1

Uploaded by : Noovi S P
https://www.academia.edu/4498426/FLAVONOIDA
Airlangga, Kimia
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Indonesia adalah negara yang kaya akan berpuluh-puluh ribu tumbuhan yang
banyak dibudidayakan sebagai tumbuhan pangan, industri, tanaman obat, dan banyak
lagi lainnya. Sebagai tanaman obat, kegunaannya pun tidak terbatas dan
menghasilkan zat yang berkhasiat melalui proses biosintesis. Sebagai contoh tanin,
atsiri, alkaloid, flavonoid, dan lain-lain.
Capsicum annuum L merupakan salah satu tumbuhan biasa digunakan sebagai
sayuran yang mempunyai nilai ekonomi tinggi namun juga sangat bemanfaat dalam
kesehatan. Dalam kegunaanya sebagai tanaman obat tanaman ini mengandung
antioksidan yang berfungsi untuk menjaga tubuh dari serangan radikal bebas. Selain
itu mempunyai zat capsaicin yang berfungsi dalam mengendalikan penyakit kanker.
Bagian-bagian dari tanaman ini mengandung fosfor, vitamin A, B1, B2, C, niacin,
saponin, flavonoid, polifenol, capcasianin, dan karoten.
Flavonoid dalam bidang pengobatan banyak digunakan sebagai anti virus, anti
keradangan, diuretic, antispasmodic, dan bersifat sitotoksik. Flavonoid adalah
senyawa dengan struktur rantai karbon C6-C3-C6 merupakan pigmen yang terdapat
pada beberapa bagian tumbuhan seperti pada akar, bunga, daun, tepungsari, dan buah.
Flavonoid jarang ditemukan dalam satu golongan flavonoida, namun sebagai

campuran beberapa golongan. Hal ini menjadikan suatu masalah yang sangat menarik
bagi para peneliti. Yaitu terbukti dari adanya berates-ratus penelitian tentang
flavonoid dari banyak spesies dengan teknik isolasi dan pemisahan modern. Misalnya
M. Hamburger etal yang mengisolasi 12 glikosida flavonol dari daun Searidaca
diversifolia. Nianbai Fang, Mark Leidig, Tom J. yang mengisolasi 51 flavonoid dari
Butierrezia microcephala. Dari ulasan di atas itulah penulis tertarik untuk mengisolasi
dan mengidentifikasi senyawa flavonoid dari tanaman Capsicum annuum L. Dalam
hal ini penulis melakukan identifikasi senyawa golongan saja tidak sampai penetapan
struktur senyawa golongan flavonoid dikarenakan terbatas fasilitas dan biaya.

1.2 Rumusan Masalah

Mengingat banyak campuran senyawa golongan flavonoid, apakah dapat
dilakukan isolasi senyawa golongan flavonoid dari tanaman Capsicum annuum L.?

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :
a. Melakukan skrinning senyawa golongan flavonoid dari tanaman Capsicum
annuum L.
b. Mengisolasi senyawa golongan flavonoid dari tanaman Capsicum annuum L.
dengan metode Charaux-Paris.
c. Mengidentifikasi senyawa golongan flavonoid yang terdapat dari hasil isolasi.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan memberikan manfaat untuk pengembangan ilmu

pengetahuan dan teknologi. Penelitian tentang senyawa flavonoid pada tanaman
Capsicum annuum L. ini diharapkan dapat memberikan pustaka baru dan manfaat
bagi mahasiswa, untuk menambah wawasan dan sebagai bahan pelajaran untuk
mendeskripsikan senyawa flavonoid.

BAB II

LANDASAN TEORI

2.1 Uraian tentang Sistematika Tanaman Capsicum annuum L.

2.1.1 Sistematika tanaman

Capsicum annuum L. berasal dari Amerika tropis, tersebar mulai dari
Meksiko sampai bagian utara Amerika Selatan. Di Indonesia tanaman ini
dibudidayakan di daerah pantai sampai pegunungan. Hanya kadang-kadang jadi
liar. Buahnya digolongkan sebagai sayuran maupun bumbu. Buahnya yang pedas
popular di Indonesia sebagai penguat rasa makanan.
Klasifikasi :
Kingdom

: Plantae (tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (tumbuhan berpembuluh)

Divisi

: Spermatophyta (menghasilkan biji)

Subdivisi

: Magnoliophyta (berbunga)

Kelas

: Magnoliopsida (berkeping dua)

Subkelas

: Asteridae

Ordo

: Solanales

Famili

: Solanaceae

Genus

: Capsicum

Spesies

: Capsicum annuum L.

2.1.2 Morfologi tanaman

Batang besar licin, berkayu pada bagian pangkal, tegak, percabangan

lebar, penampang persegi, ketinggian mencapai 50 cm 150 cm, warna batang
hijau. Berdaun tunggal, bertangkai panjangnya 0,5-2,5 cm, bentuknya bulat telur
sampai elips, ujung runcing, pangkal meruncing, tepi rata, pertulangan menyirip,
bertekuk dangkal hingga dalam, panjang daun 5-12 cm lebar 1,5-4 cm, berwarna
hijau. Bunga tunggal, berbentuk bintang, berwarna putih, keluar dari ketiak daun.
Buahnya berbentuk kerucut memanjang, lurus atau bengkok, meruncing pada
bagian ujungnya, menggantung, permukaan licin mengkilap, diameter 1-2 cm,
panjang 4-17 cm, bertangkai pendek, rasanya pedas. Berwarna hijau kemudian
merah. Biji yang masih muda berwarna kuning stelah tua menjadi coklat,
berbentuk pipih, berukuran kecil, bulat, berdiameter 4 mm dan pedas.
2.1.3 Kegunaan tanaman
o Antioksidannya untuk menjaga tubuh dari serangan radikal bebas
o Lasparaginase dan capsaicin sebagai zat anti kanker
o Kandungan vitamin C yang tinggi
o Capcasianin untuk membunuh sel kanker dan beguna untuk menurunkan
berat badan
2.1.4 Kandungan kimia
Tanaman Capsicum annuum L. mempunyai kandungan kimia diantaranya
fosfor, besi, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin C, niacin, saponin,
flavonoid, polifenol, capcasianin, lasparaginase, capsaicin, dan karoten.

2.2 Tinjauan tentang Flavonoid

2.2.1 Sumber dan distribusi

Senyawa flavonoid merupakan suatu kelompok fenol yang terbesar yang

ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan
biru dan sebagai warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan.
Flavonoid adalah senyawa dengan struktur C6-C3-C6 merupakan pigmen yang
terdapat dalam beberapa bagian tumbuhan seperti bunga, tepung sari, akar, dan
daun. Flavonoid dalam bentuk glikosida ada dalam buah, bunga, dan daun.
Flavonoid bebas ada dalam jaringan kayu.
Flavonoid banyak terdapat dalam beberapa family tingkat tinggi. Sebagai
contoh ada dalam tumbuhan yaitu family monocotyledoneae (araceae, palmae)
dan dicotyledoneae (malvaceae)
2.2.2.Penggolongan flavonoid
Menurut Fong, et al., flavonoid dapat digolongkan menjadi beberapa tipe
yaitu :

Flavon

Gambar 2.1 Flavon

Flavonol

Gambar 2.2 Flavonol

Isoflavon

Gambar 2.3 Isoflavon

Katekin

Gambar 2.4 Katekin

Flavanon

Gambar 2.5 Flavanon

Leukoantosianin

Gambar 2.6 Leukoantosianin

Antosianin

Gambar 2.7 Antosianin

Auron

Gambar 2.8 Auron

Kalkon

Gambar 2.9 Kalkon

Sedangkan menurut J.B. Harborne flavonoid dibagi menjadi 10 kelas

yaitu : antosianin, leukoantosianidin, flavonol, flavon, glikoflavon, biflavonil,
kalkon dan auron, flavanon, isoflavon.

2.2.3 Teknik isolasi dan pemisahan flavonoid

1. Kromatrografi kertas
Kromatrografi kertas dapat digunakan untuk memisahkan campuran
flavonoid dari ekstrak kasar metanol atau metanol-air dari tanaman yang telah
dikeringkan dengan hasil yang cukup memuaskan. Khususnya dengan teknik
dua dimensi.
Eluen yang biasa digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air (4:1:5)
dan 5% HOAc. Kertas yang umum digunakan adalah kertas Whatman No 3M
atau 3MM untuk pemisahan pendahuluan senyawa golongan flavonoid.
Beberapa noda akan tampak apabila dilihat dengan sinar tampak. Tapi
kebanyakan noda tersebut akan tampak dengan sinar lembayung ultra, dengan
penambahan uap ammonia. Dan sinarnya lalu diamati dengan sinar
lembayung ultra.
Teknik kromatrografi kertas ini sangat digemari karena teknik yang
digunakan mudah dipelajari, hasilnya memuaskan, murah, dan lebih banyak
komponen flavonoid yang dapat diamati dengan sinar tampak, sinar
lembayung ultra, atau penampak noda lainnya.

10

2. Kromatrografi kolom
Kromatrografi kolom merupakan salah satu teknik yang berguna sekali
untuk pemurnian atau pemisahan secara preparatif dari sejumlah besar
flavonoid dari ekstrak kasar tanaman. Absorben kolom yang biasa digunakan
adalah silika gel, selulosa, dan poliamida.

3. Kromatrografi lapis tipis

Kromatrografi lapis tipis merupakan metode yang baik karena penting
untuk mengetahui dan memisahkan flavonoid dalam ekstrak kasar tanaman.
Adsorben yang biasa digunakan adalah silika gel dan selulosa.

4. Isolasi dengan metode Charaux-Paris

Pada metode ini serbuk tanaman diekstraksi menggunakan metanol.
Kemudian hasil dari ekstaksi (ekstrak) diuapkan untuk mendapatkan ekstrak
yang kental. Ekstrak eter yang kental kemudian ditambah dengan air panas
untuk mendapatkan ekstrak air encer. Ekstrak air encer inilah yang kemudian
diekstraksi cair-cair menggunakan corong pisah dengan pelarut eter. Pada saat
diekstraksi dengan ini terdapat dua lapisan yaitu lapisan air dan lapisan
organik (eter). Ekstraksi fasa air dengan eter sampai fasa eter tidak berwarna,
kemudian uapkan. Maka akan didapatkan ekstrak kering. Pada ekstrak ini
didapatkan flavonoid bebas. Fasa air yang masih ada kemudian diekstraksi
cair-cair menggunakan etil asetat sampai etil asetat tidak berwarna. Kemudian
diuapkan dan didapatkan flavonoid golongan flavon, flavanon, dan isoflavon.

11

Fasa air yang masih ada diekstraksi cair-cair lagi dengan menggunakan nbutanol pada corong pisah. Ekstraksi dilakukan sampai n-butanol tidak
berwarna. Kemudian diuapkan samapi ekstrak kering dan didapatkan
flavonoid glikosida. Metode ini sangat baik digunakan untuk mengisolasi
flavonoid dalam ekstrak kasar.

5. Hidrolisis flavonoid
Untuk mengetahui senyawa aglikon dan gula yang terdapat dalam
glikosida flavonoid, dapat dilakukan hidrolisis dengan asam atau enzim.
Hidrolisis dengan asam umumnya menggunakan asam klorida 2N, sedangkan
hidrolisis dengan enzimdapat digunakan enzim -glukosidase,-glukoronidase
antosianase.
Pada umumnya gugus gula yang sering dijumpai dalam bentuk
kombinase dengan aglikon sebagai glikosida flavonoid adalah : glukosa,
rhamnosa, dan galaktosa; sedang gugus gula yang lain adalah arabinosa,
xylosa, dan kadang-kadang dijumpai glukoronida.

6. Biosintesis senyawa flavonoid

Kerangka dasar karbon dari flavonoid di hasilkan dari kombinasi 2
jalur biosintesis utama untuk cincin aromatik yaitu jalur shikimat dan jalur
asetat malonat. Cincin A dari struktur flavonoid berasal dari jalur poliketid
yang merupakan hasil kondensasi dari satu satuan asetat dan dua residu

12

malonat. Sedang cincin B dan 3 jenis atom C pada propane berasal dari
fenilpropana yaitu dari jalur shikimat.

7. Spektrum lembayung ultra senyawa golongan flavonoid dengan metode

pergeseran panjang gelombang maksimum

Spektrum senyawa flavonoid bentuk glikosida maupun bentuk aglikon
dalam metanol p.a dan dalam metanol p.a yang ditambahkan dengan beberapa
macam pereaksi seperti Kristal NaOH, Kristal NaOAc, Kristal H3BO3, Kristal
AlCl3, dan HCl pekat banyak diteliti dan dipelajari oleh Mabry dan kawankawan.

13

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Kimia Organik dan Biokimia
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga dan penelitian dimulai pada
bulan November 2012 sampai Maret 2013
3.2 Sampel Penelitian dan Alat-alat
Bahan penelitian adalah tanaman Capsicum annuum L. meliputi batang, daun,
dan buah. Bahan diambil dari kota Blitar dilakukan pada bulan oktober 2012.
Sebelum digunakan untuk penelitian, bahan dicuci, dipotong kecil-kecil,
kemudian dikeringkan dengan bantuan sinar matahari. Setelah kering ditumbuk
sampai halus lalu diayak dengan ayakan tepung.
3.3 Bahan Penelitian
a.

b.

Untuk skrinning senyawa golongan flavonoid

Etanol 80%

Petroleum eter p.a.

Untuk isolasi senyawa golongan flavonoid

Petroleum eter p.a.

Metanol teknis 80%

Eter teknis

Etil asetat teknis

14

c.

n-butanol teknis

Untuk reaksi warna dan kromatografi lapis tipis

HCl pekat

Potongan kecil Magnesium

Oktil alkohol

Selulosa mikrokristalis Avicel (E.Merck)

Eluen BAW: n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5, lapisan atas)

Eluen forestall : asam asetat : asam klorida : air (30 : 3 : 10)

Eluen asam asetat : air (15 : 85)

Ammonia

3.4 Alat Penelitian

a.

b.

Untuk skrinning senyawa golongan flavonoid

Labu alas bulat

Refluks

Corong Buchner

Labu hisap

Gelas beker

Corong

Untuk isolasi senyawa golongan flavonoid

Soxhlet

15

c.

d.

e.

Corong pisah

Perangkat alat Vacuum evapor

Gelas beker

Corong

Untuk kromatografi lapis tipis

Pelat kromatografi dari kaca

Alat pembuat lapis tipis

Bejana kromatografi

Pipa kapiler 21

Lampu ultra violet (= 254)

Untuk spektrofotometer

Spektrofotometer lembayung ultra merk shimadzu UV 210-A

Spektrofotometer Infra Merah Perkin Elmer tipe 735-B

Untuk penentuan titik lebur

Fisher John Melting Point Apparatus

3.5 Metode Penelitian

3.5.1 Skrinning senyawa golongan flavonoid
(1) Pembuatan ekstrak
Ekstrak dibuat dengan cara mengekstraksi 10 gram bahan
serbuk kering dengan 30 ml etanol 80% dengan cara refluks selama 2
jam. Filtrat disaring dengan corong Buchner. Residu dicuci dengan

16

etanol 80% secukupnya, lalu filtrate dikumpulkan dan dipekatkan.

Setelah itu dilakukan penghilangan lemak dengan petroleum eter p.a.
filtrat yang telah bebas lemak dipekatkan kembali. Zat yang diperoleh
dilarutkan dengan etanol 80% sampai volume 20 ml, disaring, lalu
filtrat dibagi menjadi 4 bagian yang sama dalam tabung reaksi
(A,B,C,dan D)
(2) Reaksi warna
(a) Test Wilstatter
Filtrat A sebagai kontrol
Filtrat B ditambah dengan 0,5 ml HCl pekat dan 3-4 potongan
kecil Magnesium
Perubahan warna yang terjadi diamati setelah 10 menit
Lalu diencerkan dengan air suling sama banyak dan ditambah
dengan 1 ml oktil alkohol
Diamati perubahan warna yang terjadi pada kedua lapisan
tersebut
Reaksi positif bila terjadi perubahan warna

Dari jingga menjadi merah, untuk golongan flavon

Dari merah menjadi merah krimson, untuk golongan

flavonol

Dari merah krimson menjadi merah ungu, untuk warna

flavanon

17

(b) Test Bate Smith- Metcalfe

Filtrat A sebagai kontrol
Filtrat C ditambah dengan 0,5 ml HCl pekat dan diamati
perubahan warna yeng terjadi
Kemudian dipanaskan di atas penangas airselama 15 menit dan
diamati perubahan warna yang terjadi
Reaksi positif bila terbentuk warna merah yang intensif atau
timbul warna ungu
(3) Test kromatografi lapis tipis
Filtrat D sebagai sampel diaplikasikan pada fasa diam.
o Fasa diam : air pada lapis tipis selulosa mikrokristalin Avicel
(E.Merck) dengan tebal lapisan 0,25 nm
o Fasa gerak : 1) n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5,lapisan atas)
2) asam asetat : asam klorida : air (30:3:10) 3) asam asetat : air
(15:85) 4) uap ammonia lampu UV dengan = 254 nm
3.5.2 Isolasi senyawa golongan flavonoid
(1) Penghilangan lemak
Penghilangan lemak dilakukan dengan memakai Petroleum Eter p.a.
dengan mempergunakan alat soxhlet
Cara : 75 gram serbuk tanaman kering + 400 ml Petroleum Eter p.a.
diekstraksi dengan alat soxhlet selama 6 jam
(2) Uji kelarutan

18

Sebelum dilakukan ekstraksi, maka dipilih pelarut yang cocok untuk

sampel. Disediakan 4 tabung reaksi yang masing-masing berisi 0,25
gram sampel.
Tabung 1 : ditambahkan 4 ml benzene
Tabung 2 : ditambahkan 4 ml kloroform
Tabung 3 : ditambahkan 4 ml etanol teknis 80%
Tabung 4 : ditambahkan 4 ml metanol teknis 80%
Ke-empat tabung tersebut dikocok dan diamati perubahan warna yang
terjadi. Dimatai juga perubahan warna yang terjadi apabila masingmasing tabung tersebut dipanaskan dalam penangas air selama 10
menit. Dari ke-empat pelarut tadi dipilih pelarut yang dapat
menimbulkan warna merah yang paling intensif.
(3) Pembuatan ekstrak
Setelah dilakukan penghilangan lemak, dilakukan ekstraksi
dengan memakai 500 ml methanol teknis 80% dengan alat soxhlet.
Ekstraksi dihentikan bila cairan yang turun sudah tidak berwarna (9
jam). Ekstrak metanol yang didapat dipekatkan dengan rotary vacuum
evaporator sampai kental. Ekstrak kental yang diperoleh ditambah
dengan air mendidih sebanyak 100 ml, diaduk samapi homogen dan
didinginkan.
Setelah dingin dilakukan ekstraksi cair-cair dengan metode
Charaux-Paris, sebagai berikut :

19

o Pertama-tama fasa air diekstraksi cair-cair dengan pelarut eter.

Fasa eter dipisahkan dari fasa air. Kemudian fasa air
diekstraksi lagi dengan eter, demikian berulang-ulang hingga
didapatkan fasa eter yang tidak berwarna. Fasa eter yang
didapat diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kering.
o Kemudian fasa air dari hasil pemisahan tersebut diekstraksi
cair-cair dengan pelarut etil asetat. Fasa etil asetat dipisahkan
dari fasa air. Kemudian fasa air diekstraksi lagi dengan etil
asetat. Demikian berulang-ulang hingga didapatkan fasa etil
asetat yang tidak berwarna. Fasa etil asetat yang didapat
diuapkan, sehingga diperoleh ekstrak etil asetat yang kering.
o Kemudian fasa air hasil pemisahan tersebut ditambahkan lagi
dengan pelarut n-butanol, dan dilakukan ekstraksi cair-cair.
Fasa n-butanol dipisahkan dari fasa air. Kemudian fasa air
diekstraksi lagi dengan n-butanol. Demikian berulang-ulang
hingga didapatkan fasa n-butanol yang tidak berwarna. Fasa nbutanol diuapkan, hingga diperoleh ekstrak kering.
Dari ketiga fasa didapatkan masing-masing ditest kandungan
flavonoidnya dengan reaksi warna dan kromatografi lapis tipis.
3.5.3 Identifikasi senyawa golongan flavonoid dari masing-masing fasa hasil
isolasi
(1) Reaksi warna

20

(a) Test Wilstatter

Masing-masing fasa hasil isolasi yang telah dilarutkan dalam
methanol p.a. ditambah dengan 0,5 ml HCl pekat dan 3-4 potongan
kecil Magnesium. Perubahan warna yang terjadi diamati setelah 10
menit. Kemudian diencerkan dengan air suling sama banyak dan
ditambahkan 1 ml oktil alkohol.
Perubahan warna yang terjadi pada kedua lapisan tersebut diamati.
(b) Test Bate Smith-Metcalfe
Masing-masing fasa hasil isolasi dilarutkan dalam methanol p.a.
kemudian ditambahkan 0,5 ml HCl pekat. Perubahan warna yang
terjadi diamati. Kemudian dipanaskan di atas penangas air selama
15 menit dan perubahan warna yang terjadi diamati.
(2) Test kromatografi lapis tipis
Bahan

Masing-masing fasa dari hasil isolasi

Fasa diam

Air pada selulosa mikrokristalin Avicel (E.Merck) tebal lapisan

0,25 mm

Fasa gerak

N-butanol : asam asetat : air (4:1:5,lapisan atas)

Penampak noda

Uap ammonia

21

Lampu UV pada = 254 nm

Uap ammonia lalu dilihat dengan lampu UV pada = 254 nm

Test kromatografi lapis tipis ini bertujuan untuk mengetahui

pada fasa manakah terdapat senyawa golongan flavonoid.

Lapis tipis selulosa mikrokristalin dibuat dengan mencampur
15 gram serbuk selulosa dengan 90 ml air, kemudian diaduk selama
jam. Alat pembuat lapis tipis dipasang pada ketebalan 0,25 mm.
setelah itu didiamkan 1 malam, barulah lapis tipis ini siap untuk
dipakai.
Bejana elusi dijenuhkan dengan eluen n-butanol : asam asetat :
air (4:1:5, lapisan atas) selama 4 jam. Ekstrak masing-masing fasa
tersebut dilarutkan dengan sedikit methanol p.a. ditotolkan dengan
menggunakan pipa kapiler 21 pada lapis tipis selulosa mikrokristalin
tersebut. Setelah kering dielusi dalam bejana kromatografi yang telah
jenuh. Elusi dihentikan bila pelarut telah mencapai ketinggian 2/4 dari
panjang pelat yang digunakan (15cm). kemudian pelat diangkat dan
dikeringkan.
Sebagai penampak noda digunakan :
Uap ammonia
Lampu UV pada = 254 nm
Uap ammonia, kemudian segera dilihat dengan lampu UV
pada =254 nm

22

Kemudian dari masing-masing noda yang tampak dihitung harga Rf

nya.
3.5.4 Kromatografi lapis preparatif
Kromatografi lapis preparatif ini bertujuan untuk mengisolasi noda
terbesar yang muncul pada fasa etil asetat dari hasil test kromatografi lapis
tipis.
Metode kromatografi lapis preparatif ini sama dengan metode
kromatografi lapis tipis , hanya berbeda cara penotolan sampel dan tebal
lapisan penyangga fasa diamnya. Lapisan penyangga fasa diam
ketebalannya dibuat 0,5 mm. Penotolan sampel untuk kromatografi lapis
preparatif dilakukan dengan cara menotolkan ekstrak etil asetat yang
dilarutkan dengan methanol p.a. sepanjang garis secara horizontal, setelah
kering baru dielusi. Elusi dihentikan bila pelarut telah mencapai dari
panjang pelat (15cm). Pelat selulosa mikrokristalin kemudian diangkat
dan dikeringkan. Pita berwarna kuning yang terlebar yang muncul setelah
diberi penampak noda yang sama pada kromatografi lapis tipis, dikerok,
dan diekstraksi dengan pelarut methanol p.a. Filtrat yang diperoleh
kemudian diuapkan.
3.5.5 Identifikasi senyawa golongan flavonoid dari hasil kromatografi lapis
preparatif
(1) Reaksi warna
Test wilstatter

23

Kristal hasil kromatografi lapis preparatif dilarutkan dalam

methanol p.a. kemudian ditambah 0,5 ml HCl pekat dan 3-4 potongan
kecil Magnesium. Perubahan warna yang terjadi diamati setelah 10
menit, lalu diencerkan dengan air suling sama banyakdan ditambah 1
ml oktil alkohol. Perubahan yang terjadi pada kedua lapisan tersebut
diamati.

(2) Test kromatografi lapis tipis

Bahan

Kristal hasil kromatografi lapis preparatif

Fasa diam

Air pada lapis tipis selulosa mikrokristalin Avicel (E.Merck)

dengan tebal lapisan 0,25 mm
Fasa gerak

N-butanol : asam asetat : air (4:2:5, lapisan atas)

N-butanol : asam asetat : air (6:1:2)
Asam asetat : air (15:85)
Etil asetat : asam formiat : air (14:3:3)
Penampak noda

Uap ammonia
Lampu UV pada = 254 nm

24

Uap ammonia, kemudian segera dilihat dengan lampu UV pada

= 254 nm
3.5.6 Hidrolisis asam
Untuk mengetahui apakah senyawa golongan flavonoid tersebut
berada dalam bentuk aglikon atau glikosida dilakukan hidrolisis terhadap
senyawa tersebut.
Kurang lebih 2 mg zat hasil kromatografi lapis preparatif
dilarutkan dengan sedikit metanol p.a. dalam labu Erlenmeyer, kemudian
ditambahkan 5 ml HCl 2N. labu Erlenmeyer ditutup dengan corong yang
telah diberi kapas, kemudian dipanaskan di atas penangas air selama 30
menit. Kemudian ditambah dengan 5 ml air suling didinginkan dan
diekstraksi dengan 10 ml eter (5X) pada corong pisah. Fasa eter
dipisahkan dari fasa air, maka senyawa aglikon terdapat pada fasa eter,
sedangkan gulanya akan terdapat pada fasa air. Pada lapisan eter
ditambahkan Natrium sulfat anhidrat, didekantir, dan eter diuapkan sampai
kering. Residu dilarutkan dalam methanol p.a. kemudian dilakukan
identifikasi dengan spektrofotometer lembayung ultra. Pada fasa air
dilakukan uji Molisch, yaitu uji adanya gula secara umum.
(1) Identifikasi senyawa golongan flavonoid dari hasil hidrolisis
(a) Reaksi warna
Test wilstatter
Kristal yang didapat dari hasil hidrolisis dilarutkan dalam
methanol p.a. kemudian ditambah dengan 0,5 ml dan 3-4 potongan

25

kecil Magnesium. Perubahan warna yang terjadi diamati setelah 10

menit, lalu diencerkan dengan air suling sama banyak dan
ditambahkan 1 ml oktil alkohol. Kemudian diamati perubahan
warna yang terjadi pada kedua lapisan tersebut.
(b) Kromatografi lapis tipis
Bahan

Kristal hasil hidrolisis

Air pada lapis tipis selulosa mikrokristalin Avicel

(E.Merck) dengan tebal lapisan 0,25 mm

N-butanol : asam asetat : air (4:1:5, lapisan atas)

N-butanol : asam asetat : air (6:1:2)

Asam asetat : air (15:85)

Etil asetat : asam formiat : air (14:3:3)

(2) Identifikasi senyawa gula hasil hidrolisis

Uji molisch
2 mL larutan yang mengandung gula ditambah dengan dua tetes 3% naphtol dalam etanol. Lalu ditambahkan 1 ml sulfat pekat secara
perlahan-lahan melalui dinding tabung reaksi, diamati warna cincin
yang terbentuk.
3.5.7 Identifikasi senyawa golongan flavonoid dengan spektrofotometer
lembayung ultra
(1) Bahan yang digunakan

26

Kristal hasil kromatografi lapis preparatif

Kristal hasil hidrolisis

(2) Cara kerja

Langkah-langkah yang dilakukan untuk mendapatkan 6
spektrum pada metode pergeseran panjang gelombang maksimum ini
adalah sebagai berikut:

Spektrum MeOH
Sampel dilarutkan dalam methanol p.a. kemudian diamati dengan
spektrofotometer lembayung ultra pada maks 250-400 nm dan
dicatat panjang gelombang maksimum yang dihasilkan

Spektrum NaONe
Setelah penambahan Kristal NaOH padat kedalam sampel yang
telah m metanol p.a. diamati pergeseran panjang gelombang
maksimumnya bila dibandingkan hasil spectrum MeOH

Spektrum NaOAc
Setelah penambahan Kristal NaOAc kedalam sampel yang telah
dilarutkan

dalam metanol p.a diamati pergeseran panjang

gelombang maksimumnya

bila dibandingkan dengan hasil

spektrum MeOH
-

Spektrum NaOAc dan H3BO3

Spektrum diperoleh dengan cara penambahan Kristal H3BO3 ke
dalam larutan sampel dalam metanol p.a. dan Kristal NaOAc,

27

kemudian diamati pergeseran panjang gelombang maksimumnya

bila dibandingkan dengan hasil spektrum MeOH
-

Spektrum AlCl3
Setelah penambahan Kristal AlCl3 ke dalam sampel yang
dilarutkan dalam metanol p.a. diamati pergeseran panjang
gelombang maksimumnya

Spektrum AlCl3 dan HCl pekat

Larutan sampel dalam metanol p.a. dan AlCl 3 ditambah dengan
HCl pekat 2-3 tetes, kemudian diamati pergeseran panjang
gelombang maksimumnya dengan membandingkan hasil spektrum
tersebut dengan hasil spectrum MeOH dan dibandingkan pula
dengan hasil spektrum MeOH + AlCl3

Dari keenam spektrum tersebut dapat ditentukan senyawa golongan

flavonoid dan adanya gugus OH pada atom-atom C tertentu yang
terdapat pada golongan tersebut, dengan mempergunakan metode
pergeseran panjang gelombang maksimum.

3.5.8 Identifikasi senyawa golongan flavonoid dengan spektrofotometer infra

merah
Uji spektrum inframerah dilakukan dengan alat spektrofotometer infra
merah Perkin Elmer tipe 735-B. sampel dibuat pellet KBr, lalu diamati
puncak-puncak serapan gugus fungsi.

28

3.5.9 Penentuan titik leleh senyawa hasil isolasi

Untuk menentukan titik leleh senyawa hasil isolasi digunakan fisher john
melting point apparatus.

3.6 Jadwal Penelitian

3.1 Tabel jadwal rencana pelaksanaan penelitian
Kegiatan

Bulan
Desember Januari

Februari Maret

Studi pustaka
Penyediaan alat dan
bahan
Penelitian
Penulisan laporan

3.7 Anggaran Penelitian

Tabel 3.2 Tabel rencana anggaran penelitian
Anggaran
Pembelian bahan
Analisis data
Penulisan laporan
Total

Rp.
Rp.
Rp.
Rp.

Biaya (Rp)
1.250.000
750.000
500.000
2.500.000

April

29

DAFTAR PUSTAKA
Ahn, M. Y., Dec, J. E., Kim & J. M. Bollag. 2002. Treatment of 2,4-dichlorophenol
Polluted Soil with Free and Immobilzed Laccase . J. Environ. Qual , 15091515.
Alexander, M. 1994. Biodegradation and Bioremediation . Academic Press , 299-376.
Amalina, I. 2011. Pemodelan Struktur 3-Dimensi Enzim B-Xilosidase (Dizin dan
D139n ) Denga Metode Homologi dan ThreadingSerta Docking
Menggunakan Substrat P- nitrophengi xylopiranoside. Surabaya: Universitas
Airlangga .
APVMA. Consolidated Human Health Risk Assessment for Diazinon . Canberra:
Department of Health and Ageing.
Arora, D. S., & Gill, P. K. 2000. Laccase Production by Some White Rot Fungi under
Different Nutritional Conditions . J. Bioresource Technology: 73 , 283-285.
Ausec, L., Zakrzewski, A., Goesmann, A., Scluter, A., & Mulec, I. M. 2011.
Bioinformatic Analysis Reveals High Diversity of Bacterial Genes for
Laccase Like Enzymes. PlosOne , 6 (10).
Barroroh, I., & Indriawati, I. 2011. Study Berbagai Jenis Pestisida yang Beredar di
Surakarta (Toko dan Dinas). Surakarta: Universitas Sebelas Maret .
Bassett, J., Denney, R. C., Jeffery, G. H., & Mendham, J. 1991. Vogel's Text Book of
Quantitative Inorganic Analysis Including Elementary Instrumental Analysis.
London: Longman Group UK Limited.

30

Bastos, N. M. 2009. Trametes versicolor: Potential for Atrazine Bioremediation in

Calcareous Clay Soil, under Low Water Availibility Conditions. Applied
Biochem. Biotechnol , 129-134: 195-214.
Berita Resmi Statistik 2006/No.57/IX. 2006, September . Retrieved Agustus 24, 2009,
from http://www.statistik.go.id/news/update+_112006.html
Bollag, J. M. & Lamar, R. T. 1974. Microbial Transformation of Pesticides. Adv.
Appl. Environ. Microbiol. 62: 1597-1603
Boopathy, R. 2000. Factor Limiting Bioremediation Technology. Biosource.
Technol.74 , 63-67.
Bourbonnais, R., & Paice, M. G. 1990. Oxidation of non-phenolic Substrates: an
Expanded Role for Laccase in Lignin Biodegradation . FEBS Lett , 99-102.
Brandi, P., Annibale, A. D., Galii, C., Gentili, P., & Pontes, A. S. 2006. In Search for
Practical Advantages from the Immobisation of an Enzyme: the case of
Laccase. Journal of Molecular Catalysis , 62-69.
Bumpus, J. A., & Aust, S. D. 1987. Biodegradation of DDT [1,1,1-Trichloro-2,2Bis(4-Chlorophenyl)Ethane] by White Rot Fungus Phanerochete
chrysosporium. Apllied and Environmental Microbiology , 2001-2008.
Castillo, P. Z., Villalonga-Santana, M. D., Cortes, J. T., Munoz, G. R., & Pereira, S. S.
2012. Purification and Characterization of Laccase from Trametes hirsuta
Bm-2 and its Contribution to Dye and Eflluent Decolorization. African
Journal of Biotechnology , 11(15), 3603-3611.
Chakar, F. S., & Ragauskas, A. J. 1998. Biobleaching of High Lignin Content: Kraft
Pulps Via Laccase-Mediator Systems . Swedish Pulp and Ppaer Research
Institute .
Chakrabarty, A. M. 1994. Biodegradation and Detoxification of Environmental
Pollutants. New York: CRC Press.
Cox, C. 2000. Insecticide Factsheet: Diazinon Toxicology. Journal of Pesticide
Reform , 20 (2).
Daba, D., Hymete, B., Mohamed, A. M., & Bekhit, A. C. 2011. Multi Residu Analysis
of Pesticides in Wheat and Khat Collected from Different Regions of
Ethiopia. Dept. of Pharmaceutical Chemistry School of Pharmacy, Jimma
University .

31

Darmono. 2004. Toksisitas Pestisida . Jakarta : UI Press.

Depkes, & Deptan. 1996. SK Bersama Menteri Kesehatan dan Menteri Pertanian No.
711/Kepts/Tp.270/8/96 tentang Batas Maksimum Residu (BMR) pada Hasil
Pertanian. Jakarta: Depkes dan Deptan.
Desai, S. S., & Nityanand, C. 2011. Microbial Laccase and their Applications: A
Review . Asian Journal of Biotechnology , 98-124.
Dewi, G. F. 2010. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Lakase dari
Kapang. Surabaya: Universitas Airlangga .
Dharmawati, A. A. 2004. Produksi dan Pemurnian Lakase Jamur Pelapuk Putih PSM
01 pada Substrat Ekstrak Tandon Kelapa Sawit . Bogor : Institut Pertanian
Bogor .
Dietrich, D. M., & Lamar, R. T. 1990. Selective Medium for Isolating Phanerochaete
chrysosporium from Soil. Applied and Environmental Microbiology , 30883092.
Dwivedi, U. N., Singh, P., Pandey, V. P., & Kumar, A. 2011. Structure-Function
Relationship among Bacterial, Fungal, and Plant Laccases. Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic , 117-128.
EPA, U. S. 1994. Water Quality Standards Handbook. 2nd ed , EPA-823-B-94-005a,
b. Washington D.C.
EPA, U. S. 1983a. Water Quality Standards Regulation. Federal Register 48 , 5140051413.
Flowerenti, H. T. 2001. Analisis Residu Metidation dengan Metode KCKT untuk
Menentukan Tingkat Bioremediasi Pestisida Organofosfat Metidation oleh
Mikrob Indigenous. Bogor: IPB Press.
Gallo, M. A., Lawryk, N. 1991. Organik Phosphorus Pesticides dalam Handbook of
Pesticides Toxicology.
Girsang, M. S., Oginawati, K., Irsyad, M., & Poerbandono. 2008. Pemetaan
Pencemar Insektisida Organofosfat pada Tanah Daerah Pertanian sebagai
Informasi Tingkat Pencemar Insektisida di Sekitar DAS Citarum Hulu.
Bandung: ITB.

32

Grubbs, G. H. 2000. Draft Ambient Aquatic Life Quality Criteria for Diazinon.
Washington D.C.: National Health and Ecological Effects Research
Laboratories.
Gumbira, S., & A., F. M. 1996. Bioremediasi dengan Mikroorganisme . Prosiding
Pelatihan dan Lokakarya (pp. 24-28). Cibinong: LIPI/BPPT/HSF.
Hilden, K., Hakala, T. K., & Lundell, T. 2009. Thermotolerant and Thermostable
Laccases. Biotechnol Lett , 1117-1128.
Hites, R. A. 1999. Gas Chromatography Mass Spestrometry. In R. A. Hites,
Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry (pp. 609-626).
Athens: Department of Chemistry Scool of Public and Environmental Affairs
Indiana University.
Hublik, G., & Schinner, F. 2000. Characterization and Immobilization of The Laccase
from Pleurotus ostreatus and its use for the Continous Elimination of Phenolic
Pollutants . Enzyme and Microbial Technology , 330-336.
Jumbriah. 2006. Bioremediasi Tanah Tercemar Diazinon secara Ex Situ dengan
Menggunakan Kompos Limbah Media Jamur (Spent Mushroom Compost).
Bogor: IPB.
Kawai, S., Umezawa, T., Shimada, M., & Higuchi, T. 1988. Aromatic ring Cleavage
of 4,6-di(tert-butyl)guaicol, a Phenolic Lignin Model Compound, by Laccase
of Coriolus versicolor . Federation of European Biochemical Societis , 309311.
Keputusan Menteri Negara Kependudukan dan Lingkungan Hidup. KEP02/MENKLH/1988. Pedoman Penetapan Baku Mutu Lingkungan .
Koroleva, O. V., Gavrilova, V. P., Stepanova, E. V., Lebedeva, V. I., Sverdlova, N. I.,
Landesman, et al. 2002. Production of Lignin Modifying ENzymes by cocultivated White Rot Fungi Crrena maxima and Coriolus hirsutus and
Characteriztion of Laccase from Crrena maxima . Enzyme and Microbial
Technology , 573-580.
Kosa, M. 2010. Laccase BioBleaching Review. School of Chemistry and
Biochemistry Georgia Institute of Technology.
Ku, Y., J. L. Chang., S. C. Cheng. 1998. Effect of Solution pH on the Hydrolisis and
Photolysis of Diazinon in Aqueous Solution. Water, Air and Soil Pollut , 108,
445-456.

33

Kumar, V. V., Sathyaselvabala, V., Premkumar, M. P., Vidyadevi, T., & Sivanesan, S.
2012. Biochemical Characterization of Three Phase Partitioned Laccase and
its Application in Decolorization and Degradation and Degeneration of
Synthetic Dyes. Journal of Molecular Catalysis , 63-72.
Lee, S. Y., Kim, B. N., Han, J.-H., Chang, S.-T., Choi, Y. W., Kim, Y. H., et al. 2010.
Treatment of Phenol-Contaminated Soil by Corynebacterium glutamicum and
Toxicity Removal Evaluation. Journal of Hazardous Materials , 937-940.
Lehninger, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari
Principles of Biochemistry.
Leuzinger, W., & Baker, A. L. 1967. Acetylcholinesterase, I. Large-scale Purification,
Homogenity, and Amino Acid Analysis. Biochemistry , 57, 446-451.
Liu, F., Hong, M., Liu, D., & Li, Y. 2007. Biodegradation of Methyl Parathion by
Acinobacter Radioresistens USTB-04. J. Environ. Sci , 19, 1257-1260.
Mansour, M., E.A. Feicht, A. Behechti, K. Schramm & A. Kettrup. 1999.
Determination Photostability of Selected Agrochemicals in Water and Soil.
Chemosphere , 39, 575-585.
Marco, E., & Reddy, A. C. 2012. Degradation of Chloro-organic Pollutants by White
Rot Fungi. Springer-Verlag Berlin Heidelberg , 31-66.
Ngabekti, S. 1997. Pengaruh Diazinon terhadap Aktivitas Sumsum Tulang dan
Struktur Histologis Limpa Tikus . Surakarta: UNS.
Prasad, N. K., Vindal, V., Narayana, S. L., V., R., Kunal, S. P., & M., S. 2011. In
Silico Analysis of Picnoporus cinnabarinus Laccase Active Site with Toxic
Industrial Dyes. Springer-Verlag .
Prichaed. 2003. Gas Chromatography. Cambridge: Royal Society Chemistry.
Prijanto, T. B. 2009. Analisis Faktor Risiko Keracunan Pestisida Organofosfat pada
Keluarga Petani Hortikultura di Kecamatan Ngablak Kabupaten Magelang.
Semarang: Universitas Diponegoro.
Reynolds, R. C. 1986. The Lorentz-Polarization Factor and Prefered Orientation in
Oriented Clay Aggregats . Clays and Clay Minerals , 359-367.

34

Rustia, H. N., Wispriyono, B., Susanna, D., & Luthfiah, F. N. 2010. Lama Pajanan
Organofosfat terhadap Penurunan Aktivitas Enzim Kolinesterase dalam Darah
Petani Sayuran. Makara, Kesehatan , 14 (2), 95-101.
Sanagi, M. M. 1998. Teknik Pemisahan dalam Analisis Kimia . Malaysia : Universitas
Teknologi Malaysia .
Saratale, R. G., Saratale, G., Chang, J. S., & Govindwar, S. P. 2011. Bacterial
Decolorization and Degradation of Azo Dyes: A Review . Journal of the
Taiwan Institute of Chemical Engineers , 138-157.
Sigma-Aldrich. 2012, Januari 09. Retrieved Mey 30, 2012, from sigma-aldrich.com:
sigma-aldrich.com
Silverstein, R. M., Webster, F. X., & Kiemle, D. J. 2005. Spectrometric Identification
of Organic Compounds, Seventh Edition . United States of America: John
Wiley & Sons.
Singmaster, J. 1990. Old ans Nasty Pesticides. Agrichemical Age .
Srinivasan, C., D'Souza, T. M., Boominathan, K., & Reddy, C. A. 1995.
Demonstration of Laccase in the White Rot Basidiomycete Phanerochaete
chrysosporium BKM-F1767. Applied and Environmental Microbiology ,
4274-4277.
Stryer, L., Berg, J. M., & Tymoczko, J. L. 2007. Biochemistry, Sixth Edition . New
York : W.H. Freeman and Company.
Suparjo. 2008, Oktober. Degradasi Komponen Lignoselulosa oleh Kapang Pelapuk
Putih
.
Retrieved
Juni
11,
2012,
from
wordpress.com:
http://jajo66.files.wordpress.com/2008/10/degradasi-lignoselulosa.pdf
Suprapti, I. 2012. Pedoman Teknis Kajian Pestisida Terdaftar TA. 2012. Jakarta:
Direktorat Jenderal Prasarana dan Sarana Pertanian, Direktorat Pupuk dan
Pestisida, Kementrian Pertanian.
Suriadikarta, D. A., Sjamsidi, G., Mansur, D. J., & Abdurrachman. 2001. Increasing
Food Crop Productivity trough Intensive Agricultural Program in Indonesia .
Workshop on Integrated Plant Nutrient System IPNS Development an Rural
Proverty Alleviation, 18-20 September 2001. Thailand Bangkok.
Syahbirin, G., Purnama, H., & Prijono, D. 2010. Residu Pestisida pada Tiga Jenis
Buah Impor di Bogor . Bogor : IPB.

35

Tarumingkeng, R. 1992. Sifat Insektisida, Mekanisme Kerja, dan Dampak

Penggunaannya. Jakarta: Universitas Kristen Krida Wacana.
Udayasoorian, C. D. 2005. Biodegradation of Phenols by Ligninolytic Fungus
Trametes versicolor. J. Biological Sci , 824-827.
USDA. 2006. Pesticide Data Program Annual Summary. Washington D.C.: U.S. Dept
of Agriculture. Agriculture Marketing Service.
Wauchope, R. D., Butler, T. M., Hornsby, A. G., Augustin-Beckers, P. W., & Burt, J.
P. 1992. The SCS/ARS/CES Pesticide Properties Database: Select Values for
Environmental Decision Making . Reviews of Environmental Contamination
& Toxicology , 1-164.
Weihua, Q., & Hongzhang, C. 2008. An Alkali-stable ENzyme with Laccase Activity
from Entophytic Fungus and the Enzymatic Modification of Alkali Lignin.
Bioresource Technology , 5480-5484.
Widsten, P., & Kandelbauer, A. 2008. Laccase Application in the Forest Products
Industry: A review . Enzyme and Microbial Technology , 293-307.
Wong, D. W. 2009. Structure and Action Mechanism of Ligninolytic Enzymes . Appl
Biochem Biotechnol , 174-209.
Zhao, Y. C., Yi, X., Zhang, M., Liu, L., & Ma, W. J. 2010. Fundamental Study of
Degradation of Dichlorodiphenyltrichloroethane. J. Environ. Sci. Tech , 17351472.
Zulviani, R. 2005. Pengaruh Lama Inkubasi dan Jenis Sumber Nitrogen terhadap
Aktivitas Lakase dari Kapang Pelapuk Putih (White REot Fungi) pada Media
Pertumbuhan Coir Dust. Bogor : Institut Pertanian Bogor .