[2010]

1 [Type the document title]

[Rekayasa Genetika]
[KIM 451 – Modul Kuliah]
[Modul ini memuat materi perkuliahan di Jurusan Kimia FMIPA UNILA tentang
Rekayasa Genetik terutama mengenai definisi, teknik, dan hal-hal yang terkait
dengan pekerjaan DNA Rekombinan.]

by Mulyono, Ph.D
[Dosen Jurusan Kimia FMIPA UNILA :
Blog : http://blog.unila.ac.id/mulyono/]
 Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Rekayasa Genetika
By Mulyono, Ph.D.

Pretest
Sebelum anda mempelajari lebih lanjut matreri perkuliahan ini, sangat
disarankan bagi anda untuk menyegarkan kembali ingatan anda akan
beberapa hal di bawah ini :
a. Pengertian asam nukleat
b. Struktur DNA dan Kode Genetik
c. Pengertian kromosom – Gen
d. Transkripsi dan Translasi DNA ke Protein

A. PENDAHULUAN

Perkembangan ilmu pengetahuan mengenai pengkajian material biologi pewaris

keturunan pada satu abad terakhir ini berkembang dengan sangat pesat. Pengendali
sifat genetis ini (asam nukleat) di dalamnya mengandung banyak gen, yaitu suatu
bagian molekul DNA yang menyandikan suatu protein tertentu. Sejak dikeluarkanya
hukum Mendel pada tahun 1900-an, pengembangan sains yang ditujukan untuk
memahami bagaimanakah sesungguhnya gen-gen dalam kromosom/asam nukleat
suatu organisme bekerja, terus dilakukan.

Inisiasi awal bermula dari pernyataan ilmiah W. Sutton (1903) bahwa gen terletak di
dalam kromosom. Hal ini kemudian diteliti lebih lanjut oleh T.H. Morgan (1910), ng
akhirnya Morgan bersama koleganya berhasil mengembangkan teknik pemetaan gen
(gene mapping), dan pada 1922 memperoleh data analisis komprehensif posisi relatif
kurang lebih 2000 gen pada kromosom lalat buah, Drosophila melanogaster.

Studi mengenai genetika tersebut terus berlanjut, namun pendalaman hingga tingkat
molekul gen itu sendiri dan baru terkuak mulai tahun 1940-an. Hal ini bermula dari
eksperimen Avery, MacLeod, dan McCarty pada 1944, dan eksperimen Hersey dan
Chase pada tahun 1952, sejak masa itu fungsi DNA sebagai material genetik dan
konsep terbentuknya protein dari gen pada asam nukleat, menjadi semakin jelas.
Peneltian selanjutnya dilakukan oleh peneliti-peneliti seperti Chargaff, Crick, dan
Monod, memberikan kontribusi cukup besar perkembangan ilmu genetika. Pada 14
tahun antara 1952 – 1966 sturktur DNA telah berhasil dielusidasi, kode genetik pun
telah dipecahkan, dan proses transkripsi dan translasi berhasil diungkapkan. Sejak
saat itulah pengembangan ilmu Biologi Molekuler/DNA rekombinan/Rekayasa
Genetika berkembang dengan cukup pesat. Kajian ilmu tidak dapat berdiri sendiri,
namun memerlukan kajian ilmu-ilmu lain seperti biologi, mikrobiologi, kimia, biokimia,
elektro, teknik kimia dan bioproses, teknik mesin dan lain sebagainya.

Mulyono, Ph.D.
http://blog.unila.ac.id/mulyono/
 Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Definisi DNA Rekombinan / Rekayasa Genetika

Istilah yang dipakai untuk kajian molekuler pada tingkat DNA untuk memanipulasi
gen, yang umumnya dilakukan di luar proses reproduksi alamiah suatu
mikroorganisme. Hal ini meliputi isolasi, manipulasi, dan pemasukan kembali DNA
hasil rekayasa kedalam sel atau organinsme model.

Tujuan dari rekayasa genetika adalah:

(a) Untuk menghasilkan suatu protein tertentu sebagaimana yang diinginkan.
(b) Untuk mengenalkan/memasukkan suatu karakteristik baru secara fisiologi
pada organisme tertentu, misalnya : tanaman tahan hama ataupun buah yang
tahan busuk dlsb.

Beberapa contoh kegiatan yang telah berhasil dalam rekayasa genetika dan bahkan
telah dipalikasikan dalam skala indusri adalah pembuatan hormon insulin manusia
menggunakan mikroba bakteri.

B. CAKUPAN UMUM

Hal-hal yang akan dikupas dalam pengetahuan DNA Rekombinan / Rekayasa Genetika,
khususnya eksperimen kloning gen adalah sebagai berikut :
(a) Penyiapan molekul DNA kromosom yang mengandung gen yang akan
di-kloning.
(b) Pemotongan molekul DNA kromosom, untuk memperkecil ukurannya serta
analisa ukuran hasil pemotongan. Pemotongan ini diatur sedemikian hingga
fragment molekul DNA (gen) yang dikehendaki tidak terpotong.
(c) Peng-insersi-an Fragment DNA yang mengandung suatu gen yang akan diklon
ke suatu molekul DNA sirkular (disebut dengan vektor) untuk menghasilkan
suatu molekul DNA rekombinan (chimaera).
(d) Bagaimana memasukkan (insersi/transformasi) molekul DNA rekombinan
kedalam sel inang (host cell), umumnya bakteri atau sel hidup lainnya.
(e) Bagaimana menumbuhkan sel hasil transformasi pada suatu medium untuk
dapat diseleksi lebih lanjut nantinya.
(f) Bagaimana vektor dengan gen terinsersi (molekul DNA Rekombinan)
menggandakan diri menghasilkan sejumlah kopi yang sama.
(g) Bagaimana sel inang membelah diri dan tentunya dengan mengkopi juga
seluruh molekul DNA rekombinan yang ada di dalam sel-nya.
(h) Setelah sejumlah kali ulangan pembelahan, suatu koloni, atau klon dengan
kandungan molekul DNA rekombinan yang sama akan dihasilkan.
(i) Setelah itu bagaimana memilih diantara koloni-koloni sel yang tumbuh, 1 atau
lebih yang mengandung DNA rekombinan yang dimaksud.
(j) Bagaimana mendapatkan (mengisolasi) DNA rekombinan dari sel
pembawanya untuk diteliti lebih lanjut semisal ditentukan urutan DNA-nya,
dan untuk di-insersi-kan ke dalam vektor ekspresi sehingga dapat diproduksi
lebih banyak.

Mulyono, Ph.D.
http://blog.unila.ac.id/mulyono/
 Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Hal-hal pokok dalam Kloning DNA

Menurut Brown (1990) setidaknya ada 6 hal dasar yang harus difahami dan dikuasai
untuk melakukan kegiatan eksperimen kloning gen, yang meliputi :
a) Penyiapan sampel DNA kromosom murni
b) Pemotongan molekul DNA
c) Analisa ukuran fragment DNA hasil pemotongan
d) Penggabungan molekul DNA dengan vektor untuk menghasilkan molekul DNA
rekombinan
e) Pengenalan (insersi) DNA ke dalam sel host
f) Identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinan

Secara umum gambaran kegiatan kloning dapat dilihat pada cuplikan video
pembelajaran dari McGraw Hill, berikut ini :
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf

Bahan kuliah yang lain dapat di unduh pada :

http://ocw.mit.edu/OcwWeb/hs/biology/e/5/5.htm

Urgensi Kloning Gen

Alasan mengapa kloning gen sangat penting dikarenakan kloning dapat memberikan
hasil sampel murni suatu gen tertentu, yang terpisah dari keseluruhan gen-gen lain
yang umumnya mereka tergabung bersama dalam sel. Sebagai ilustrasi, seperti yang
tersaji dalam cuplikan video di atas, fragment DNA yang akan diklon dapat
merupakan bagian dari campuran berbagai fragment lain yang mengandung gen-gen
lain. Gabungan gen-gen itulah yang menyusun keseluruhan sistem molekuler
organisme tertentu.

Dalam praktiknya,

Situs untuk mengetahui data gen tertentu dapat dilihat di :

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

Mulyono, Ph.D.
http://blog.unila.ac.id/mulyono/
 Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Bab I
Pemurnian Asam Nukleat dari Sel Hidup

Ada tiga jenis asam nukleat yang umumnya harus disiapkan sebelum kegiatan Kloning
Gen. Pertama adalah total DNA (DNA Kromosom) yang umumnya adalah sumber
gen yang akan diklon. DNA kromosom ini umumnya dipilih dari mikroba yang telah
diketahui memiliki suatu enzim dengn keunggulan tertentu dan telah diketahui
karakteristik biokimia-nya. DNA kromosom dapat berasal dari bakteri, tanaman, sel
hewan, atau organisme apa saja.

Kedua, adalah DNA plasmid (pembahasan lebih lanjut pada Bab II). Molekul DNA
plasmid merupakan DNA lingkar, dengan ukuran yang kecil, umumnya dengan
keunggulan khusus untuk proses kloning, yang digunakan sebagai pembawa molekul
gen (vektor) kedalam sel inang. Ukuran DNA plasmid ini lebih kecil dibandingkan
dengan DNA phage, dengan kemampuan membawa molekul gen yang lebih kecil
tentunya. Ketiga, adalah DNA phage, dengan fungsi sama sebagaimana DNA plasmid
sebagai vektor pembawa gen kedalam sel inang. Molekul DNA ini umumnya disiapkan
dari bakteriofaga. Ukuran dan kemampuan membawa molekul gen juga lebih besar.
Pada modul ini, isolasi asam nukleat hanya akan difokuskan pada DNA kromosom dan
DNA plasmid saja.

Penyiapan DNA Kromosom

Dasar-dasar penyiapan molekul DNA kromosom adalah sebagaimana yang telah

dibahas dalam matakuliah Teknik Penelitian Biokimia. Ada beberapa tahapan umum
dalam isolasi DNA kromosom, untuk kasus ini bakteri sebagai model. Tahapan
tersebut meliputi :
a. Teknik pemeliharaan (kultur) dan dan pemanenan sel
b. Teknik pemecahan sel
c. Teknik pemisahan DNA kromosom dari material komponen sel lainnya
d. Pemekatan DNA kromosom hasil isolasi

Mikroba (bakteri) harus ditumbuhkan pada media yang sesuai dan dipanen ketika
fase pertumbuhannya mencapai fase log. Hal ini mengingat pada usia ini sel lebih
banyak melakukan aktivitas pembelahan dan belum memanfaatkan nutrien dalam
kultur untuk penebalan dinding sel-nya. Pemanenan pada usia ini umumnya dapat
diperoleh sel dengan usian muda sehingga lebih mudah untuk dilakukan pemecahan
dinding sel-nya. Molekul DNA kromosom akan lebih mudah dikeluarkan dari sel ini
dibandingkan bila sel telah masuk fase stasioner (baca kembali Modul Kuliah Teknik
Penelitian Biokimia). Oleh sebab itu, sebelum melakukan isolasi DNA kromosom,
profil kurva pertumbuhan mikroba tersebut sangat disarankan untuk diamati terlebih
dahulu. Bagaimakah metodenya....??

Usia pemanenan sel sangat tergantung kepada jenis mikroba yang bersangkutan.
Sebagai contoh sel E. coli, dapat melakukan pembelahan sel setiap 20 menit sekali.
Pada kasus tersebut fase logaritma tercapai setelah sel mencapai kepadatan optik
(optical density / OD) sekitar 2-3 x 109 sel/ml.

Mulyono, Ph.D.
http://blog.unila.ac.id/mulyono/
 Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Tips 1:
Pertumbuhan sel dapat diamati dengan mengukur nilai optical density sel (OD sel)
pada panjang gelombang 660 nm. Nilai OD 1 berarti kultur memiliki kepadatan
sekitar 0.8 x 109 sel/ml.

Soal 1:
Berapakan kira-kira nilai OD600nm untuk pemanenan sel E.coli yang ideal...?

Penyiapan DNA kromosom dalam jumlah besar umumnya sangat diperlukan untuk
mendapatkan gen target dalam jumlah banyak. Kepertluan cara ini antara lain adalah
untuk konstruksi DNA library (pustaka genomik). Namun untuk isolasi DNA kromoson
dengan jumlah yang sedikit pun terkadang sering dilakukan untuk analisa yang
dilakukan untuk amplifikasi dengan PCR (polymerase chain reaction : baca lagi Modul
Kuliah Teknik Penelitian Biokimia), dalam hal pendeteksian secara cepat
menggunakan primer yang spesifik.

Untuk hal pertama, maka perlu sekali diperhatikan bahwa mikroba yang dikultur
harus sel tunggal (single strain). Kenapa demikian....?? karena bila DNA kromosom
yang diperoleh adalah campuran dari isolat lainnya, maka hasil yang diperoleh dalam
konstruksi library dapat membingungkan (bias), terlebih bila gen yang diperoleh
justru dari kontaminan, tujuan pemetaan gen dari mikroba yang diingikan tidak akan
tercapai. Untuk amplifikasi gen dengan metode PCR yang akan dilanjutkan dengan
proses kloning, maka kemurniaan DNA target tanpa adanya DNA kontaminan juga
sangat penting.

Sebaliknya untuk keperluan kedua (PCR), pendeteksian cara cepat, sembarang DNA
bercampur pun tidak akan menjadi masalah (tentunya untuk batas-batas tertentu).
Primer akan mengamplifikasi dan memberikan hasil yang positif hanya bila primer
tersebut cocok dengan template DNA. Misalnya untuk pendeteksian mikroba
Salmonella typhosa, penyebab penyakit tifus, maka meskipun sampel tercampur
dengan DNA manusia ataupun mikroba kontamianan lainnya, pita hasil ampifikasi
hanya akan diperoleh gen dari strain tersebut, tidak dari yang lainnya. Contoh lainnya
adalah pada ampifikasi deteksi jenis-jenis mikroba tertentu dari suatu sampel dengan
menggunakan primer PCR yang universal, pita DNA dapat diperoleh namun setiap
strain yang berbeda akan memberikan panjang fragmen yang berbeda. Pemisahan
dengan teknik DGGE memungkinkan untuk membedakan antara satu dengan yang
lainnya.

Pemecahan sel dapat dilakukan dengan setidaknya dua metode, yaitu pemecahan
secara fisika (sonifikasi, frenc press, penggerusan); atau secara enzimatik
menggunakan enzim lisozim dan Proteinase-K. Beberapa ion logam ditambahkan
selama proses pemecahan sel dengan tujuan tertentu.

Soal 2:
Apakah fungsi penambahan : larutan salin, EDTA, SDS, fenol, dan
kloroform-isoamyl-alkohol; selama proses isolasi DNA kromosom...?

Mulyono, Ph.D.
http://blog.unila.ac.id/mulyono/
 Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Setelah rangkaian kegiatan pemecahan sel selesai, maka molekul DNA kromosom
harus dipisahkan dengan penambahan pelarut dan sentrifugasi pada kecepatan tinggi.
Molekul DNA-RNA- dab protein akan terlarut pada fasa air, dan kemudian dimurnikan
lebih lanjut sebelum pemurnian menggunakan fenol. RNA-ase dan Proteinase-K
sering digunakan untuk menghilangkan kontaminasi RNA dan protein.

Soal 3:
Kenapa protein dan RNA dapat bersama-sama dengan molekul DNA serta kenapa
mesti dihilangkan...... ???

Molekul DNA yang telah murni dari RNA dan protein selanjutnya dipisahkan dari
larutan untuk mendapatkan DNA konsentrasi tinggi menggunakan metode
Pengendapan Etanol (ethanol precipitation). Pelilitan menggunakan batang pengaduk
gelas umumnya dapat memperoleh DNA yang lebih murni dibandingkan
menggunakan pengendapan menggunakan sentrifugasi. Hal ini dikarenakan rantai
pendek DNA ataupun RNA akan tetap tertinggal dalam larutan mengingat ukuran RNA
yang kecil.

DNA terlilit kemudian di-resuspensikan kembali menggunakan buffer dan ditera

konsentrasinya dengan mengambil sebagian kecil saja, dan diukur konsentrasinya
menggunakan panjang gelombang UV.

Tips 2:
Jumlah radiasi yang diserap oleh larutan DNA berbanding lurus dengan
jumlah DNA dalam sampel. Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang
UV 260 nm dan 280 nm. Nilai Absorbans 1 pada λ260nm berhubungan dengan
sampel memiliki sejumlah sebanyak 50µg/ml DNA double-heliks.

Kemurnian DNA dilakukan dengan melihat rasio A260/A280. DNA murni

memiliki nilai 1.8. Nilai lebih keci dari 1.8 menandakan kontaminasi protein
maupun phenol.

Penyiapan DNA Plasmid

Pemurnian plasmid dari kultur sel bakteri melibatkan langkah yang sama dengan
penyiapan DNA kromosom (Total DNA). Satu hal utama yang membedakan adalah
harus dipisahkannya DNA plasmid dari sejumlah besar DNA kromosom yang juga
terdapat dalam sel.

Ukuran DNA kromosom dan plasmid sangat jauh berbeda. Untuk sel E.coli misalnya,
molekul plasmid hanya berukuran 8% dari ukuran DNA kromosomnya, lebih banyak
ditemukan bahkan yang lebih kecil dari itu. Hal ini dapat menjadi dasar pemisahan
Plasmid dari DNA kromosom. Selain itu konformasi DNA plasmid menguntungkan
pada proses pemisahan dari molekul DNA kromosom. Meskipun DNA plasmid dan
DNA kromosom awalnya mempunyai konformasi yang sama yaitu sirkular, namun
selama proses penyiapan DNA kromosom dari sel ekstrak, fragmentasi dapat
menyebabkan DNA kromosom menjadi potongan linear.

Mulyono, Ph.D.
http://blog.unila.ac.id/mulyono/
 Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Mulyono, Ph.D.
http://blog.unila.ac.id/mulyono/