METODE-METODE ANALISIS EKSOPOLISAKARIDA 1. Ekstraksi eksopolisakarida (Emtiazi et.

al, 2004) Media pertumbuhan maksimum untuk produksi polisakarida Bahan Jumlah (gram/Liter) Sucrose (Merck 7653) 20 K2HPO4 (Merck 5104 ) 3.2 KH2PO4 (Merck 4873) 0.8 MgSO4. 7H2O(Merck 5886) 0.4 NaCl (Merck 6404) 0.2 FeSO4. 6H2O (Merck 3965) 0.02 Na2MoO4 (Merck 6521) 0.03 CaCO3 (Merck 2066) 0.05 * pH dibuat menjadi 7.2 Metode ekstraksi Bakteri EPS ditumbuhkan dalam medium produksi eksopolisakarida, shaker 200 rpm, 25 oC selama 5 x 24 jam. Sel bakteri disentrifuse pada 9000 rpm dengan 1 mM EDTA sebanyak 0.5 ml selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dan ditambahkan aseton (Merck 0014) dingin -4 oC dengan perbandingan 1 : 1, selanjutnya larutan disentrifuse 20.000 rpm selama 30 menit, untuk mengendapkan eksopolisakarida hasil presipitasi. Pembuatan 1 mM EDTA (Merck 8418) sejumlah 1 liter Sebanyak 0.37224 gram EDTA di tambahkan ke dalam 800 ml akuades di dalam labu takar. Tera labu tersebut sampai 1 liter. 2. Ekstraksi eksopolisakarida dengan CTAB (Modifikasi metode Yun & Park, 2003) Preparasi : bakteri ditumbuhkan dalam medium produksi eksopolisakarida, shaker 200 rpm, 25 oC selama 5 x 24 jam. Pisahkan kultur bakteri dengan sentrifuse 9000 rpm selama 10 menit. Pisahkan pellet, cuci dengan akuades dan disentrifuse kembali 14.000 rpm, 30 menit. Ekstraksi : biopolymer di dalam supernatant dipresipitasi menggunakan aseton dengan perbandingan 3 : 1, endapkan semalam. Selanjutnya disentrifuse 20.000 rpm selama 30 menit. Pellet hasil sentrifuse di cuci dengan etanol 70%, lalu keringkan (Vakum drier) untuk menghilangkan sisa etanol. Purifikasi : biopolymer yang telah kering, kembali dilarutkan ke dalam 1 ml akuades, dan dipresipitasi menggunakan CTAB 1% dengan perbandingan 1 : 1 lalu cuci dengan akuades, diikuti dengan presipitasi etanol di dalam larutan NaCl 10%. Cuci kembali dengan etanol. Kembali keringkan (Vakum drier) (Merck 2342) Pembuatan 1% CTAB/cethyl trimethyl ammonium bromide

Sejumlah 1 gram CTAB ditambahkan ke 50 ml akuades di dalam labu takar 100 ml. Tera dengan akuades sampai tepat 100 ml. Pembuatan etanol 70%. Pipet 70.14 ml etanol absolute (99.8%) ke dalam labu takar 100 ml. Tera dengan akuades sehingga tepat 100 ml. Pembuatan larutan NaCl 10% (Merck 6404). Sejumlah 10 gram NaCl dimasukan ke 50 ml akuades di dalam labu takar 100 ml. Tera dengan akuades sampai tepat 100 ml. 3. Preparasi eksopolisakarida untuk HPLC (Ghaly et.al, 2007) Eksopolisakarida hasil presipitasi dengan metode Emtiazi yang telah dikeringkan, dilarutkan ke dalam 3 ml akuades, lalu dihidrolisis dengan menambahkan asam sulfat 2 N (sehingga pH menjadi 2) lalu dididihkan (100 oC, selama 2 jam). Setelah sampel di dinginkan analisis dengan HPLC. Pembuatan asam sulfat (Merck 0732) 2 N Pipet 5.56 ml asam sulfat 98% (36 N, BJ asam sulfat 1,8 gram/ml) ke dalam labu takar yang telah berisi 80 ml akuades. Homogenkan larutkan kemudian tera sehingga tepat 100 ml.