LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM

NAMA

: DESTIANA PURNAMA

NPM

: 260110140097

HARI,TANGGAL PRAKTIKUM

: RABU, 23 SEPTEMBER 2015

ASISTEN

: 1. BETHARY K
2. HIMMATUL ULYA

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2015

PEWARNAAN GRAM

I.

Tujuan
1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri Gram positif dan Gram
negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram.
2. Memahami setiap langkah dan reaksi reaksi kimia yang terjad dalam
prosedur tersebut.

II.

Prinsip
1. Teknik Pewarnaan Diferensial
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel
mikroba atau bagian-bagian sel mikroba (Pelczar dan Chan, 2007).
2. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram-positif
dan gram-negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri
(Karmana, Oman, 2008).
3. Zat Warna
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,
salah satu di antaranya berwarna (Volk & Wheeler, 1993).

III.

Teori Dasar
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana.
Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel
bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri
mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang
mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu
preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan
asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga
preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini

dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi
suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi
empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan
diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau
jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna
pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara
sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan
diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian
dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk
dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul (Waluyo, 2010).
Pewarnaan gram (GS) adalah teknik pewarnaan utama yang
digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis bakteri. Bakteri yang tidak
diketahui dapat diklasifikasikan menjadi Gram-positif atau Gram negatif
oleh GS, di mana kehilangan warna adalah perangkap utama, karena
beberapa bakteri gram positif mengalami kehilangan warna lebih cepat,
dan salah diidentifikasi sebagai gram negatif (Chandra and Mani, 2011).
Perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram negatif
menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua
jenis bakteri tersebut. Bakteri gram positif memiliki struktur dinding sel
dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram
negatif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi
(Fitri dan Yasmin, 2011).
Bakteri memiliki dinding sel terdiri dari peptidoglikan. Dinding sel
ini memberikan kekakuan kesel, dan perlindungan dari lisis osmotik dalam
solusi encer. Bakteri gram positif memiliki dinding sel mesh tebal, bakteri
gram negatif memiliki dinding sel tipis dan membran luar bilayer
fosfolipid (Davies et al. 1983).
IV. Alat dan Bahan
4.1 Alat
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5

Bak Pewarna
Botol Semprot
Gelas Kimia
Kaca Objek
Kapas

4.1.6 Kertas Saring

4.1.7 Mikroskop Cahaya
4.1.8 Ose
4.1.9 Pipet
4.1.10 Pembakar Spiritus

4.2 Bahan
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8

Air Fuchsin
Alkohol 70%
Alkohol 95%
Aquadest
Lugol
Minyak Emersi
Suspensi Campuran Bakteri
Zat Warna Karbol Gentian Violet (CGV)

4.3 Gambar Alat

Bak Pewarna

Botol Semprot

Gelas Kimia

Kaca Objek

Kapas

Kertas Perkamen

Mikroskop Cahaya

Ose

Pipet Tetes

Pembakar Spirtus

V. Prosedur
Pertama sediakan kaca objek steril yang terlebih dahulu direndam
dengan alkohol 70 % pada gelas kimia kemudian lap kaca objek
dengan kapas sampai kering. Dinyalakan pembakar spirtus dengan korek
api, ambil kawat ose dan lakukan fiksasi, setelah itu ambil tabung reaksi yang
berisi suspensi bakteri lalu dibuka dan ambil suspensi dengan ose, proses
ini dilakukan di dekat api. Selanjutnya oleskan suspensi pada kaca objek
selebar mungkin, beri tanda olesan dengan spidol permanen pada bawah
kaca, kemudian lewatkan kaca objek pada api sebanyak tiga kali cepat.
Kedua letakkan kaca objek pada bak pewarna, teteskan pewarna
karbol gentian violet pada olesan bakteri dan dibiarkan selama satu menit lalu
bilas kaca objek menggunakan air suling dengan cara menyemprotkannya ke
kaca objek secara perlahan. Selanjutnya teteskan lugol selama dua menit,
buang lugol yang berlebih kemudian bilas dengan air suling secara
perlahan. Kemudian kaca objek dtetesin dengan alkohol 95% 30 detik lalu
bilas dengan air suling secara perlahan. Setelah itu, kaca objek ditetesi dengan
pewarna tandlingan air fuksin selama 30 detik, kemudian bilas dengan air
suling secra perlahan dan dikeringkan dengan kertas saring dengan cara
menotolkan kertas saring perlahan pada kaca objek tanpa menghilangkan
olesan bakteri. Olesan bakteri ditetesi sedikit minyak emersi pada kaca
objek lalu amati bakteri pada mikroskop dengan perbesaran dari yang
terendah 10x sampai yang terbesar 100x kemudian hasil pengamatan
didokumentasikan.
VI. Hasil
Data Pengamatan
No.
1.

Perlakuan
Kaca

objek

dibersihkan

Hasil
dan Kaca objek sudah bersih dan

dikeringkan dengan kapas

2.

kering

Ose difiksasi dengan membakar ose Ose sudah difiksasi

diatas pembakar spirtus

3.

Ose dimasukkan ke dalam tabung Bakteri sudah menempel di kaca

reaksi berisi suspensi bakteri dan ose objek
dioleskan ke atas kaca objek agar
bakteri menempel pada kaca objek

4.

Kaca

objek

dikeringkan

dengan Kaca objek sudah kering

dilewati diatas pembakar spirtus

5.

CGV diteteskan pada kaca objek Kaca objek berwarna biru tua
dimana

bakteri

berlokasi

dan

diamkan selama 1 menit

6.

Kaca objek dibilas perlahan dengan Kaca objek bersih dan tidak ada
air suling

7.

CGV yang tersisa

Lugol diteteskan pada kaca objek Kaca objek berwarna kuning

dimana

bakteri

berlokasi

dan

didiamkan selama 2 menit

8.

Kaca objek dibilas perlahan dengan Kaca objek bersih dan tidak ada
air suling

lugol yang tersisa

Kaca objek ditetesi alkohol 95 %

Kaca objek sudah ditetesi alkohol

9.

10.

90%

Kaca objek dibilas perlahan dengan Kaca objek bersih dan tidak ada
air suling

alkohol yang tersisa

Kaca objek ditetesi fuchsin dan Kaca objek berwarna merah muda
11.
12.

didiamkan selama 30 detik

Kaca objek dibilas perlahan dengan Kaca objek bersih dan tidak ada
air suling
Kaca

13.

objek

menggunakan

fuchsin yang tersisa

dikeringkan
kertas

saring

ditetesi minyak emersi

14.

Kaca

objek

mikroskop

diletakkan
dan

dengan Kaca objek sudah kering dan sudah

dilihat

perbesaran 10, 40 dan 100

dan ditetesi minyak emersi, siap untuk

dilihat di bawah mikroskop

dibawah Bakteri
pada merah/biru

terlihat

berwarna

Gambar Mikroskop
No. Foto

Keterangan

1.

Perbesaran : 40 x
Bentuk

: Bacilli

Warna

: Merah

Pewarna

: CGV, Lugol, Fuchsin

Bakteri

: E. coli

Bacilli
Perbesaran : 10 x

2.

Bentuk

: Coccus

Warna

: Biru

Pewarna

: CGV, Lugol, Fuchsin

Bakteri

: Staphylococcus
aureus

Coccus

VII. Pembahasan
Bakteri berasal dari bahasa Latin bacterium; jamak: bacteria adalah kelompok
organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke
dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik). Hal ini
menyebabkan organisme ini sangat sulit untuk dideteksi, terutama sebelum
ditemukannya mikroskop. Barulah setelah abad ke-19 (setelah ditemukannya
mikroskop), ilmu tentang mikroorganisme terutama bakteri (bakteriologi) mulai
berkembang.
Dalam praktikum kali ini praktikan melakukan pewarnaan gram atau metode
gram pada bakteri. Pewarnaan Gram atau Metode Gram adalah suatu metode

untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni grampositif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,
yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri
dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di
dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak
permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak
terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Bakteri dibagi menjadi dua yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif. Bakteri garam positif memiliki dinding sel relatif tebal, terdiri dari
berlapis-lapis polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel
menahan lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika dicuci dengan alkohol atau
aseton. Sedangkan bakteri gram negatif memiliki dinding sel berupa lapisan tipis
peptidoglycan, yang diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri
dari lipopolysaccharide (LPS). Daerah antara peptidoglycan dan lapisan LPS
disebut periplasmic space (hanya ditemui pada Gram negatif) adalah zona berisi
cairan atau gel yang mengandung berbagai enzymes dan nutrient-carrier proteins.
Kompleks Crystal violet-iodine mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis
peptidoglycan ketika sel diperlakukan dengan pelarut. Ketika sel diberi perlakuan
pewarna tandingan Safranin O, pewarna tersebut dapat diserap oleh dinding sel
bakteri Gram negatif.

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau
multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan
ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari
50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Perbedaan dari bakteri gram negatif dan gram positif yaitu, bakteri gram
positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan
bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel kegunaannya yaitu, untuk melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel
bakteri dan memberikan sifat reaksi pewarnaan bakteri yang dapat diketahui
dengan melihat apakah termasuk negatif-gram (berwarna merah) atau positif-gram
(berwarna biru).
Kaca objek di bersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol 70 %
bertujuan agar kaca objek steril. Dalam pengerjaan pewarnaan gram ini harus
dilakukan dekat dengan pembakar spirtus agar tidak terjadi kontaminasi mikroba
lain. Kemudian dilakukan fiksasi, Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan
atau penempelan struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Selain itu fiksasi
juga berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami
lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan pada
kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan sel-sel
mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya. Tujuan
dari fiksasi adalah pelekatan bakteri supaya pada saat pencucian, bakteri tersebut
tidak ikut hilang tercuci. Fiksasi yang digunakan pada percobaan kali ini adalah
fiksasi panas, yaitu dengan cara melewatkan kaca preparat di atas api. Fiksasi
dilakukan sampai kaca preparat terasa hangat apabila ditempelkan pada punggung
tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan lama, karena bakteri
yang ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi perubahan bentuk dan
penyusutan sel.

Kristal violet yaitu zat warna yang memberikan atau menunjukkan sifat
pewarnaan negatif dengan memberikan warna ungu pada bakteri yang peka
terhadap zat warna basa.
Fungsi larutan Lugol,yaitu:
1. Meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri.
2. Untuk memperjelas zat warna.
3. Mempersulit kelarutan zat warna.
Penambahan etanol 95% ini berfungsi untuk memucatkan warna ungu kristal
pada kaca preparat yang sudah menempel pada olesan bakteri tersebut. Selain
digunakan etanol sebagai pemucat, dapat juga digunakan zat lain yang dapat
melarutkan kompleks ungu-iodium, contohnya aceton. Namun, aceton merupakan
pemucat yang bekerja paling cepat sehingga dikhawatirkan akan terjadi
pemucatan yang berlebihan. Pemucatan ini akan mengakibatkan bakteri gram
negatif kehilangan warnanya dan kembali menjadi tak berwarna, namun bakteri
gram positif tetap berwarna ungu/ biru.
Air fuchsin berfungsi untuk memberi warna kembali kepada bakteri sehingga
akan terlihat mana bakteri gram positif atau gram negatif.
Pemberiaan minyak emersi bertujuan karena cahaya yang datang dibiaskan
melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu,
dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan
medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal. Bahan yang
mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan
pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak imersi. Selain itu, minyak
imersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca.
Kemudian amati menggunakan mikroskop cahaya maka didapat dua bakteri
yaitu
bakteri gram negatif Eschericia colli dan bakteri gram positif
Staphylococcus aureus.
E. colli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2
micrometer dan diamater 0.5 micrometer. Volume sel E. colli berkisar 0.6-0.7
micrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40
derajat C, optimum pada 37 derajat. salah satu jenis spesies utama bakteri gram
negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini dapat
ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E.colli tidak berbahaya, tetapi
beberapa, seperti E.colli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan
yang serius pada manusia yaitu diare berdarah karena eksotoksin yang dihasilkan

bernama verotoksin. Toksin ini bekerja dengan cara menghilangkan satu

basa adenin dari unit 28S rRNA, sehingga menghentikan sintesis protein. Sumber
bakteri ini contohnya adalah daging yang belum masak, seperti daging hamburger
yang belum matang.
E.colli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan
memproduksi vitamin K2, atau dengan mencegah bakteri lain di dalam usus.
E.colli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan
sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk
dikembangkan. E.colli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah
dalam penanganannya.
Morfologi dari S. Aureus yaitu sel berbentuk bola, berdiameter 0,5 sampai 1,5
m, terdapat tunggal dan berpasangan dan secara khas membelah diri pada lebih
dari satu bidang, sehingga membentuk koloni yang tidak teratur. Merupakan gram
positif dengan dinding sel mengandung dua komponen utama peptidoglikan serta
asam tekoat. Tumbuh lebih cepat dalam keadaan aerobic dengan suhu optimum
350 C 400 C, berasosiasi dengan kulit, kelenjar kulit dan selaput lender hewan
berdarah panas.
Bakteri positif memiliki sifat mampu bereaksi dengan zat warna yang bersifat
asam, sedangkan bakteri negatif dapat bereaksi dengan zat warna yang bersifat
basa. Karena pada zat warna basa memberikan muatan positif dan zat warna asam
memberikan muatan negatif.
VIII. Simpulan
Dari hasil pewarnaan gram didapat hasil yaitu bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Bakteri gram positif yaitu Staphylococcus aureus
membentuk warna ungu kebiruan dan bakteri gram negatif Eschericia colli
membentuk warna merah atau merah muda.

Daftar Pustaka
Chandra, T. J and P. Subha Mani. 2011. Journal of Medical & Allied
Sciences. A study of 2 rapid tests to differentiate Gram positive
and Gram negative aerobic bacteria. 1 ( 2 ) : 84-85.
Davies, J. A., et al. 1983. Chemical Mechanism of the Gram Stain and
Synthesis of a New Electron-opaque Marker for Electron
Microscopy Which Replaces the Iodine Mordant of the Stain. J
Bacteriol. 156(2):837-845.
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.
Fitri,L. dan Yasmin, Y. 2011.Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi
Edukasi. Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri
Kitinolitik. Volume 3, Nomor 2, hal 20-25.
Karman, Oman . 2008. Biologi untuk Kelas X Sekolah Menengah Atas.
Bandung: Grafindo Media Pratama.
Pelczar, M. J., dan Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York
: Mc Graw Hill Book.
Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM.
Malang.
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.