BAB 4

METODE PENELITIAN

4. 1 Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental
labolatoris in-vitro dengan rancangan penelitian Post Test Only Control Group
Design.
4. 2 Sampel Penelitian dan Besar Sampel
4. 2. 1 Sampel Penelitian
Sampel yang digunakan adalah stok bakteri Enterococcus faecalis ATCC
29212 yang didapat dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan (BBLK) Surabaya.
4. 2. 2 Besar Sampel
Besar sampel minimal yang memenuhi syarat untuk dianalisa ditentukan
dengan rumus Federer, sebagai berikut:
(t 1) (n 1) 15
(7 1) (n 1) 15
6(n 1) 15
6n 6 15
6n 21
n4
Keterangan:
n

= besar sampel

= jumlah perlakuan
Berdasarkan rumus tersebut, diketahui bahwa jumlah penelitian (n) pada

masing-masing kelompok perlakuan adalah minimal 4 sampel. Dalam penelitian

24

25

ini, digunakan 5 sampel agar data lebih akurat untuk masing-masing kelompok
perlakuan.
4. 3 Variabel Penelitian
4. 3. 1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini yaitu ekstrak daun belimbing wuluh
(Averrhoa bilimbi linn) dengan konsentrasi 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, dan 25%.
4. 3. 2 Variabel Terikat
Variabel terikat penelitian ini adalah jumlah koloni bakteri Enterococcus
faecalis ATCC 29212 yang tumbuh pada media nutrient agar.
4. 3. 3 Variabel Terkontrol
a
b
c
d
e
f
g

Jenis dan asal daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi linn).

Media biakan bakteri Enterococcus faecalis.
Jumlah bakteri yang di kultur.
Suhu dan lama inkubasi.
Cara penghitungan jumlah koloni bakteri.
Cara dan pembuatan konsentrasi ekstrak daun belimbing wuluh.
Sterilisasi alat dan bahan.

4. 4 Definisi Operasional
a

Daya antibakteri adalah kemampuan untuk menghambat pertumbuhan dan

atau membunuh bakteri.

Ekstrak daun belimbing wuluh merupakan hasil ekstraksi daun belimbing

wuluh (Averrhoa bilimbi linn) yang didapatkan dengan cara mengekstraksi zat
aktif dari daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi linn) dengan menggunakan
metode maserasi dan pelarut etanol.

Bakteri Enterococcus faecalis adalah bakteri kokus gram positif berbentuk

ovoid berdiameter antara 0,5 1 m yang bersifat fakultatif anaerob.

26

KHM (Konsentrasi Hambat Minimal) merupakan konsentrasi terendah dari

bahan ekstrak daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi linn) yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis sebanyak 90% dari

jumlah rata-rata bakteri yang berhasil tumbuh pada kontrol positif.

KBM (Konsentrasi Bunuh Minimal) merupakan konsentrasi terendah dari
ekstrak daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi linn) yang dapat membunuh
99,9% bakteri Enterococcus faecalis dari jumlah rata-rata bakteri yang
berhasil tumbuh pada kontrol positif.

4. 5 Tempat dan Waktu Penelitian

4. 5. 1 Tempat Pelaksanaan
1

Pembuatan ekstrak daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi linn) dilakukan di

Badan Penelitian dan Konsultasi Industri (BPKI) Ketintang, Surabaya.

Penelitian dilakukan di laboratorium mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Airlangga.

4. 5. 2 Waktu Pelaksanaan
Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Mei Agustus 2015

4. 6 Alat dan Bahan Penelitian

4. 6. 1 Alat
Alat yang digunakan untuk penelitian ini adalah : timbangan analitik,
oven, shaker, rotary evaporator vakum, penyaring buchner, gelas ukur ,
erlenmeyer, beacker glass 100 ml, tabung reaksi, mikro pipet, pengaduk kaca,
kertas saring/whatman , autoklaf , inkubator, anaerob jar, tabung reaksi, paper

27

disk, mikro pipet, yellow tip, pinset, angka sorong, kawat ose, spreader, dan ring
(untuk tekhnik sumuran)

Gambar 4. 1. Rotary evaporator vakum (A), Anaerobic Jar (B),

inkubator (C), timbangan analitik (D).

4. 6. 2 Bahan
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah :
1.
2.
3.
4.

Ektrak daun belimbing wuluh (Averrhoa D

bilimbi linn)
Bakteri Enterococcus faecalis ATCC 29212
Media Brain Heart Infusion Broth
Media Nutrient Agar

4. 7 Prosedur Penelitian
a
b
c
d
e

Identifikasi tanaman.
Persiapan ekstrak daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi linn).
Pembuatan suspensi bakteri Enterococcus faecalis.
Pengenceran Ekstrak Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi linn)
Penentuan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dan Konsentrasi Bunuh

Minimal (KBM).
4. 7. 1 Identifikasi Tanaman
Daun belimbing wuluh yang digunakan adalah daun belimbing wuluh
yang tumbuh di daerah ketinggian 5 150 m di atas permukaan laut dan banyak
terkena sinar matahari langsung tetapi cukup lembab yaitu di Agrowisata Putri
Ndomas, Menganti, Gresik. Daun belimbing wuluh yang digunakan adalah daun
muda berumur 3-4 bulan yang pohonnya berumur sekitar 3,5 tahun.
4. 7. 2 Persiapan ekstrak daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi linn)

28

Pada penelitian ini peneliti menggunakan stok ekstrak daun belimbing

wuluh (Averrhoa bilimbi linn) yang didapatkan dari Balai Penelitian dan
Konsultasi Industri Ketintang Surabaya.
4. 7. 3 Persiapan Bakteri
Bakteri

Enterococcus

faecalis

ATCC

29212

diambil

dari

stok

menggunakan ose steril dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media
cair Brain Heart Infusion Broth. Tabung reaksi tersebut diinkubasi selama 24 jam
dengan suhu 37oC. Bakteri Enterococcus faecalis disuspensikan sampai kekeruhan
setara dengan standart 0,5 Mc Farland (1,5108 CFU/ml).
4. 7. 4 Pengenceran Ekstrak Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi linn)
Pembuatan formulasi ekstrak daun belimbing wuluh dengan berbagai
konsentrasi menggunakan metode pengenceran dengan aquades steril. Rumus
pengenceran :
C1 V1 = C2 V2
Ket :

C1 : konsentrasi awal, C2 : konsentrasi yang diinginkan

V1 : volume awal, V2 : volume yang diinginkan

Untuk konsentrasi 25% :

C1 V1 = C2 V2
100% V1 = 25% 5 ml
V1 = 1,25 ml
Berdasarkan rumus diatas, diambil 1,25 ml ekstrak daun belimbing wuluh
dengan ditambahkan 3,75 ml Brain Heart Infusion Broth (BHIB) karena volume
yang diinginkan adalah 5 ml. Demikian seterusnya hingga didapatkan konsentrasi
yang akan digunakan yaitu 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, dan 25%.

29

4.7.5 Uji Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Dan Konsentrasi Bunuh

Minimum (KBM)
Uji KHM dan KBM dilakukan dengan metode dilusi dengan langkahlangkah sebagai berikut:
1. Tabung reaksi steril disiapkan sebanyak 8 tabung, 6 tabung untuk
perlakuan dan 2 tabung untuk kontrol.
2. 6 tabung perlakuan diisi 0,05 ml suspensi bakteri ditanam dalam tabung
yang berisi BHIB dan ekstrak daun belimbing wuluh dengan berbagai
konsentrasi yaitu 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, dan 25%. Tabung reaksi
(K+) diisi dengan 0,05 ml suspensi bakteri yang telah distandartkan
dengan 0,5 Mc Farland (1,5 x 108 CFU/ml) dan media BHIB tanpa
pencampuran dengan ekstrak daun belimbing wuluh, sedangkan tabung
reaksi (K-) berisi media BHIB tanpa penambahan bakteri uji maupun
ekstrak daun belimbing wuluh untuk memastikan bahwa tidak ada
pertumbuhan bakteri pada media.
3. Seluruh tabung reaksi tersebut dinkubasi dalam inkubator secara anaerob
pada suhu 37C selama 24 jam.
4. Pembacaan hasil dari ekstrak daun belimbing wuluh terhadap pertumbuhan
bakteri Enterococcus faecalis dilakukan pengamatan jumlah koloni yang
tumbuh dengan dilakukan subkultur bakteri sebanyak 0,1 ml dari tiap
tabung serta kontrol positif pada media Nutrient Agar.
5. Penanaman pada media Nutrient Agar menggunakan metode spreader dan
diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.

30

6. Hasil yang menunjukkan penghambatan 90% pertumbuhan bakteri

Enterococcus faecalis yang dibandingkan dengan kontrol positif dijadikan
sebagai KHM, dan yang menunjukkan kematian bakteri Enterococcus
faecalis sebesari 99,9% yang dibandingkan dengan kontrol positif
dijadikan sebagai KBM.
7. Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimal
(KBM) ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh
pada media Nutrient Agar secara manual dan dinyatakan dengan CFU/ml.
Perhitungan tersebut diulang tiga kali oleh tiga pengamat yang berbeda.

4. 8 Analisis Data
Analisis yang digunakan adalah uji normalitas menggunakan tes
Kolmogorov-Smirnov untuk melihat apakah data yang didapat berdistribusi
normal dan uji homogenitas varians menggunakan tes Levene dengan > 0,05.
Dilakukan uji statistik dengan Anova satu arah.

31

4. 9 Alur Penelitian

Larutan ekstrak daun

belimbing wuluh

Stok Enterococcus faecalis

dikultur dalam media

BHIB
Pembuatan formulasi ekstrak daun
belimbing wuluh dan media tanam BHIB
pada tabung reaksi menggunakan metode
pengenceran hingga didapatkan konsentrasi

Disuspensikan setara
dengan standard 0,5 Mc
Farland (1,5 x 108
CFU/ml)

50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%,

Ditambahkan 0,05 ml suspensi bakteri Enterococcus faecalis pada tabung

formulasi ekstrak daun belimbing wuluh berbagai konsentrasi dan media
tanam BHIB serta tabung kontrol positif

Inkubasi secara anaerob pada inkubator dengan suhu 37C

selama 24 jam

Subkultur bakteri pada media Nutrient agar

Mengambil 0,1 ml dari masing-masing tabung serta kontrol

positif, kemudian ditanam pada media nutrient agar dengan
metode spreader
Inkubasi secara anaerob pada inkubator dengan suhu 37C
selama 24 jam

KHM dan KBM ditentukan dengan cara menghitung secara manual jumlah koloni bakteri
yang tumbuh pada media nutrient agar dibandingkan dengan kontrol negatif dan
dinyatakan dalam CFU/ml

Analisis Data