LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

(Identifikasi dan Determinasi Sel Bakteri : Uji Biokimiawi )

Disusun Oleh :

Nama : Indah Kertawati

NIM : 098114039

Kelompok : B3

Tgl. Praktikum : 24 Maret 2010

Pj Laporan :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKUTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

2010
 ACARA V

IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI SEL BAKTERI: UJI BIOKIMIAWI

I. UJI BIOKIMIAWI
A. Tujuan :
Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat – sifat
biokimianya.

B. Dasar Teori:

Aktivitas – aktivitas enzimatis pada mikroba sangat berguna untuk

membedakan mikroba yng satu dengan mikroba yang lain. Atas dasar ini dapat
diketahui bahwa beberapa bakteri yang sangat erat kekerabatannya sering
dipisahkan dalam golongan yang berlainan dengan menguji kemampuan mirobia
tersebut untuk dapat mengadakan fermentasi sejenis hidrat arang. ( Tarigan, 1988)
Untuk mengidentifikasi bakteri dengan pengujian biokimia, diambil dari
koloni yang terpisah. Pengujian berdasarkan kerja hasil metabolisme yang
disebabkan oleh daya kerja enzim. Pengujian biokimia memerlukan berbagai
media untuk mendapatkan berbagai sifat mikroorganisme.

Tes Oksidasi, uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidasi sitokrom
pada mikroorganisme tertentu. ( Brock, 1979)

Test Katalase, Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian

hidrigen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen hidrogen peroksida yang
bersifat toksis terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel.
Pengujian katalase berguna dalam identifikasi kelompok bakteri tertentu. ( Lay,
1994)

Test O-F ( Oksidasi- Fermentasi ), Untuk menguji metabolism bakteri

oksidatif atau fermentatif. Oksidasi terjadi dalam tabung oleh organism aerob dan
fermentasi oleh organism anaerob. Pada fermentasi Glikosa akan diubah menjadi
glukosa G- Phospat yang kemudian dirombak menjadi asam piruvat. Begitu juga
oksidase akan merubah glukosa menjadi asam pirufat. ( Lay, 1994 )

Test penggunaan sitrat, uji ini digunakan untuk melihat kemampuan

mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon dan
energi. Untuk uji ini digunakan medium sitrat, koser, berupa medium cair atau
medium sitrat simon berupa medium padat. Bila organism mampu menghaasilkan
sitrat maka asam sitrat akan dihilangkan dari lingkungan sehingga Ph naik dan
suasana basa ( indikator beruah menjadi biru ) ( Lay, 1994)

Test Dekarboksilase lisin, Beerapa asma amino dapat didekarboksilase oleh

mikroorganisme. Dekarboksilase paling banyak terdeteksi adalah lisin, ornithin,
dan arginin. Dekarboksilasi melepaskan produk – produk yang netral, dan proses
ini dapat dideteksi secara langsung dengan menggunakan indicator PH seperti
bromocresol ungu yang berwarna kuning pada kondisi asam dan berwarna ungu
pada kondisi alkalis. ( Lay, 1994 )

Hidrolisis Gelatin, gelatin adalah suatu protein hewani bila digunakan

membentuk gel. Beberapa mikroorganisme dapat menguraikan gelatin sehingga
asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin
oleh mikroba dilakukan oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang
telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan sifatnya cair. Uji glikolisis gelatin
 dilakukan untuk mengidentifikasi Pseudomonas Flavobacterium, Serrana ( Lay,
1994 )

Pembentukan H2S, sulfur ditemukan pada berbagai senyawa seperti asam

amino sistein dan tiosulfat inorganik dapat direduksi menjadi gas H 2S oleh
beberapa mikroorganisme. Gas tersebut dapat dideteksi karena kemampuannya
dalam bereaksi dengan garam ferro untuk menghasilkan ferrous sulfida, suatu
endapan berwarna hitam. Biasanya digunakan untuk bakteri seperti salmonella,
Arizona, Edwardsiella, dan proteus.( Lay, 1994 )

Pembentukan Indol, indol adalah produk yang dilepaskan dari oksidasi

asam amino ripofan. Indol dideteksi pada medium kultur dengan menggunakan
dimetilaminobenzaldehid (warna keruh) digunakan untuk membedakan Eszhericia
( + ), dari eschericia ( - ) untuk mengkarakterisasi anggota genus bacillus ( Lay,
1994 )

Test Voges- Proskaver, pengujian ini digunakan untuk mengidentifikasi

mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butadianol. Bila bakteri
memfermentasikan karbihidrat menjadi 2,3-butadianol sebagai produk utama akan
terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Perubahan warna
diperjelas dengan menggunakan larutan alfa-naftol. Digunakan untuk memisahkan
klebsiella dan enterobacter (+), dari eschericia (-) untuk mengkarakterisasi anggota
genus bacillus ( Lay, 1994 )

C. Prosedur Kerja :

Akat dan Bahan :

 1. Isolat murni bakteri tanah sludge ( hasil percobaan acara III ) dalam NA
miring dan NB ( Nutrien cair )
2. Reagen untuk tes oksidase : Tetramethyl-paraphenyldiamine
3. Reagen untuk tes katalase : 10 % atau 30 % H2O2
4. Bahan untuk O- F yang mengandunng 0,5 – 1 % karbohidrat, paraffin cair
5. Bahan untuk test sitrat : simmons Citrate agar yang mengandung indicator
Brom Thymol Blue-BTB
6. Bahan untuk dekarboksilase Lisin : Media lysine iron agar ( LIA ) yang
mengandung Lysin dan indicator Brom Cresol Purple-BCP, media tanpa
Lysin
7. Media nutrient agar ( NA )
8. Gelatin
9. Media TSIA ( Triple Sugar Iron Agar )
10. Bahan untuk tes pembentukan indol : media Trypton Water, reagen
konvacs
11. Bahan untuk pembentukan : MR – VP, larutan 40 % KOH, larutan 5 %
alpha-naphthol
12. Buku Panduan Determinasi Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology ( Holt et al., 2000 )
13. Jarum Ose
14. Pipet volum steril

Cara Kerja :

1. Test Oksidase
Meletakan 2 – 3 tetes larutan tetrametyl – paraphenyldiamine pada kertas
saring
↓
 Mengambil isolate murni bakteri dalam nutien cair dan inokulasikan pada
kertas saring yang telah ditetesi reagen.
↓
Mengamatii dan laporkan hasil pengujian
↓
Terjadi reaksi positif jika timbul endapan berwarna ungu tua atau hitam
setelah didiamkan selama beberapa lama. Kadang kala perubahan warna
memakan waktu lebih lama sampai 10 – 30 menit. Membandingkan dengan
kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

2. Test Katalase
Meletakan 1 – 2 tetes larutan 10 % atau 30 % larutan H2O2 pada gelas benda
↓
Menambahkan 1 ose atau 2 – 3 tetes suspense isolate murni bakteri.
↓
Mengamati yang terjadi. Hasil positif ditandai dengan timbulnya buih seketika
↓
Membandingkan dengan kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )

3. Test O-F (Oksidasi – Fermentasi)

Menginokulasikan secara haati-hati isolate murni bakteri kedalam 4 tabung
berisi media O-F yang mengandung 0,5%-1% karbohidrat ( glukosa, laktosa,
manitol, maltose, atau sukrosa) secara tusukan.
↓
Menutup tabung I dengan paraffin lunak, tabung II tidak ditutup paraffin,
tabung III dan IV sebagai kontrol ( ditutup paraffin dan tidak ditutup paraffin
tanpa inokolasi bakteri)
 ↓
Mengamati setalah 24 jam pada suhu kamar
↓Membandingkan perlakuan dengan kontrol ( Terjadi oksidasi apabila
terbentuk warna kuning pada media O-F yang tidak ditutup paraffin, terjadi
pada mikroba aerobik. Terjadi fermentasi apabila terbentuk warna kuning
pada media O-F yang ditutup paraffin, terjadi pada mikroba anaerob)
↓
Membandingkan dengan kontrol ( Perhatikan perubahan warna media yang
terjadi dan indicator yang terkandung dalam media O-F )

4. Test Penggunaan Sitrat

Menginokulasikan isolate murni bakteri secara goresan menggunakan ose dan
secara secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons
Citrate Agar Miring.
↓
Kemudian menginkubasi selama 24 jam pada suhu kamar
↓
Membandingkan dengan kontrol ( perhatikan perubahan warna dari hijau
menjadi biru)

5. Test Dekarboksilase Lysin

Pada medium yang mengandung Lysin dan kontrol ( media tanpa lysine)
diinokulasikan secara tusukan dengan isolate murnii bakteri
↓
Menginkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Hasil positif jika terjadi
perubahan warna dari kuning, menjadi ungu dan kembali ke ungu, sementara
pada kontrol terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning.
6. Test Hidrolisis Gelatin
Menginokulasi isolate murni bakteri secara tusukan pada media yang
mengandung gelatin sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan.
↓
Menginkubasi elama 24 jam pada suhu kamar
↓
Memasukkan tabung perlakuan dan kontrol ( media tanpa inokulasi bakteri )
kedalam lemari es selama 30 menit. Terjadi hasil positif jika terjadi
pencairan.

7. Uji H2S dan Fermentasi Gula-gula

Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolate murni bakteri secara
goresan menggunakan jarum inokulasi.
↓
Meng inokulasi selama 24 jam. Pembentukan H2S ditunjukan dengan
terbentuknya endapan berwarna hitam.
↓
Perubahan arna media TSIA, dari merah menjadi kuning menunjukan adanya
fermentasi gula ( glukosa, sukrosa, laktosa)
↓
Mengamati juga terbentuknya gas yang ditandai dengan pecahnya media atau
terangkatnya media keatas.
↓
Membandingkan dengan kontrol ( media tanpa inokulasi bakteri.

8. Uji Indol
 Menginkubasi 1 tabung media Trypton Water dengan 2 tetes isolate murni
bakteri dan satu tabung media untuk kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )
↓
Menginkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.
↓
Setelah inkubasi, tiap-tiap tabung ditambah 5 mL larutan reagen konvacs.
Terbentuknya warna merah / merah muda pada lapisan larutan reagen
menunjukan terbentuknya indol.
↓
Membandingkan dengan kontrol

9. Test MR ( Methy Red )

Menginokulasikan isolate murni bakteri pada media MP-VP ( media Methy
Red – Voges Proskauer )
↓
Menginkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar.
↓
Menambahkan 5 tetes reagen metyl red kedalam tabung berisi media MR-VP.
↓
Mengocoknya dengan hati-hati. Hasil positif terjadi jika terbentuk warna
merah dalam 30 menit setelah penambahan reagen.
↓
Membandingkan dengan kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )

10. Test VP ( Voges Proskauer )

Menginokulasikan isolate murni bakteri pada media MR-VP
↓
Menginkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar
 ↓
Menambahkan 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%.
↓
Mengocok dengan hati-hati, melonggarkan tutupnya, dan kocok kembali,
ulangi setiap 5 menit.
↓
Mengamati perubahan warnanya setelah 30 menit. Tes menunjukan hasil
positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan
reagen.

II. DETERMINASI BAKTERI

Hasil – hasil pengujian dimasukan dalam daftar pengamatan yang disebut
Descriptive Chart. Untuk determinasi bakteri digunakan buku panduan
determinasi bakteri Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.