Untuk menguji apakah PI3K diperlukan pada pertumbuhan jenis sel larva yang

berbeda, kami menggunakan teknik Flp / Gal4 (Neufeld et al, 1998;. Pignoni dan
Zipursky, 1997) untuk mengungkapkan bahwa P60, P60, atau PTEN tersebar
pada sel di seluruh larva. Metode ini menggunakan Act>CD2>Gal4 dan hs-Flp
transgen untuk mengaktifkan UAS terkait gen target, termasuk sel penanda UASGFPnls, pada sel klon. Aktivasi Heat shock-independen Gal4 terjadi sebelum
mulainya pertumbuhan larva dan endoreplication DNA dengan jumlah 1% -10%
dari sel-sel (tergantung organnya) dalam tubuh yang berlemak, usus, kelenjar air
liur, ginjal , dan epidermis (lihat prosedur eksperimental). Sel yang
mengekspresikan P60, p60, atau PTEN pada kelenjar ludah dan lemak tubuh
ukurannya sangat berkurang dan memiliki inti yang jauh lebih kecil dari DNA dan
jauh lebih sedikit dari sel-sel kontrol (gambar 1C, 1D, 3H, dan 3I). Efek serupa
teramati pada jaringan larva lain (data tidak ditampilkan). Meskipun
pertumbuhannya berkurang, p60-, p60-, dan sel-pengekspresi PTEN ditemukan
kurang lebih dengan frekuensi yang sama dengan sel kontrol GFP. Sel apoptosis
tidak diamati. Dengan demikian, penurunan aktivitas PI3K tidak bertentangan
dengan kelangsungan hidup sel. Efek
pada morfologi sel yang mungkin
mencerminkan perubahan pada adhesi sel, motilitas, atau identitas juga tidak
diamati. Kami menyimpulkan bahwa mengurangi aktivitas INR / PI3K dalam
jaringan yang berbeda pada larva memiliki efek sel- otonom yang terbatas untuk
mengurangi pertumbuhan sel dan replikasi DNA.
Figure yang atas :
Gambar 1. Aktivitas PI3K diperlukan untuk organisme dan sel
Pertumbuhan
Menekan sinyal INR / PI3K dalam lemak tubuh menggunakan driver Adh-Gal4 (A) atau
menggunakan Act-Gal4 (B) menghambat pertumbuhan larva dan phenocopies karena kelaparan.
Pertumbuhan hewan overexpressing UAS-P60, UAS-p60, atau UAS-PTEN dibawah kendali driver
ini dipantau dan dibandingkan dengan pertumbuhan hewan terkontrol yang dilakukan tidak
menggunakan UAS transgen. Hewan-hewan yang ditunjukkan dibesarkan dan akan ditampilkan 5 hari
setelah deposisi telur (AED). (C) dan (C) menunjukkan lemak tubuh L3 di mana aktivitas PI3K
ditekan dalam sel GFP-marked (panah) melalui induksi P60 dengan Flp / Gal4. Merah menunjukkan
permukaan sel CD2, dan DNA berwarna biru dengan DAPI. (D) dan (D) menunjukkan penekanan
pertumbuhan oleh P60 dalam sel GFP-marked kelenjar ludah (panah) dengan perlakuan yang sama.
Aktin kortikal berwarna merah dengan rhodamin-Phalloidin.
Figure yang bawah :
Gambar 2. tGPH, sebuah PH-GFP Fusion Protein Digunakan sebagai Indikator aktivitas PI3K
(A) Urutan Asam Amino dari domain PH pada Drosophila GRP1 (tGPH) dan GRP1 (mGRP1). Asam
amino umumnya dikonservasi di domain PH terindikasi dengan tanda bintang di atas urutan protein.
Dua asam amino yang telah dikonserasi yang bervariasi di dalam gen Drosophila ditandai dengan
lingkaran penuh.
(B) Skema representasi dari fusi protein tGPH.
(C) lokalisasi GPH dalam sel S2 tertransfeksi secara sederhana dengan gen pMT-GPH. Kiri: sel
kelaparan untuk serum selama 2 jam. Tengah : sel serum-kelaparan diobati dengan 200 nM insulin
selama 5 menit. Kanan: Sel serum kelaparan diobati dengan insulin selama 10 menit diikuti dengan
inhibitor PI3K Wortmannin pada 100 nM.