PR,CEEDNGSnBloL 20, No.

112,1987 4l

ANALISISASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFICAIRAN KINERJA

TINGGISECARADERIVATISASI PRAKOLOMDAN PASCAKOLOM

Oleh: lvayanRediatningS*. da Nanny Karti i H.*

ABSTRACT
Tlrough an experiment process,an optimum condition of amino acid analysisusing High
krformance Liquid Chlromatography(HPl{) with post- and pre+olumn derivatization
methodshasbeen found.
The optimum condition of the analysisfor the post{olumn deriyatization was obtained
by usingresincation exchanger (R-SO3 Na) as the column,citric acidbuffer of the pH 3,0
and bodc acid buffer of the pH 9,? as the mobile phase,and O-phtalaldehyde(OPA) /2-mer-
captoethanolasthe derivator,
Cl8 wasusedasthe colunn,
In the pre-columnderivatizationmethod,Resolve5;r spherical
solution A (methanol : THF ; H2O = 2 : 2 : 96) which contains 005 M Na2HPOa and
=
0.05M NaOAc) and solutionB(methanol:H2O 65 : 35) as the mobile phase,and OPA/
ethantiolasthe derivator.
Each of both HPlf methods can separatemore than 17 kinds of amino acids.The result
showstiat the prc-column derivatization method was more sensitiveand took a shorter
analysingtime than the post{olumn derivatizationme'thod;how€yer,secondaryamino acid
couldnot be determinedby the first method.

SARI
T€lah dilakukan percobaan untuk mencari kondisi optimum proses analisisasam amino
dergan komatograii cair kineda tinggi (KCKT) secaraderiyatisasiprakolom dan pasca-
kolom.
Kondisi analisisoptirnuri untuk cara derivatisasi pascakolomdiperoleh dengan mengguna-
lon resin penukar kation (R-SO; Na), larutan dapar sitrat pH 3,0 dan larutan daparborat
pH 9,? sebaSaifase gerak, serta O-ftalaldehila (OPA)/2flerkaptoetanol sebagaipenderivali-
sasinya.
Unluk c{n derivatisasiprakolom, sebaSaikolom digunakanResolvesphericalCl8, sebagai
fasegerak digunakan larutan A yang terdid dari metanol : THF : air (2:2: 96) yang me-
ngndung 0p5 M Na2HPOa dan larutan B yang terdiri dari metanol : air (65 :35), sedangkan
zal penderivalisasidigunakanOPA/etantiol.
sebaSai
I Purat Penelitian Teknik Nuuir- BATAN, alumtri ITB
42 nB yol 20,No. l/2, 1987
PROCEEDINGS

Kedua metode KCKT ini rBsir8-masing dapat memisahkan 17 macam campuBn asam
amino. Diketahui bahwakepekaancarad€rivatisasiprakolom lebih tinggi dan waktu analisis-
nya lebih cepat daripada cara derivatisasipascakolom,tetapi ca.rapnkolom tidak dapat me-
nentukan asamamino sekunder.

PENDAIIULUAN
Asam amino adalah senyawayang mempunyai rumus umum +H3NCH - (R)
COO- , benifat ion dan hidrohl. Asam-asamamino salingberbedagugusR-nyii.
Ada sekitar 20 macam asamamino penting yang merupakanpembentuk prG
tein dan disebut asam amino hidrolisat, seperti Alanin (Ala), Arginin (Arg),
Sistein (Sis),Glutamin (Gln), Asam glutamat (Glu), Glisin (Gly), Histidin (His),
Iso leusin (Leu), Lisin (Lys), Metionin (Met), Fenilalanin(Phe), Prolin (Pro),
Serin (Ser),Treonin (Thr), Triptofan (Trp), Tirosin (Tyr), dan Valin (Val).
Analisis asam amino ini sangat diperlukan, misalnyauntuk mengaralisishasil
industri seperti makaran, makanan temak, obat-obatan,juga untuk analisis
caira:rbiologi dan hidrolisat protein.
Cara a-nalisisasam amino yang masih lazim digunakansampaisaat ini adalah
kronratografi denganb!'rbageinracanrteknik scpcrti kromatogratikertas,lapis-
e n t i p i s , d a r rk o l o i r . K r o n l l r t i j g f : r tkl o l o n r l c b i h b a n y : k , - l i k c n t ' . ; . t i i g kh:ar r, c i - , : i
selain dapat digunakanuntuk kcpcrluan kualitatifjuga dapi.ltuntLrkkeperluair
kuantitatif dan prcparatif. Akan tetapi pada kromatografi kolont biasa(open
column), diperlukan waktu yang lama untuk memisahkanasam amino secara
sempuma. Karena itu perlu ada metode analisisyang dapat memisahkanasam
amino tersebut secarasempurna dalam waktu singkat dengan hasil yang tepat
dan teliti.
Analisisasamamino dengankromatograhcair yang menggunakanresinpenukar
kation sebagaifase diam, pertama kali dikembangkanoleh Williem Stein dkk.
(8) pada tahun 1951, yarg kernudian dikembangkanbenama Sparknran(8)
menjadi sistenryang otomatis pada tahuD I958. Akar tetapi metode ini masih
sangat rumit, biayanya mahal, dan peralatannyakurang dapat disesuaikan
dengan keadaan. Akhir-akhir ini kromatografi cair dengan kinerja tinggi (fligft
PerJormanceLiquid Chromatography)banyak digunakanuntuk analisisasam
anino. Metode ini ditunjang oleh peralatanyang baik dan modcnl, mengguna-
kan kolom yang sangatefisien dan di bawah tekananyang besar,;:hingga ana-
,lisis asam amino dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan
hasil yang tepat dan teliti. Percobaanini dilakukan oleh Pfeiferdkk. pada tahun
I 983 (7).
Untuk mendeteksi asam amino dapat digunakan detektor ultra-lembayung,
sinar tampak. atau detektor fluoresensi. Dalam hal ini asam amiro harus
PROCEEDINGSNB T/OL20, NO. 1/2, 1987 43

diderivatisasi terlebih dahulu supaya dapat membentuk derivat yang dapat

menyerap cahaya UV, tampak, atar.l berfluoresensi. Senyawa yang banyak
digunakan untuk tujuan ini adalah o-ftalaldehida (Qptr)/etantiol (ETSH),
dan OPA/2-merkaptoetanol(2-ME). Pereaksiini dengan asam amino dapat
membentuk derivat iso-indolyang berfluoresensi kuat, sehinggadapat terdetek-
si oleh detektor fluoresensi.
Ada I macam cara derivatisasi, yaitu derivatisasi pascakolom dan derivatisasi
prakolom (4. 5, 6). Pada cara derivatisasipascakolom,mekanismepemisahan
asamamino adalah tegadinya penukaranion antara gugusamino yang terpro-
tonasi denganion Na+ dari resin penukar kation (R SO3-Na+) pada pH ren,
dah.
Bila pH fase gerak dinaikkan secaragradien kontinu, protonasi asam amino akan
berkurang, yang menyebabkan asam amino akan terelusi berturut-turut sesuai
denganderajat protonasinya,dan hal ini berkaitandenganpH isoelektrikasam
anlino tersebut.Asanr anrino yang mempunyai pH isoelektrikrendahakan ter-
elusilebih dahulu (4, 5, 6).
Dalam teknik derivatisasi prakolom, ttekanisme pemisahan adalah partisi de-
ngan sistem kromatografi fase balik (reverse phase chrcmatoglaphy). Asam
sii,rr,v prrr,r\ r jclord spsslrrn udrr r!,r!A!rr uwr1E,.ur \_/r rt/:,_rvr[ aLdu
OPA/ETSH. Terbelrtuk suatu derivat yang selainberfluoresensikuat juga ber-
sitat hidrofob yang memungkinkan tedadinyapemisahansecarakromatograti
fase balik menggunakankolom nonpolar dan fase gerak yang polar (4, 5, 6).
Asam amino terderivatisasiyang rlempunyai kepolaran tinggi akan terelusi
lebih dahulu. Dalam percobaanini dicari kondisi pemisahanyang baik dengan
menggunakankedua metode di atas, dan dicoba menganalisisasamamino dari
beberapacuplikan sepertimakanar temak, bir, dan berem.

BAHANDAN TATA KE RJA

Bohan dan perolaton
Bahar terdiri atas asam amino baku fr.ratan Sigma, BRIJ 30 (Polyoxy ethylene
lauryl ether) buatan Pierce, natrium sitrat, asam borat buatan Univar, Ajax
chemical,2-merkaptoetanol (Sigma), oftalaldehida (Pierce),dan pereaksiyang
lain buatan E. Merck. Semua pereaksi yang digunakan mempunyai tingkat
kemumian pro anaLisis. Selainitu digunakal _iugaplasmatikus. ntakananayam.
dan bir. Air yang digunakanadalahair yang telah dilewatkanMilli Q system.
Peralatanyang digunakan adalah KCKT (Waten, Model 244) yang dilengkapi
dengandetektor fluoresensi(Model 420-AC, eksitasi= 334 nm, dan emisi =
425 mm), Autotrwted Gradient Contrcller (Waten, Model 680), Data Modul
(Waten, Model '13O).Amino Acid Analysis ColumnrM (Waten), ResolverM
5p SphericalCts (3,9 mm I.D x 15 cm) Radial Pak p Bondapak Cls (8 mm
I.D x l0 cm) dari Waters,alat vakum, oven, dan lampu infra merah.
44 PROCEEDINGS
NB VoL20,No,1/2, ]987

Tata keria
a Penyedidanlarutan baku
Asam amino baku ditimbang masing-masing25 mg, kemudian dilarutkan dalam
HCI 0,01 M (tirosin dilarutkan dalam dapar fosfat pH = 7,0) sampai volume
mencapai 25 ml. Dari masing-masinglarutan diambil sejumlah volume tertentu,
kemudian diencerkandenganHCI 0,01 M sampai kadar asamamino 50 nmol/
ml untuk cara derivatisasipascakolomdan 0,5 nmol/ml untuk cara derivatisasi
prakolom. Sebelum dbuntikkan, senrua larutan disarirg dengan penyaring mili-
pore ukuran 0,45 gm.

b Penyediaot cuplikan
Untuk analisis asam amino dari makanan temak, cuplikan harus dihidrolisis
dahulu dengan cara sebagaiberikut: Makanan ayarn ditimbang 10-15 mg,
ditambalkan 25 nl HCI 6 N,lalu dimasukkanke dalam tabung hidrolisis.Cair-
an dalam tabung dibekukan dengannitrogen cair atau CO2 padat (es kenng),
lalu tabung divakumkan, dan setelahvakum, ditutup kedap. Selanjutnya,ta-
bung dipanaskan di dalam oven pada suhu I l0"C selama 6 jam, lalu didingin-
kan. Setelah itu HCI dihilangkan denganpenguapandi bawah sinar inframerah.
Residu yang mengardungasam amino dilarutkan dalam HCI 0,01 M, dan un-
tuk melarutkan tirosinnya digunakan dapar fosfat pH 7,0. Ahhimya larutan
disaringdenganpenyaringmilipore ukurar 0,45 grn.

c Perryediaanlarutan dapar
I Larutad dapar sitrat dibuat denganmelarutkan 19,6 g natrium sitrat dalam
air. pH diatur dengan larutan HCI 6 N sampaimencapai3,0; volume akhir I
liter.

2 Larutar dapar borat untuk fasegerak

Ke dalam 800 ml air dilarutkan 2,5 g asamborat dan 14,6 g NaCl. pH diatur
denganlarutan NaOH 6 N sampai9,7; volume akhir I liter.

3 Larutan sediaandapar borat

Ditinrbarg 48 g asamborat, kemudiandilamtkan dalam 1800 ml air dan ditam-
bah 30 g KOH. pH larutan diatur sampai10,4 dengank. .trn KOH 6 N, volume
akhir 2 liter.
Semua larutan dapar tenebut kemudian disaring dengan penyaring milipore
ukuran 0,45 /um dan diawagaskan(dihilangkangas yrr 6 Lsrl "',t di dalamnya)
denganalat Utasortic batft;pH ditentukan kembaLisebelumdipax i.

d Pembuatan larutan hipo kloit

Larutan sediaan dapar borat diambil 500 ml, ditambah 1 ml larutan I a-hipo-
klorit 0,5%, kemudian diawagaskan.
 ITR VoL20,Na 1/2, 1987
PROCEEDINGS 45

e Pembuatanlarutan OPA (o-ftalaldehida)

Larutansediaandaparborat diambil 500 ml, lalu ditambah0,2 ml larutan3O7o
BRIJ 30 dalamair. Di dalamgelaspiala kecil ditimbang350 mg OPA dan di-
larutkan dalam l0 ml metanol. Kemudian ditambahkan2 ml 2-merkaptoe-
tanol/etantiol;dilakukan di dalam ruang asam.Larutan OPA-merkaptoetanol
ini ditambahkanke dalam larutan borat, kemudian diawagaskan. Larutan ini
akanlebih stabil bila disimpandi bawahnitrogen.

f PembuatanfasegemkA untuk teknik deritatisasiprakolom

Dibuat campuranlarutanmetanol: TIIF (tetrahidrofuran):ah (2 : 2 : 96) yang
mengandung 0,05 M Na2HPO4dan 0,05 M Na-asetat.pH larutandiatur sampai
7,5 denganmenggunakan asamasetat.Kemudianlarutandisaringdan diawagas-
kan.

g Pembuatanlarutanpendeivatisasiuntuk caradeitatisasi prakolom

DitimbangOPA 50 rng,dilarutkandalam4,5 ml etanol,dan ditambahkan50 trrl
atau etantiol serta0,5 ml larutandaparborat.
2-merkaptoetanol

h Deivatisdsiasamamino baku dan cuplikan

Larutanasanlanino 250p1 ditambah250pllanttardaparboratdan l00gl
larutan OPA/merkaptoetanol.Kemudian larutan diencerkal sampaivolume
I ml denganmetanol,dan dibiarkanbereaksipadasuhukamarselama5 menit.

i Cleanup cuplikandengan:SEP-PAKCB cattidge

Larutanyangdibuatadalah:
LarutanI :0,1%TFA (asamtrifluoro asetat)dalamair;
Larutan2:0,1%TFAdalamair: metanol= 80: 20i
Larutan3 : O,I%TFA dalamair : metanol= 70 : 20.
SEP-PAKC18yang baru, diaktifkan dua kali denganl0 ml metanol,kemudian
dicucidua kali denganl0 ml larutan1. Setelahitu cucilagisatukali denganl0
ml larutan2.
Larutancuplikan sebanyakI ml dicampurdengan2 ml larutan3 (larutanharus
larut dalamair atauasamdan bebasdari partikel).
Cuplikandilewatkanmelalui SEP-PAKC1scartridge.Eluat pertama1 ml dan 2
ml, eluatberikutnyayangmengandung asamaminoditampung.

HASILDANPEMBAHASAN
Dalam analisisasam amino dengan cara derivatisasipascakolom,derivatisasi
denganOPA/2-merkapto€tanoldilakukan setelahasamamino keluar dari ko-
lom dan telah tedadi pemishhan.Karenaitu, sebelummasukke dalamkolom,
asamamino tersebutberadadalambentuk ion, sehinggamekanismepemisahan
yangcocok adalahpenukaranion denganmenggunakan kolom penukarkation
(R-S03-Na+ ).

i
46 PROCEEDINGSITB Vol 20, No. 1/2. 1987

Dalam hal ini, pemisahandan elusi asamamino didasarkanpadaperbedaanpI

(pH isoelektrik) asamamino tenebut dan pengaturanpH fasegeraknya.Pada
pH yang rendah(= 3,0) asamaminoberadadalambentuk terprotonasi,sehing-
ga dapat terikat denganresin penukarkation (R SO3-) menggantikanke{u-'
dukan Na*. Bila pH dinaikkansecaragradien(berangsur-angsur dengantetap),
maka setelahpI di lewati, gugusNI{3r dari asamamino tersebutakanberubah
menjadi gugusNH2 yang menyebabkanterlepasnyaasamamino dari resindan
terelusi.Makin kecil pI, asamamino makin cepat terelusi.Asam amino yang
mempunyai pI yang samaakan terpisahberdasarkanperbedaanukuran mo-
lekul, karena selain mempunyaisifat menukarkanion, resin yang digunakan
juga mempunyaisifat molecularsieve(7,8).

lil
t
pada Resin SO. - Na' + H a N +- L - n
pH rendah cooH
)

H
I
Besin SO. -H^+ N-C-R + Na+
I
cooH
)

paoa
Resin
\TF S O - - N a - H^N-C-R
pH tinggi
Joo
/
Padapemisahanasamamino denganmekanismepemisahanion, pH memegang
peranan penting. Pengaturan pH ini dilakukan dengan mengatur komposisi
(perbandinganvolume) dapar sitrat (pH = 3,0) dan dapar borat (pH = 9.8) se-
cara gradienkontinu, yang didasarkanpada kurva titrasi dapar sitrat dan dapar
borat sepertiterterapada gambar l.
Untuk menyempumakan pemisahan asam amino yang keluar terlebih dahulu
seperti treonin dan serin, perlu ditanrbahkar metanol pada daparsitral. Hal ini
disebabkanUeonin dan serin mempunyai pl dan ukuran molekul yang hampir
samatetapi kelarutandalammetanol berbeda(7).
Mekanisme derivatisasi asam amino dengan o-ftalaldehida (OPA)/2-merkaptoe-
tanol atau etanol/etantroladalahsebagaiberikut (7).
l'
/

r
1,.

PROCEEDINGS
NB VOL20,NO.I12, 1987 47

2ME

- H H S - C H 2- C H 2 - O H

-H H 2 N- C H - C O O H
R
o
OPA 1" asamamino
N-CH-COOH
R

derivatisoindol
berfluoresensi
kuat dan bersitathidrofil

1m
%B
,l.90
I
180

70

60

50

40

30

20

10

3456789

-
Grn$.r 1 KurvatitrasidariNa-sitrat{A} denganNaSorat(B)
48 PROCEEDINGS ITB VoL 20, No. ]/2, 1987

OPA dan 2-merkaptoetanol atau OPA dan ESTH akan bereaksi secaraspesifrk
dan selektif dengan asam amino primer membentuk derivat isoindol yang
berfluoresensi yang relatif sangat peka. Karena OPA/2-merkaptoetanol (ME)
atau OPA/ESTH hanya dapat bereaksidengan asam amiro primer saja, maka
asam amino sekunder seperti prolin dan hidroksi prolin harus dioksidasi dahulu
menjadi asam amino primer denganmenggunakanasamhipoklorit (HCLO).
Dari gambar 2 terlihat bahwa sekitar l8 macam asamamino dapat terpisah de-
ngan sempurna dengan rnengg.rnakan KCKT secara derivatisasi pascakolom,
yang pemisahannyadidasarkan pada kromatografi penukaran ion. Untuk memi-
sahkan asam amino tenebut hanva dioerlukan waktu kira-kira 85 menit- waktu

I
I

85 menit

Gambar 2 Kromatogram yang diperolehdenganmenggunakanalat KCKT secaraderivatisasi

pascakolom
dari 0,25 nmol asamamino

Kondisi pemisahaountuk Eambar2

Kolom : Amino Acid Analysiscolum-TM.Resinpenukarkation (SO3-Na+)

Fasegerak : A DaparsitratpH = 3,0
B Oaparborat pH = 9,8
PROCEEDINCSIT8 Vot. 20, No. 1/2, 1987 49

Kondisielusi gradien

kec. aliran awal A (%) B {%) kurua

(ml/min)

0,4 100 0
o,4 4A o 100 o
o,4 71 0 100 6
72 100 0

Volumesuntikan : 10gl
Detektor : Fluoresensi l\tlodel420
E m i s i: 4 2 5 n m
Eksitasi: 338 nm
A t e n u a s:i4 x

yang relatif singkat dibandingkandenganrnetodelain. Di sampingitu terlihat

bahwaprolin yang menrpakan asam amino sekunderdapat terdeteksi.Dengan
demikian cara derivatisasi pascakolom dapat digunakan untuk menganalisis
asamamino, baik asamamino primer maupun sekunder.

Pada cara derivatisasiprakolom, derivatisasidilakukan sebelum asam amino

tenebut masuk ke dalam kolom, sehinggabentuk isoindolnya yang hidrofil
dapat drpisahkan.karena perbedaanderivat dari asan amino tersebut terletak
pada bagian nonpolamya. Karena itu cara yang cocok untuk memisahkannya
adalahkromatografi fase balik.

Dalamhal ini mekanismepemisahannyaadalahpartisi yang elusinyadidasarkan

pada kehidrofilan derivat asam amitronya serta pengaturan kepolaran fase ge-
raknya. Derivat asam amino yang bersifat hidrofil akan tertahan lebih lama
pada kolom yang bersifat nonpolar, sehingga asam amino yang paling polar
akan terelusi paling dahulu. Dengan menggunakancara ini diperlukan waktu
beberapalarna (tergantungpada lamanyapemisahanoleh kolom) dari saatderi-
vatisasisarnpaiderivat asanlanrino tersebut dideteksi.Dengandemikiiurdiper-
lukan zat peraksiyang dapat membentlrk derivatasamamino yang stabil dalani
selangwaktu tersebut.
Dari percobaandiperoJih data seperti terlihat padagambar3. Gambartersebut
menunjukkan bahwa derivat asam amino-OPA/ESTH lebih stabil daripada
derivat asam arninoOPA/2-ME. Karena itu pereakSiyang dipilih untrlk cara
prakolonradalahOPA/ESTH.
derivatisasi
Di samping itu temyata derivatisasiprakolom ini hanya djgunakan untuk
menganalisis
asamamino primer, karenaOPA/ESTH ataupunOPA/2-ME hanya
dapatbereaksidenganasantamino primer saja.Di sini tidak mungkin dilakukan
50 PROCEEDINGS
ITB VoL20,No. 1/2. 1987

Rispons

1I
'-.-, derivat glisin- OPA,/ETSH
- d e r i v a tg l i s i n' O P A / 2 - M E

4 5 6 7 8 I l0 11 1 4 1 51 61 7 l 8 1 9
_) t {jam)

Gambar3 Kestabilan derivatglisin-OPA/ETSHdan glisin- OPA/2 ME terhadapwaktu

dengankondisi kolom ; ResolveTM 5p Cr"
fasegerak : 5OmM Na3POa,pH 7,2/CH:CN{70/3O)
detektor : Fluoresensi
eksitasi : 338 nm
emisi : 425 nm
vol, suntikan: 10 l.d

oksidasi asam andno sekunder menjadi asam amino primer sebelum melalui
kolom. Bila oksidasi ini dilakukan, dapat tedadi kerusakan pada kemasan
kolom, yaitu pecahnya ikatan antara fase diam (C18) dengan pendukung padat-
nya.
Dari data yang terlihat pada gamba.r4 temyata sekitar 17 asarnamino dapat
terpisahdalam waktu sekitar 30 menit, bahkansepertiterlihat padagambar5
hanya23menit,danyangterdeteksi hanyaasamaminoprimersaja.
Dengankadar asamamino sekitar 50 pmol, responsyang diberikansudahcu-
kup tinggi. Karena itu caraderivatisasiprakolom ini lebih peka dibandingkan
dengancaraderivatisasipascakolom.Dari hasil percobaanterlihat bahwasalah
satu faktor penyebabnya ialahpenggunaan HCIOdalamcaraderivatisasi pasca-
kolom yang temyata dapat menurunkankepekaan,karenadapat terbentuk
derivatlain yangkekuatanfluoresensinya kurang.
Untuk menganalisisasam amino dalam makananternak ternyata harus dila-
kukan hidrolisis terlebih dahulu dengan HCI 6 N untuk memisah-kan asam
amino dari proteinnya,sedangkan untuk cuplikanbir dan berem,asam-asam
aminonyadapatlangsungdianalisis. Padamakananternakditemukanbeberapa
macamasamamino,antaralail: asamaspartat,treonin,serin,asanlglutamat,
prolir, glisin,alanin,valin, isoleusin,leusin,fenilalanin,histidin, triptofan, lisin,
dan arginin.Prolin dan triptofan dapatdideteksihanyadengancaraderivatisasi
PROCEEDINGSITB Vol.20,No. I/2, 1987 51

It

/1
il

:
It

Gambar 4 Kromatogram yang diperoleh denganmenggunakanalat KCKT secaraderivatisasi

prakolomdari 5Opmol asamamino baku

Kondisi pemisahanuntuk gambar4

Kolom : ResolveTM 5/-rCl8

Fasegerak : Kondisigradien
t ; M e O H : T H F : H r O = 2 : 2 : 9 6 , y a n gm e n g a n d u n0g, 0 5 M
P e l a r uA
Na, HPO4dan 0.05 M Na-asetat; pH diatur sampai7,5 denganasamasetat.
t : M e O H: H " O = 6 5 : 3 5
P e l a r uB
 52 PROCEEDINCSnBVoL20, No. 112. 1987

Waktu Aliran %A %B Kurva

(m.nit) (ml/r|gnir)

Awal 0 100 0
2,@ 0,10 100 0 01
2,W r.50 r00 0 06
14,00 1,50 50 50 07
23.00 1,50 0 100 07
28,00 1,50 100 0 ll
35,@ 0 100 0 ll

Detektor tt4odel420 AC FluorecenceDerektor. g'

Catrtln:
Padakromatogram dalam gambar 4 tidak ditemukan prolin (asa.namino sekunder).
karena
derivatisasi hanyamungkinterjadiuntuk asamaminoprimersaja,Di sampingitu oleh karena
di sini tidak digunakanhipokrorit,makakepekaannya
akanrebihtinggidibandingkan dengan
caraderivatisasipascakolom.

pascakolom.Padamakanantemak ini tidak ditemukanasparagin. Hal ini mung-

kin disebabkanadanyadeaminasipadasaathidrolisismenladiasamaspartat(Z)
atau memangproteinnyii tidak mengandungasparagin.Denganmenggunakan
caradi atas,tanpamelakukanhidrolisissebelumnya, dalamcuplikanbir dike_
temukan juga beberapamacamasamamino seperti asamaspartat,asamgiu_
tamat, asparagin,serin,histidin, glisin,treonin,arginin,tirosin,metionin,valin,
isoleusin,leusin, dan prolin seperti terlihat padagambar6 dan 10. Demikian
pula pada cuplikan berem denganmenggunakan caraderivatisasipascakolom,
tanpa hidrolisis sebelumnyadapat dideteksiadanyaasamamino sepertiasam
aspartat, treonin, serin, asam glutamat, prolin. glis.in,alanin, sistein, valin,
metionin, isoleusin, leusin,tirosin, fenil alanin, histidin, dan arginin, s€perti
terlihat padagambar8.
Dalam bir ditemukan asparaginkarenatidak dilakukanhidrolisisdenganHCI
6 N sebelumanalisis,sehingga asparaginnya masihutuh, tidak mengalamidea-
minasi. Asparagin dan glutamin umumnya ditemukan pada cuplikan asam
aminoyang diperolehdenganmenghidrolisis protein secaraenzimatis(7).
Dalam pemisahanasamamino menggunakan KCKT ini, pengendalian pH dan
kepolaranfasegerakmudahdilakukandenganmengubahperbandilganvolume
2 larutan dapar atau fasegerakyang dapat diatur dengarsistemgradienkon-
tinu (bukan gradien bertahap),sehinggatidak mengganggu bentuk kromato-
gram.Dengandemikian dalam analisiskuantitatif,perhitunganluas puncak
kromatogrammenjadilebih teliti. Demikianpula penggunaan pereaksiOPA/2-
 PROCEEDINGS
ITB VoI.20;No. 1/2, T987 53

ME dan OPA/ESTH menyebabkan metode ini mempunyai kepekaan yang lebih

tinggi dan oleh karena reaksinya denganasa:namino spesifik dan selektif, maka
metodeini tidak banyak dipengaruhioleh gargguanmatriks.

23 menit

q,

Gamblr 5 Kromatogramyangdiperolehdenganmenggunakan
alat KCKT secaraderiyatisasi
prakolomdari 50 omol asamamino baku

Konditi p€mirahanuntuk gambar5

Kolom : ResolveTM 5t c18

Faseg e r a k : A : M e O H : T H F : H 2 O , 2 : 2 , 9 6 , y a n gm e n g a n d u 0n ,g0 5M N a 2 H P O 4
dan 0,05 M Na-asetat; pH diaturdenganasamasetatsampai7.5.
B : MeOH : H"O. 65 : 35
54 PRoCEEDINGS
ITB VoL20, No. 1/2, 1987

K o n d i sei l u s g
i radien:

t (menit) kec. aliran A (%) B (%) kurna

(ml/min)

awal 2,OO 95 5

2,OO 90 10 o
t5 2,OO 70 30 o
20 2,@ 70 30 6
25 2,OO 65 o
30 2,W 100 o 6
35 1,00 100 0 6
40 0.50 100 0 6
45 0,10 100 0 o

Volumesuntikan : 10 = l
Detektor : Fluoresen'4x
E m i s i 4, 2 5 n m
Eksitasi338 nm
rFF^''

iil

z
!

c
U)
Gambar6 Kromatogramdari cuplikanbir dengankondisiyangsamadengangambar2 secara
derivatisasi kolom
Dasca
 )
>1 >:
o-,a
i'i
2

ts;

85 menit
:

Gambar7 Kromatogramdari cuplikanmakananternakdengankondisiyangsamadengan *

gambar2, secaraderivatisasi
pascakolom
 PR0CEEDINGSrTB Vot. 20, No. I
/2, js8Z

a r_-_____ 85 menit ___

Gambar8 Kromatogram dari cuplikanberemdengan.unggunik"n
samadengangambar2, secara kondisiKCKT yang
derivatisasi
pascakolom

TJJ

I
I

o rl re
ILI 't,
ii i I
i\..---.---._;
r [-__________... vt-i
30 menit

Gambar9 Kromatogramdari cuplikanmakanan

ternakyangdiperoleh- derrgan
' menggunakan
KCKT secaraderivarisasiprakotom (kondisi ,urna
a"ng"n g";,U;, ai
 O

a.l

2
32 menit

L
Gambar 10 Kromatogramdari cuplikan bir yang diperoleh denganmerEgunakanKCKT
secaraderivatisasiprakolom (kondisi samadengangambar4)
PROCEEDINGS
nB VoI 20, No. I /2, 1987 59

KESIMPULAN

Analisis asam anrino dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT) dengan menggunakano-ftalaldehida/etantiolsebagaizat penderivati-
sasi, m:mpunyai beberapa keunggulan, yaitu: daya pisahnya tinggi karena
menggunakankolom yang sangatefisien,sertaditurdangoleh penggunaanper-
alatan yang baik; kepekaan tinggi, sehinggadapat digunakan untuk menganalisis
asm-asam amino dengan kadar yang rendah;waktu analisisnyasingkat, serta
tidak banyak dipengaruhi oleh matrils; pengendalianpH dan kepolaran fase
gerakmudah diatur denganmenggunakansistemgradienkontinu.

Derivatisasi asam amino dapat dilakukan dengan cara derivatisasi pascakolom

dan derivatisasiprakolom.
Cara derivatisasi pascakolom dapat digunakan untuk menganalisisasam amino
primer maupun asam amino sekunder, sedangkanderivatisasi prakolom hanya
dapat digunakan untuk menganalisis asam amino primer saja. Akan tetapi
saat ini cara derivatisasi pascakolom memerlukan waktu pemisahan yang lebih
lama dan kepekaannya relatif lebih rendah dibandingkan cara derivatiiasi
prakolom.

DAFTARPUSTAKA

Anderson,e/ d/., Remington's phanraceuticalssdence,lSth ed.1975.

Amino Acid Analysis System, Operator's Manual, Waters, The Liquid Chro-
m a t o g r a p h yp e o p l e .
Amino Acid Analysis, Liquid ChromatographyColumn, Care and Use Manual,
Waters,The Liquid ChromatographyPeople,Millipore.
Hill D., L. Burnworth, W. Shea and R. Preifer,Quantitative HPLC Analysisof
Plasma Amino Acids as o-Phtalaldehyde/ethanthiol Deivatives, J. Liq.
Chromatog.,5(12), ?369 - 93 (1982).
Hill D.. et al., Hieh PerformanceLiquid ChromatographyDetermination of
, n a l . C h e n . , 5 l , 1 3 3 8 ( 19 7 9 ) .
A m i n o A c i d s i n t h e P i c o m o l eR a n g eA

Pfeifer R. , ct a/., PracticalAppiication of HPLC to Amino Acid Analysis,lrre-

rican Laboratory',March, I 983.
S p a c k m a nD . H . , W . H . S t e i n ,a n d S . M o o r e , , 4 n a lA
. e m . , 3 O ,I 1 9 0 , 1 9 5 8 .
Wheler G. H. T. and J. T. Russel,Separationand Quantitation of oPhtalal-
dehyde DerivativesofTaurine and RelatedCompound in a High Performan-
ce Liq uid Chromatography (HPLC) System, J. Liq. Chromatog.. 4(7),
l 2 8 r - 1 2 9 1( l 9 8 1 ) .