BAB III

METODE
3.1 ALAT DAN BAHAN
a. Alat

: Shaker incubator 37 C, UV Transilluminator, mikropipet, ose bulat,

sentrifus,

tabung mikrosentrifus 1,5 ml, tip biru 1 ml, tip kuning 100 l, tip putih

10 l
b. Bahan : Bakteri E.coli PET 30, Medium Luria Bertani, kanamisin, Solutio I (150 mM
glukos, 25 mM Tris Cl ph 8, 10 mM EDTA ph 8), Solutio II (0,2 NaOH, 1 % SDS
(dibuat baru) ) Solution III (60 ML 5 m potasium asetat 11,5 ml asam asetat glasial
28,5 ml aquadest), PCI (phenoL/chloroform/isoamilalkohol), bufer TE, etanol pa, Na
asetat
3.2 PROSEDUR KERJA
Pembiakan dan Pemanenan Bakteri
Koloni tunggal bakteri E. Coli pET 30 diambil dari media LB padat dibiakkan dalam 5
mL media LB cair yang telah diberi kanamisin (konsentrasi akhir 25 g/ml) dan inkubasi
selama 18 jam pada suhu 37 C dalam inkubator goyang dengan kecepatan 150 rpm

Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml, dan
disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, supernatan dibuang dengan
membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk
mendapatkan pelet bakteri

Isolasi Plasmid
Pelet sel diresuspensi dengan 100 l solution I dengan cara memipet naik turun beberapa
kali hingga benar-benar tersuspensi ( apabila perlu divorteks)

Solution II (fress solution/rp) ditambahkan sebanyak 200 l, dihomogenkan dengan cara

membolak-balik tube secara perlahan selama 6-8 kali, kemudian didiamkan selama 5
menit hingga lisat jernih (Tidak divorteks)

Solution III sebanyak 150 l dihomogenkan dengan cara membolak-balik tube secara
perlahan selama 6-8 kali (Tidak divorteks), disimpan dalam es selama 5 menit

Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit 4 C. Diulangi sentrifugasi jika

supernatan belum jernih

Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus baru. Hati-hati jangan sampai ada
endapan yang terikut

Ditambahkan PCI sampai sama banyak dengan volume supernatan (500l), kemudian
divorteks 3 menit dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit

Lapisan atas diambil dimasukkan pada tabung mikrosentrifus baru dan ditambahkan etanol
pa dan 3 M Na asetat dengan perbandingan ( 2,5 : 0,1) dari volume supernatan. Didiamkan
pada freezer (-20C) selama 1 jam untuk mempresipitasi plasmid

Setelah 1 jam presipitasi, tabung mikrosentrifus disentrifugasi 12.000 rpm, 1 menit pada
suhu 4C

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% kemudian disentrifus
kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4C

Pelet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 l buffer TE dan disimpan pada suhu 4C
untuk analisis selanjutnya

DOKUMENTASI PROSEDUR KERJA

Pembiakan dan Pemanenan Bakteri
1. Koloni tunggal bakteri E. Coli pET 30 diambil dari media LB padat dibiakkan dalam
5 mL media LB cair yang telah diberi kanamisin (konsentrasi akhir 25 g/ml) dan
inkubasi selama 18 jam pada suhu 37 C dalam inkubator goyang dengan kecepatan
150 rpm

2. Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml,
dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, supernatan dibuang
dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik

3. Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk
mendapatkan pelet bakteri

Isolasi Plasmid

1. Pelet sel diresuspensi dengan 100 l solution I dengan cara memipet naik turun
beberapa kali hingga benar-benar tersuspensi ( apabila perlu divorteks)

2. Solution II (fress solution/rp) ditambahkan sebanyak 200 l, dihomogenkan dengan

cara membolak-balik tube secara perlahan selama 6-8 kali, kemudian didiamkan
selama 5 menit hingga lisat jernih (Tidak divorteks)

3. Solution III sebanyak 150 l dihomogenkan dengan cara membolak-balik tube secara
perlahan selama 6-8 kali (Tidak divorteks), disimpan dalam es selama 5 menit

4. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit 4 C. Diulangi sentrifugasi jika

supernatan belum jernih

5. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus baru. Hati-hati jangan sampai

ada endapan yang terikut

6. Ditambahkan PCI sampai sama banyak dengan volume supernatan (500l), kemudian
divorteks 3 menit dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit

7. Lapisan atas diambil dimasukkan pada tabung mikrosentrifus baru dan ditambahkan
etanol pa dan 3 M Na asetat dengan perbandingan ( 2,5 : 0,1) dari volume supernatan.
Didiamkan pada freezer (-20C) selama 1 jam untuk mempresipitasi plasmid

8. Setelah 1 jam presipitasi, tabung mikrosentrifus disentrifugasi 12.000 rpm, 1 menit

pada suhu 4C

9. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% kemudian disentrifus
kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4C

10. Pelet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 l buffer TE dan disimpan pada suhu 4C
untuk analisis selanjutnya