Bahan dan metode

IPAL dan Sampling anaerobik / anoxic / aerobik (A2O) adalah proses yang paling
umum digunakan untuk pengolahan air limbah di Cina, sehingga kami
memeriksa empat IPAL A2O di Beijing. Sampel lumpur aktif yang diambil dari
tangki aerasi setiap IPAL sekali sehari selama tiga hari berturut-turut pada
musim panas 2011. Oleh karena itu, tiga sampel ulangan yang tersedia dari
masing-masing IPAL, sehingga total 12 sampel lumpur aktif. Tidak ada izin
khusus yang diperlukan untuk studi lapangan dijelaskan. Kami mengkonfirmasi
bahwa: i) lokasi tidak milik pribadi atau dilindungi dengan cara apapun; dan ii)
studi lapangan tidak melibatkan spesies langka atau dilindungi. Untuk analisis
komunitas mikroba, masing-masing sampel dibagikan ke Eppendorf tabung steril
dan disentrifugasi pada 14.000 g selama 10 menit. Setelah decanting
supernatan, pelet itu disimpan di 280uC sebelum analisis lebih lanjut. Sementara
itu, berbagai parameter kimia seperti COD, nitrogen total (TN), amonia, fosfor
total (TP), pH dan konduktivitas dianalisis menurut metode standar [23].
Konsentrasi kromium, kobalt, nikel, tembaga, seng, dan kadmium diukur oleh
induktif spektrometri massa plasma (ICP-MS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA).

DNA Pemurnian dan GeoChip Hibridisasi

DNA genomik mikroba diekstraksi dari sampel lumpur aktif dengan
menggabungkan freeze-thawing dan natrium dodesil sulfat (SDS) untuk lisis sel
seperti yang dijelaskan sebelumnya [24]. DNA mentah dimurnikan menggunakan
Wizard Genomic DNA Purification SV Kit (Promega, Madison WI, USA). Kualitas
DNA dimurnikan dinilai berdasarkan rasio 260/280 nm dan 260/230 penyerapan
nm diukur oleh ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Inc, Wilmington, DE, USA)
dan elektroforesis gel agarosa. Kuantitas masyarakat DNA ditentukan dengan
Quant-It PicoGreen kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). DNA dimurnikan (1 mg)
diberi label dengan Cy5, dimurnikan dan diresuspensi dalam 10 ml larutan
hibridisasi seperti yang dijelaskan sebelumnya (Lu et al. 2012). Kemudian itu
hibridisasi dengan GeoChip 4.2 pada stasiun MAUI hibridisasi (BioMicro, Salt Lake
City, UT, USA) pada 42uC dengan 40% formamida selama 16 jam. Setelah
hibridisasi, microarray dipindai (NimbleGen MS200, Madison, WI, USA) pada daya
laser 100%. The imagene versi 6.0 (Biodiscovery, El Segundo, CA) kemudian
digunakan untuk menentukan intensitas setiap tempat, dan mengidentifikasi
titik-titik berkualitas rendah. The GeoChip data mentah telah di-upload ke NCBI
GEO dengan jumlah aksesi GSE54055.

Analisis data
Data mentah dari imagene diserahkan ke microarray Data Manager
(http://ieg.ou.edu/microarray/) dan dianalisis menggunakan pipa analisis data
dengan langkah-langkah utama berikut: (i) Bintik-bintik ditandai sebagai 1 atau 3
oleh imagene dan dengan sinyal untuk rasio kebisingan (SNR) kurang dari 2,0
dihapus spot kualitas rendah; (ii) Setelah mengeluarkan bintik-bintik buruk,
intensitas normal dari masing-masing tempat dihitung dengan membagi
intensitas sinyal masing-masing tempat dengan intensitas rata-rata microarray;

(iii) Jika salah ulangan memiliki lebih dari dua kali standar deviasi, replikasi ini
dipindahkan sebagai outlier [18]. Analisis cluster hirarkis dilakukan dengan
menggunakan tertimbang berpasangan rata-linkage algoritma clustering dalam
perangkat lunak CLUSTER dan divisualisasikan di TREEVIEW software [25].
Analisis korespondensi kanonik (CCA) digunakan untuk menguji hubungan dari
komunitas mikroba dan variabel lingkungan. Variabel lingkungan yang signifikan
yang diidentifikasi oleh prosedur seleksi maju menggunakan Monte Carlo
permutasi ((999 permutasi dengan nilai p, 0,05) Selain itu, faktor Variance inflasi
(VIFs;. Ukuran untuk cross-korelasi variabel penjelas) diperiksa dan dihilangkan
jika VIFs lebih dari 20 [26] Berdasarkan pada parsial CCA, varians partisi analisis
(VPA) dilakukan untuk atribut variasi yang diamati dalam komunitas mikroba
untuk variabel lingkungan. CCA dan VPA dilakukan oleh paket vegan di R 2.14 0,0
(R Pembangunan Tim Inti, 2011).

Hasil
Kinerja IPAL Mikroba Struktur Fungsional pada IPAL Rincian influen dan
karakteristik limbah dan parameter operasional dari empat IPAL tercantum
dalam Tabel S1 dan S2 di File S1. Chemical oxygen demand (COD) di influents
berkisar 257-452 mg / L, sedangkan total nitrogen (TN) konsentrasi adalah
antara 46 dan 64 mg / L. Efisiensi removal COD lebih dari 90% di semua sistem,
dan efisiensi penghapusan TN bervariasi dari 68% menjadi 75%. Efisiensi
penyisihan COD dan TN menunjukkan bahwa empat IPAL yang fungsional stabil.
Struktur fungsional keseluruhan Mikroba Komunitas Struktur Fungsional
komunitas mikroba dari 12 sampel lumpur aktif dari empat IPAL dianalisis
dengan GeoChip 4,2 Sebanyak 29.124 gen fungsional yang terdeteksi. Untuk
sampel individu, jumlah gen terdeteksi adalah antara 18.847 dan 24.268 (Tabel
1). Analisis cluster hirarkis menunjukkan bahwa tiga sampel mereplikasi dari
setiap IPAL berkerumun bersama-sama, dan jarak antara tiga sampel mereplikasi
selalu, 2 (Gambar 1). Sampel dari IPAL yang berbeda dipisahkan dengan baik,
dan jarak antara empat IPAL yang generally.2. Untuk menilai-keragaman
komunitas mikroba, indeks Shannon-Weaver (H), Simpson (1 / D) dan
kemerataan dihitung (Tabel 1). Nilai-nilai H yang sangat mirip di seluruh 12
sampel, mulai 9,9-10,1. Secara konsisten, Simpson (1 / D) dan kemerataan tidak
menunjukkan perbedaan yang signifikan antara keempat tanaman.

Gambar 1. analisis cluster hirarkis gen fungsional dalam 12 sampel lumpur aktif
dari empat IPAL bernama GBD, QH, XHM dan XJH. Setiap sampel diberi nama
setelah tanaman IPAL dengan '' _1 '', '' _ 2 '', atau '' _3 '' yang menunjukkan salah
satu dari tiga sampel ulangan dari setiap tanaman. doi: 10.1371 /
journal.pone.0093422.g001 Gen tumpang tindih juga ditentukan. Sebagian besar
(65-89%) dari gen terdeteksi yang dibagi di antara sampel (Tabel 1),
menunjukkan kesamaan yang tinggi komunitas mikroba
struktur fungsional antara lumpur aktif dari empat IPAL. Dalam konsistensi
dengan hasil analisis pengelompokan hirarki, persentase gen tumpang tindih
dalam sampel dari IPAL yang sama yang lebih tinggi daripada yang dari IPAL
yang berbeda. Untuk

Misalnya, sampel GBD_1 memiliki 85% dan 89% dari gen yang sama dengan
GBD_2 sampel dan GBD_3 masing-masing, tetapi 65% kesamaan dengan QH_3.
Pada tingkat filogenetik, 87,6-88,7% gen yang berasal dari bakteri, 1,9-2,0% dari
archaea, dan 8,7-9,7% dari jamur. Proteobacteria adalah filum dominan bakteri,
yang merupakan 50,8-52,2% dari semua mikroorganisme terdeteksi.
Actinobacteria, Firmicutes, Cyanobacteria dan Bacteroidetes adalah kelompok
bakteri subdominant, masing-masing berisi 14,8-15,5%, 4,6-5,1%, 1,8-2,1% dan
1,3-1,6% mikroorganisme terdeteksi, masing-masing. Ascomycota adalah filum
yang paling melimpah dari jamur, yang merupakan 6,3-7,4% dari semua
mikroorganisme terdeteksi, diikuti oleh Basidiomycota (1,5-1,7%) sebagai
kelompok jamur kedua yang paling melimpah. Selain itu, euryarchaeota,
mengandung sekitar 1,5% dari mikroorganisme terdeteksi, adalah filum yang
paling dominan dalam archaea. (Tabel S3 di File S1). Secara bersama-sama, hasil
ini menunjukkan struktur fungsional secara keseluruhan serta keragaman
filogenetik dari komunitas mikroba dalam IPAL tampaknya cukup tinggi. Karbon
Bersepeda Gen
Karbon bersepeda, terutama degradasi karbon, adalah suatu proses biokimia
penting dalam IPAL. Laju degradasi karbon tergantung pada sejumlah faktor,
termasuk ketersediaan dan jenis substrat karbon serta komunitas mikroba [27].
Di antara gen bersepeda karbon terdeteksi, 3375 gen yang terlibat dalam
degradasi substrat karbon kompleks seperti selulosa, pati, hemiselulosa, dan
lignin kitin. Umumnya, kelimpahan relatif dan jumlah semua gen degradasi
karbon terdeteksi yang serupa di antara lumpur aktif dari empat IPAL (Gambar 2
dan Tabel S4 di File S1).

Gambar 2. intensitas sinyal dinormalisasi dari terdeteksi gen kunci yang terlibat
dalam bersepeda karbon. Intensitas sinyal untuk setiap gen fungsional adalah
rata-rata intensitas sinyal dari semua ulangan. Semua data yang disajikan
sebagai rata-rata 6 SE. doi: 10.1371 / journal.pone.0093422.g002
Endoglukanase bertanggung jawab untuk langkah awal dari degradasi selulosa.
Sebanyak 41 gen yang mengkode egl endoglukanase yang terdeteksi, dan
sekitar setengah dari mereka (20 gen) yang biasa dimiliki oleh semua sampel
(Gambar S1 di File S1). Hampir semua gen egl berasal dari mikroorganisme
terisolasi, termasuk probe dari (jumlah protein id) 149121623 sequencing dari
Methylobacterium sp. 4-46, 197.934.254 Streptomyces sviceus ATCC 29083, dan
171.059.025 dari Leptothrix cholodnii SP-6.
fungsi a-amilase untuk menghidrolisis pati untuk menghasilkan glukosa dan
maltosa, yang memainkan peran penting dalam degradasi pati. Sebanyak 366
gen Amya pengkodean-amilase yang terdeteksi, di antaranya 156 gen yang
umumnya dibagi di semua sampel. Hampir gen Amya yang terdeteksi berasal
dari organisme yang terisolasi seperti 113897923 dari Herpetosiphon
aurantiacus ATCC 23779, 50842594 dari Propionibacterium acnes KPA171202,
240.169.491 Mycobacterium kansasii ATCC 12478. Xilanase adalah enzim yang
memecah hemiselulosa, yang merupakan komponen utama dari dinding sel
tanaman. 33 gen xilanase yang terdeteksi, dan 13 dari mereka bersama oleh
semua sampel (Gambar S2 di File S1). Sebagian besar gen xilanase berasal dari
isolat seperti 113935746 dari Caulobacter sp. K31, 116.098.389 Lactobacillus

brevis ATCC 367, 68230042 dari Frankia sp. EAN1pec, dll Juga total 422 gen yang
mengkode enzim degradatif kitin, termasuk Endochitinase, asetil dan
exochitinase, ditemukan di semua 12 sampel. Gen encoding Endochitinase, 99
dari 239 gen yang dimiliki oleh semua sampel. Sebanyak 268 gen yang
berhubungan dengan degradasi lignin yang terdeteksi, termasuk gen yang
mengkode glioksal oxidase (glx), ligninase (bibir), mangan peroksidase (MNP)
dan fenol oksidase (LCC). Banyak dari gen ini terdeteksi di semua sampel.
Misalnya, 13 keluar 28 gen lip dibagikan oleh semua sampel dan semua dari
mereka
berasal dari isolat (Gambar S3 di File S1). Demikian pula, hampir semua

Gambar 3. Intensitas sinyal dinormalisasi dari terdeteksi gen kunci yang terlibat
dalam bersepeda nitrogen. Intensitas sinyal untuk setiap gen fungsional adalah
rata-rata intensitas sinyal dari semua ulangan. Semua data yang disajikan
sebagai rata-rata 6 SE.
doi: 10.1371 / journal.pone.0093422.g003

dari nosZ gen berkorelasi positif dengan konsentrasi influen TN (r = 0,348, P,

0,05) dan amonia (r = 0,338, P, 0,01) (Tabel S5 di File S1). 295 gen yang
mengkode ureC ureases terdeteksi, dan 128 gen yang dimiliki oleh semua
sampel. Tidak seperti gen nitrogen lainnya, sebagian besar gen ureC yang
berupa mikroorganisme berbudaya dan hanya 9 dari bakteri berbudaya. Hasil uji
Mantel menunjukkan korelasi positif antara gen ureC dan konsentrasi influen TN
(r = 0,463, P, 0,01) dan amonia (r = 0,393, P, 0,01) (Tabel S5 di File S1). Hanya
empat gen yang mengkode hzo oksidoreduktase hidrazin yang terdeteksi,
termasuk dua gen (208605292 dan 224712632) dari Candidatus Brocadia sp.
dan dua gen (224712622 dan 208605290) dari berbudaya Planctomycete. Tidak
ada hubungan yang signifikan antara gen hzo dan konsentrasi influen TN (P.0.05)
dan
amonia (P.0.05) (Tabel S5 di File S1) diamati. Fosfor Bersepeda Gen
Penghapusan fosfor dari IPAL merupakan faktor kunci dalam mencegah
eutrofikasi air permukaan. Gen yang mengkode exopolyphosphatase (ppx) untuk
anorganik degradasi polifosfat, kinase polifosfat (PPK) untuk mengkatalisis
pembentukan polifosfat dari ATP dan fitase untuk degradasi fitat terdeteksi
di antara semua sampel (Gambar 5). Sebanyak 90 dari 246 gen ppx terdeteksi
dibagikan oleh semua sampel, termasuk gen yang berasal dari Leptothrix
cholodnii SP-6 (171060286), Streptomyces coelicolor A3 (2) (21221778),
Erythrobacter sp. NAP1 (85709358). Namun demikian, tidak ada hubungan yang
signifikan antara gen ppx dan konsentrasi influen TP (Tabel S5 di File S1). Untuk
PPK, 57 dari 165 gen terdeteksi dibagikan oleh semua sampel. Signifikan korelasi
positif yang diamati antara kelimpahan gen PPK dan konsentrasi influen TP (r =
0,242, P, 0,05) (Tabel S5 di File S1). Selain itu, total 27 gen fitase yang terdeteksi.
Di antara mereka, 7 dibagikan oleh semua sampel (Gambar S4 di File S1). Hasil

Tes Mantel menyarankan bahwa tidak ada hubungan yang signifikan antara gen
fitase dan berpengaruh TP (Tabel S5 di File S1). Sulfur Bersepeda Gen Sebanyak
1.241 gen yang terlibat dalam reduktase sulfit, reduktase adenylylsulfate,
oksidasi sulfur, oksidasi sulfida yang terdeteksi. Kelimpahan relatif gen sulfur
bersepeda yang
disajikan pada Gambar 6. Di antara mereka, ada 46 gen yang mengkode APRA
dissimilatory adenosine-59 phosposulfate reduktase, enzim kunci yang terlibat
dalam reduksi sulfat mikroba dan oksidasi belerang. 15 dari 22 gen Apra hadir di
semua 12 sampel
berasal dari isolat (Gambar S5 di File S1). Selain itu, 327 gen yang mengkode
dsrA reduktase sulfit dissimilatory terdeteksi. Dari 100 gen yang dimiliki oleh
semua sampel, sebagian besar gen yang berasal dari mikroorganisme berbudaya
kecuali untuk 18 gen dari isolat seperti 107.784.967 dari Desulfovibrio
desulfuricans, 13992710 dari Bilophila wadsworthia dan 83.573.380 dari Moorella
thermoacetica ATCC 39073. Untuk gen sox encoding sulfit oksidase, 77 dari 205
gen terdeteksi dibagikan oleh semua sampel, yang sebagian besar berasal dari
mikroorganisme yang terisolasi seperti 56.677.633 dari Silicibacter pomeroyi
DSS-3, 255.258.527 dari Sideroxydans lithotrophicus ES-1, 214.028.622 dari
Ruegeria sp. R11. Degradasi kontaminasi organik Kontaminan Organik adalah
kekhawatiran dan banyak penelitian telah dilakukan untuk meneliti peran
mikroorganisme dalam degradasi dan remediasi kontaminan organik [14]. Secara
total, 7.012 gen dari 165 kategori gen yang terlibat dalam degradasi kontaminan
organik terkait dengan aromatik, pelarut diklorinasi, herbisida dan pestisida yang
terdeteksi. Kelimpahan relatif gen tong terlibat dalam degradasi kontaminan
organik hadir pada Gambar 7. Di antara mereka,
24 gen yang mengkode benAB benzoat 1, 2-oksigease terdeteksi di semua
sampel dan 19 hadir di semua sampel. Gen yang paling banyak berasal dari
Burkholderia xenovorans LB400 (91779181), Mycobacterium sp. MCS
(108768762), Rhodococcus sp. RHA1 (110.818.905).
Gen logam Resistance
Berbagai logam berat yang sering terdeteksi pada IPAL sebagai akibat
industrialisasi sosial dan modernisasi. Gen ketahanan Ag, As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg,
Pb, Ni, dan Zn Te terdeteksi dalam penelitian ini. Sejumlah besar (3.381) dari gen
yang terlibat dalam perlawanan logam terdeteksi dalam semua sampel, yang
sebagian besar berasal dari mikroorganisme yang terisolasi. Khususnya, jumlah
relatif terdeteksi gen ketahanan logam yang serupa di antara lumpur aktif dari
empat IPAL (Gambar S6 di File S1). Selain itu, hasil uji Mantel menunjukkan
bahwa sebagian besar logam gen resistensi, seperti Chra, nreB, Copa, cueO,
zntA, Cada dan cadBD, berkorelasi positif dengan konsentrasi Cr, Ni, Cu, Cu, Zn,
Cd dan Cd pada IPAL, masing-masing. Sebaliknya, gen ketahanan logam lainnya
(CORC, Cusa, zitB) tidak menunjukkan korelasi signifikan terhadap konsentrasi
logam masing
(Tabel S5 di File S1).
Resistensi antibiotik
Struktur Fungsional mikroba dalam resistensi antibiotik IPAL adalah kekhawatiran
di seluruh dunia karena semakin banyak patogen mengembangkan resistensi

terhadap antibiotik yang umum digunakan. 9 kategori gen keluarga yang

berhubungan dengan resistensi antibiotik yang terdeteksi dalam penelitian ini,
termasuk lima transporter (kaset ATP-mengikat, multidrug ekstrusi beracun
senyawa, superfamili fasilitator utama, Mex, dan pompa resistensi multidrug
penghabisan kecil), tiga gen b-laktamase dan beberapa gen terlibat

resistensi tetrasiklin (Gambar S7 di File S1). Sebanyak 1.072

gen resistensi antibiotik yang terdeteksi. Dari 92 tetrasiklin
gen resistensi, 39 dibagi oleh semua sampel dan sebagian besar dari mereka
berasal dari mikroorganisme yang terisolasi, seperti 214028433 dari
Ruegeria sp. R11, 259.487.609 dari Aspergillus nidulans FGSC A4,
254407454 Streptomyces sviceus ATCC 29083, dll Sejak antibiotik
resistensi sering dikaitkan dengan resistensi logam, uji Mantel adalah
dilakukan untuk menguji hubungan antara logam berat
gen ketahanan dan gen resistensi antibiotik. Hasil
menunjukkan bahwa gen resistensi logam keseluruhan yang positif
berkorelasi dengan seluruh gen resistensi antibiotik (r = 0,325,
P, 0,01).
Hubungan Faktor Lingkungan terhadap Mikroba
Komunitas.
CCA dilakukan berkorelasi dengan variabel lingkungan
struktur fungsional komunitas mikroba dan menentukan besar
variabel lingkungan dalam membentuk komunitas mikroba
struktur. Atas dasar varians faktor inflasi, empat variabel
dipilih: DO, suhu, amoniak dan COD (Gambar 8)
.
Hasil CCA menunjukkan bahwa model signifikan
(P, 0,05), menunjukkan bahwa empat variabel yang utama lingkungan
faktor yang mempengaruhi mikroba struktur fungsional masyarakat. MELAKUKAN
menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan sumbu pertama dan
korelasi negatif dengan sumbu kedua, sementara amonia dan
Loading rate COD menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan
sumbu kedua dan korelasi negatif dengan sumbu pertama.

Suhu menunjukkan korelasi negatif yang kuat dengan kedua

pertama dan kedua sumbu. Struktur fungsional komunitas mikroba
pada IPAL GBD dan XHM yang terutama terkait dengan DO, sementara
QH itu terkait dengan suhu. Amonia dan tingkat pembebanan COD
tampaknya faktor utama yang menghubungkan ke komunitas mikroba
struktur fungsional di XJH.

Gambar 5. Intensitas sinyal dinormalisasi kunci terdeteksi

gen yang terlibat dalam fosfor bersepeda. Intensitas sinyal untuk
setiap gen fungsional adalah rata-rata intensitas sinyal dari semua
ulangan. Semua data yang disajikan sebagai rata-rata 6 SE.
doi: 10.1371 / journal.pone.0093422.g0

Varians partisi analisis (VPA) selanjutnya dilakukan untuk menilai kontribusi dari
karakteristik air limbah dan parameter operasional untuk komunitas mikroba
varians. Karakteristik air limbah termasuk konsentrasi influen COD, TN, amonia,
TP, pH dan konduktivitas. Parameter operasional terdiri dari DO, suhu, waktu
retensi hidrolik (HRT) dan campuran minuman keras padatan tersuspensi (MLSS).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa 53% dari total varians dapat dijelaskan oleh
variabel-variabel ini (Gambar S8 di File S1). Karakteristik air limbah dan
parameter operasional secara mandiri dapat menjelaskan 25% dan 23% dari
variasi komunitas mikroba, masing-masing. Interaksi antara dua komponen
utama (5%) tampaknya kecil.

Gambar 6. Intensitas sinyal dinormalisasi kunci terdeteksi gen yang terlibat

dalam sulfur bersepeda. Intensitas sinyal untuk setiap gen fungsional adalah
rata-rata intensitas sinyal dari semua ulangan. Semua data yang disajikan
sebagai rata-rata 6 SE.