutnya dibuat berbagai konsentrasi larutan uji mulai dari kadar 0,5; 1; 5; 10; 25; 50;
dan 100 g/mL. Sebanyak 100 L larutan senyawa uji atau doksorubisin dari masingmasing konsentrasi dimasukkan ke dalam suspensi sel dalam sumuran (microwell plate)
96 yang telah diinkubasikan selama 24 jam tersebut. Sebagai kontrol negatif
ditambahkan media kultur sebanyak 100 L ke dalam sumuran. Uji dilakukan secara
triplikat untuk setiap perlakuan dan diulang 3 kali. Kultur yang telah diberi bahan uji
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370 C dalam inkubator 5% CO2. Setelah inkubasi
selesai, media kultur dibuang dan dicuci dengan PBS dan ditambahkan 100 L larutan
MTT (1 mL MTT dalam 10 mL media kultur) ke dalam setiap sumuran dan kemudian
diinkubasikan lagi pada suhu 370 C 5% CO2 selama 4 jam. Setelah 4 jam ditambahkan
100 L stopper SDS 10% dalam HCL 0,1 N ke dalam setiap sumuran (untuk melarutkan
purple formazan). Selanjutnya dibungkus rapat dan dibiarkan dalam suhu kamar selama
24 jam, pembacaan absorbansi dilakukan dengan microplate ELISA reader pada panjang
gelombang () 595 nm.

III.5. Variabel Data

Variabel bebas adalah konsentrasi larutan senyawa 7-O-karboksimetil-5-hidroksi3,4dimetoksiisoflavon. Variabel terikat adalah absorbansi sel T47D.

III.6. Definisi Operasional Variabel

Konsentrasi larutan senyawa 7-hidroksi-3,4-dimetoksiisoflavon yang digunakan
yaitu 0,5; 1; 5; 10; 25; 50; dan 100 g/mL. Diambil dari 5 mg ekstrak yang dilarutkan
dalam 1 mL media kultur RPMI.
Aktivitas sitotoksik terhadap sel MCF-7 dan T47D yang ditunjukkan dengan nilai
IC50 yang didapat dari perhitungan analisis probit berdasarkan hubungan antara kadar
dengan penghambatan pertumbuhan sel.

III.7. Analisis Hasil

Hasil pembacaan absorbansi dilakukan dengan microplate ELISA reader pada panjang
gelombang () 595 nm. Dari hasil analisis absorbansi maka dapat dihitung persentase
penghambatan pertumbuhan sel dengan rumus:
Persentase penghambatan jumlah pertumbuhan sel =

(a-b)-(c-b) x 100%
(a-b)

Keterangan:
a = absorbansi kontrol sel
b = absorbansi kontrol media
c = absorbansi masing-masing konsentrasi senyawa uji
Aktivitas sitotoksik senyawa uji dan doksorubisin dinyatakan dengan nilai IC 50,
yaitu kadar yang mampu menghambat pertumbuhan sel hingga 50% yang dihitung
dengan analisis probit berdasarkan hubungan antara kadar dengan penghambatan
pertumbuhan sel.