PRAKTIKUM II

TEKNIK PENGECATAN

A. Tujuan
Menentukan Gram positiI atau Gram negative bakteri uji dan jamur uji.
B. Pendahuluan
Melihat dan mengamati mikroorganisme dalam keadaan hidup sangatlah sulit karena
sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna maka untuk dapat melakukan pengamatan di
bawah mikroskop cahaya diperlukan pewarnaan mikroorganisme dengan menggunakan
pewarna. Pewarnaan mikroorganisme pada dasarnya adalah prosedur mewarnai
mikroorganisme yang ingin kita amati (Pratiwi, 2008). Oleh karena itu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktiI dari pewarna yang disebut kromoIor. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan
adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Pewarna merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positiI dan ion negative yang
salah satunya berwarna(kromoIor). Bila kromoIor berada pada ion positiI maka disebut
sebagai pewarna basa dan bila kromoIor berada pada ion negative disebut pewarna asam.
Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negative
sehingga pewarna asam yang bermuatan negative ditolak oleh dinding sel maka sel tidak
berwarna dan yang terwarnai hanya bagian latar belakang spesimen. Pewarnaan negative
umumnya digunakan untuk mengamati kapsul bakteri. Contoh pewarna asam adalah tinta
cina, larutan Nigrosin, eosin, fuchsin acid an lain-lain. Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa
pewarna bersiIat positiI sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi
berwarna. Contoh pewarna basa misalnya metilen biru, Kristal violet, saIranin dan lain-lain.
Ada tiga macam prosedur pewarnaan yaitu:
a. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan yang hanya digunakan satu jenis pewarna dengan tujuan mewarnai
seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluller dan struktur dapat terlihat.
Pewarnaan ini biasanya digunakan untuk mengamati morIologi baik bentuk maupun
susunan sel. Biasanya suatu bahan kimia ditambahkan ke dalam larutan pewarna untuk
mengintensiIkan warna dengan cara meningkatkan aIinitas pewarna pada specimen
biologi. Bahan kimia tersebut adalah 247dant (penajam). Contoh pewarna sederhana
adalah ca7-4 fuchsin dan saIranin.
b. Pewarnaan diIerensial
Pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi yang
berbeda untuk setiap bakteri sehingga digunakan untuk membedakan dan
mengelompokkan bakteri. Pewarnaan diIerensial yang sering digunakan adalah pewarnaan
Gram yang digunakan untuk membedakan dua kelompok bakteri yang besar yaitu Gram
positiI dan Gram negative.
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatanyang dikerjakan di
laboratorium mikrobiologi untuk identiIikasi mikroorganisme. MorIologi mikroskopik
mikroorganisme yang diperiksa dan siIatnya khas terhadap pengecatan tertentu
(pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identiIikasi awal. Pemeriksaan ini dapat
dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta dapat memantu dokter untuk memulai
terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur pada beberapa kasus.
Pengecatan ini memerlukan beberapa komponen yaitu pewarna primer (primary
stain) yang mewarnai seluruh sel dengan warna ungu, contohnya adalah crysatal violet.
47dant yaitu penajam warna primer, contohnya adalah iodine. Dec447i:ing agent yang
digunakan untuk melunturkanwarna ungu pada sel, contohnya adalah alcohol dan pewarna
basa yang digunakan untuk mewarnai sel dengan warna merah, contohnya adalah saIranin.
c. Pewarnaan khusus
Pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai dan mengisolasi bagian spesiIik dari
mikroorganisme, misalnya endospora, kapsul dan Ilagella. Endospora bakteri tidak dapat
diwarnai karena memiliki selubung yang kompak sehingga zat warna sulit memenetrasi
dinding endospora, metode yang digunakan adalah pewarnaan SchaIIer-Fulton dengan
pewarna 2aachite g7een. Pada pewarnaan Ilagella digunakan kombinasi ca7-4 fuchsin
dan 247dant. Pada pewarnaan kapsul digunakan pewarna yang tidak dapat memenetrasi
kapsul bakteri sepeerti tinta cina, nigrosin dan C4ng4 Red.
Pada jamur pengamatan mikroskopik dapat dilakukan dengan preparat natiI (tanpa
pengecatan) yaitu dengan menggunakan larutan garam Iisiologis atau KOH 10-20 ataupun
dengan pengecatan. Seperti halnya bakteri ada tiga tipe pengecatan untuk mikroskopik jamur
yaitu:
a. Pengecatan sederhana
Pengecatan menggunakan lactophenol (LP) yang berwarna cokelat muda maupun
lactophenol cotton blue (LPCB) yang berwarna biru
b. Pengecatan diIerensial
O Pengecatan Gram, dimana semua jamur akan tercat Gram positiI
O Pengecatan ZN dimana semua jamur akan tercat ZN negatiI kecuali 4ca7dia sp.
O Pengecatan Gammormethanommy Silver Nitrat (GMS) yang akan member warna
hitam pada jamur dan hijau pada latar belakangnya
O Pengecatan Periodic Acid ShiIt (PAS) dimana jamur akan berwarna merahdan
kontrasnya akan berwarna kuning/hijau muda
O Pengecatan Brown Brenn dimana jamur akan bertambah coklat dan kontras latar
belakangnya akan berwarna kuning.
c. Pengecatan khusus
Seperti pada tinta cina untuk pengamatan kapsula yang akan menyebabkan kapsula
menjadi mengkilap dengan dasar hitam dan mucicarmine yang menyebabkan kapsula
berwarna merah. Pengecatan yang lain yaitu HE dan GIEMSA digunakan untuk
pemeriksaan jaringan (Astuti, 2011).
Pengecatan yeast pada pengamatan sel yeast secara mikroskopik pada dasarnya serupa
dengan pengecetan pada bakteri dan jamur. Pada yeast dikenal pula pengecetan sederhana dan
pengecetan khusus seperti halnya tujuan pengamatan spora yeast, pengamatan globula lemak dan
lain-lain. Contoh pewarna yang digunakan untuk melihat struktur sel yeast antara lain aniline
untuk melihat seluruh sel, besi hematoksilin untuk melihat nucleus, merah sudan untuk melihat
globuula lemak, kalium iodidan untuk melihat granula pati dan glikogen dan tinta india untuk
melihat kapsula (Astuti, 2011)
C. Alat dan Bahan
O Alat
a. Mikroskop
b. Kaca preparat
c. Kaca penutup
d. Spidol
e. Ose bermata
I. Bunsen
g. Pipet tetes
O Bahan
a. Biakan murni sche7ichia c4i dan Staphy4c4ccus au7eus
b. Minyak emersi
c. Cat Gram A (warna ungu)
Kristal violet 2 gr
Alcohol 96 30 ml
Ammonium oksalat 1 pada aqua 80 ml
d. Cat Gram B (warna cokelat)
Iodium 1 gr
Kalium Iodida (KI) 2 gr
Aquadest 800 ml
(larutan KI dalam air, kemudian ditambahkan iodium. Simpan dalam botol warna
cokelat).
e. Cat Gram C (tidak berwarna)
Aseto 30ml
Alcohol 96 70ml
I. Cat Gram D (warna merah)
SaIranin 1 gr
Alcohol 96 10ml
Aquadest 90ml
D. Cara kerja
Kaca preparat, kaca penutup dan tangan dibersihkan dengan alcohol. Ujung kaca preparat
diberi label dengan nama mikroba yang akan dicat. Di bawah kaca preparat digambar bulatan
berdiameter 1 cm dengan spidol, daerah lingkaran ini digunakan untuk pengecatan mikroba.
Kaca preparat dibalik sehingga gambar bulatan ada disebaliknya.

1 tetes aquadest diletakkan pada permukaan kaca preparat dalam daerah yang sudah
digambar. Sedikit biakan bakteri diambil dengan ose bermata secara aseptis dan dicampur
dengan aquadest pada kaca preparat. Suspense diratakan pada seluruh area bulatan.

Dikering anginkan sehingga membentuk noda

Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan kaca preparat pada nyala api beberapa kali tetapi
jangan sampai kaca preparat terkena api secara langsung

Preparat digenangi dengan cat Gram A selama 1-3 menit. Cat dibuang tanpa dicuci dengan air

Preparat digenangi dengan cat Gram B selama 1 menit. Cat dibuang dicuci dengan air
mengalir dan dikering anginkan

Preparat dimiringkan dan dicuci dengan cat Gram C dengan meneteskannya pada permukaan
noda sampai warna cat tepat dilunturkan (tidak berwarna) 30 detik

Dicuci dengan air mengalir secara singkat dan dikering anginkan

Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 2 menit. Cat dicuci secara cepat dengan air
mengalir dan dikering anginkan

Permukaan kaca preparat ditutup dengan gelas penutup dan diamati di bawah mikroskop
dengn perbesaran kuat dengan minyak imersi.






E. Hasil pengamatan

Nama mikroorganisme : Staphy4c4ccus au7eus
Perbesaran : 1000x
Bentuk : c4ccus (bulat)
Tipe koloni : staphy4c4cci (kumpulan buah anggur)
Warna : ungu
Kontras : pink
Jenis gram : Gram positiI

Nama mikroorganisme : sche7ichia c4i
Perbesaran : 1000x
Bentuk : -acii (batang)
Tipe koloni : -acius (tunggal)
Warna : pink keunguan
Kontras : putih
Jenis gram : Gram negative
F. Pembahasan
Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan Gram positiI dan Gram negative bakeri
uji dan jamur uji.
Pada praktikum kali ini digunakan teknik pewarnaan diIerensial yaitu pewarnaan Gram
yang ditujukan untuk membedakan bakteri Gram positiI dan Gram negative yang ditentukan
berdasarka reaksi atau siIat bekteri terhadap zat warna yang digunakan. Prinsip kerja dari
pewarnaan Gram adalah digunakannya pewarna primer, mordant, decolorizing agent dan
pewarna basa. Pewarna primer yang digunakan adalah crystal violet yang digunakan
memberikan warna ungu pada sel bakteri, mordant yang digunakan adalah iodine yang
digunakan untuk mempertajam warna pewarna primer, decolorizing agent yang digunakan
adalah aseton dan alcohol yang digunakan untuk menghilangkan warna pewarna primer pada
sel dan pewarna basanya adalah saIranin yang berIungsi memberikan warna merah pada sel
bakteri.
Mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus. Berikut adalah klasiIikasi masing-masing bakteri:
Escherichia coli
Staphylococcus aureus




KIasifikasi iImiah
KIasifikasi iImiah

Domain: Bacteria
Filum: Proteobacteria
Kelas: Gammaproteobacteria
Ordo: Enterobacteriales
Famili: Enterobacteriaceae
Genus: sche7ichia
Spesies: .4
Sumber:
hLLp//ldwlklpedlaorg/wlkl/Lscherlchla_coll
Domain: Bacteria
Kerajaan: Eubacteria
Filum: Firmicutes
Kelas: Bacilli
Ordo: Bacillales
Famili: Staphylococcaceae
Genus: Staphylococcus
Spesies: S. aureus
Sumber:
hLLp//ldwlklpedlaorg/wlkl/SLaphylococcus_aureus

Pertama kali yang dilakukan pada percobaan ini adalah membersihkan kaca preparat dan
kaca penutup dengan alcohol tujuannya adalah untuk menginaktiIkan mikroba sebgai
pencegahan kontaminasi bakteri lain. Lingkaran dibuat pada permukaan kaca preparat dengan
spidol kemudian satu tetes aquadest diteteskan pada kaca sebaliknya sebagai media tumbuh
mikroorganisme yang baru untuk pengecatan. Setelah itu diambil sedikit demi sedikkit biakan
bakteri dengan ose bermata lalu disuspensikan dan diratakan pada kaca preparat di daerah
dalam lingkaran. Hal yang perlu diperhatikan adalah pengambilan biakan bakteri yang harus
dilakukan secara aseptis yaitu dengan pemijaran ose bermata dengan Bunsen sebelum
digunakan untuk mengambil bakteri agar mencegah kontaminasi dari mikroorganisme lain
yang ada di udara dan lingkungan sekitarnya.
Kaca preparat segera dikeringanginkan kemudian dilakukan Iiksasi panas dengan
melewakan kaca preparat di atas nyala api tapi tidak sampai menyentuh apina. Tujuan Iiksasi
panas adalah untuk menguapkan pelarut sehingga bakteri melekat dan tidak mudah lepas dari
kaca preparat dan juga agar bakterinya mati sehingga bakteri dapat menyerap warna yang
selnjutanta bakteri siap untuk diwarnai.
Semua tahap pengerjaan dilakukan pada LAF (a2ining Ai7 F4) dan semua alat-alat
praktikum beserta tangan praktikan terlebih dahulu disemprot dengan alcohol sebelum masuk
LAF untuk mensterilkan dan mencegah kontaminasi dari mikroorganisme lain di udara dan
lingkungan sekitar.
Tahap pengecatan dimulai dengan menggenani preparat dengancat Gram A pada daerah
lingkaran selama 1-3 menit lalu dibuang cat tanpa dicuci dengan air. Cat Gram A ini
mengandung Kristal violet yang berguna untuk memberikan warna ungu pada sel sehingga cat
Gram A ini disebut dengan pewarna primer. Dari hasil tahap pengecatan ini, kedua preparat
(preparat sche7ichia c4i dan preparat Staphy4c4ccus au7eus) selnya berwarna ungu.
Kemudian adalah menggenangi preparat dengan cat Gram B selama 1 menit lalu dicuci sisa
cat Gram B dengan air mengalir dan kering anginkan. Cat Gram B mengandung iodium dalam
larutan iodium yang digunakan sebagai penajam warna ungu atau memIiksasi cat primer yang
diserap mikroorganisme target pada sel sehingga cat Gram B disebut dengan 247dant. Pada
tahap ini keedua preparat masih berwarna ungu dengan ikatan warna oleh bakteri lebih kuat.
Kemudian preparat dimiringkan dan dicuci dengan cat Gram C dengan cara meneteskannya
pada permukaaan noda sampai warna cat tepat dilunturkan (tidak berwarna) kurang lebih
selama 30 detik lalu cuci dengan air dan dikeringanginkan. Cat Gram C ini mengandung
alcohol yang digunakan untuk melunturkan warna ungu pada sel sehingga cat gram C disebut
juga dengan decolorizing agent. Pada hasil pengamatan, preparat sche7ichia c4i tidak
berwarna sedangkan Staphy4c4ccus au7eus masih berwarna ungu. Hal yang harus
diperhatikan adalah pemberian cat Gram C pada preparat jangan sampai berlebihan yang akan
mengakibatkan 4;e7dec447i:ati4n sehingga sel Gram positiI akan tampak seperti sel Gram
negative karena pewarna primer dan 247dant akan luntur tetapi juga jangan sampai terlalu
sedikit karena akan menyebabkan unde7c447i:ati4n yang tidak akan melarutkan pewarna
primer dan 247dant sehingga sel Gram negative akan tampak seperti sel Gram positiI. Tahap
pewarnaan terakhir adalah pemberian cat Gram D pada preparat dan didiamkan selama 2
menit lalu cuci secara tepat dengan air mengalir dan kering anginkan. Cat Gram D
mengandung saIranin sebgai pemberi warna merah pada sel. Pada tahap ini, preparat
sche7ichia c4i akan berwarna pink-merah sedangkan preparat Staphy4c4ccus au7eus tetap
berwarna ungu. Kemudian preparat diberi minyak emersi dan ditutup dengan kaca pentup lalu
diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000 kali.
Dari tahap akhir pengecetan, hasil pengamatan berupa preparat sche7ichia c4i berwarna
pink keunguan, hal ini mungkin 247dant yang diberikan kurang banyak sehingga tidak dapat
melunturkan pewarna primer dengn sempurna dan preparat Staphy4c4ccus au7eus berwarna
ungu sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa sche7ichia c4i termasuk bakteri Gram
negative sedangkan Staphy4c4ccu au7eus bakteri Gram positiI. Perbedaan yang terjadi
disebabkan oleh pada Gram positiI memilik banyak peptidoglikan yang tebal dan berada pada
lapisan terluar dari dinding selnya. Peptidoglikan memiliki aIinitas terhadap Kristal violet
sehingga semakin banyak peptidoglikan akan semakin tinggi aIinitasnya sehingga warna
violet yang terserap semakin banyak sednagkan pada Gram negative hanya memiliki sedikit
peptidoglikan yang merupakan lapisan tipis dan terletak di antara membarn sitoplasmik dan
membrane kedua yang disebut membrane luar yang disebut dengan daerah periplasmik
sehingga kristal violet mudah tercuci oleh alcohol dan aseton.
Pada dinding sel bakteri Gram positiI mengandung banyak lapisan peptidoglikan
(murein) yang membentuk struktur yang tebal dan kaku dan asam teikoat yang mengandung
alcohol (gliserol dan ribitol dan IosIat). Ada dua macam asam teikoat yaitu asam lipoteikoat
yang merentang di lapisan peptidoglikan dan terikat pada membrane plasma dan asam teikoat
dindingyang terikat pada lapisan peptidoglikan (Pratiwi,2008).
Pada dinding sel bakteri Gram negative mengandung satu atau beberapa lapis
peptidoglikan dan membaran luar. Terdapat daerah periplasma yaitu daerah yang terdapat di
antara membrane plasma dan membrane luar. Periplasma berisi enzim degradasi konsentrasi
tinggi serta protein-protein transport. Dinding sel bakteri Gram negative tidak mengandung
asam teikoat dan karenahanya mengandung sejumlah kecil peptidoglikan maka dinding sel
bakteri Gram negtiI ini relative lebih tahan terhadap kerusakan mekanis (Pratiwi, 2008).
(Pratiwi, 2008)
Perbedaan bakteri Gram positiI dengan Gram negatiI

Ciri-ciri bakteri Gram negative yaitu: (Hadiotomo, 1990)
a. Struktur dinding selnya tipis sekitar 10-15 nm, berlapis tiga atau multilayer
b. 10 dari berat kering, tidak mengandung asam teikoat dinding selnya mengandung
lemak lebih banyak (11-22)
c. Peptidoglikan terdapat pada lapisan kaku sebelah dalam dengan jumlah sedikit
d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya Kristal violet
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relative sederhana
I. Tidak resisten terhadap gangguan Iisik
Ciri-ciri bakteri Gram positiI yaitu: (Hadiotomo, 1990)
a. Struktur dindingnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal
b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal
c. Komponen utama merupakan lebih dari 50 berat ringan mengandung asam teikoat.
d. BersiIat lebih rentan terhadap penisilin
e. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna sepeti Kristal violet
I. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit
g. Lebih resisten terhadap gangguan Iisik
Kelebihan pengecatan Gram:
1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik,
sebelum tersedia bukti deIinitiI bakteri penyebab inIeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri
terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positiI dan negatiI mempunyai
kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.
2. Kadang-kadang morIologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik.
Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatiI diplococci intraseluler dari
spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan p7esu2pti;e diagn4sis untuk penyakit
inIeksi gonore.
Kekurangan pengecatan Gram:
Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih
dari 10
4
per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan
serebrospinal, memerlukan prosedur sentriIuge dulu untuk mengkonsentrasikan
mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentriIuge) kemudian dilakukan
pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.
Dari hasil pengamatan mikroskopik dengan perbesaran 1000 kali diketahui bahwa
sche7ichia c4i memiliki bentuk batang (-acii) dengan tipe koloni tunggal (-acius)
dan berwarna merah dengan kontras ungu sedangkan Staphy4c4ccus au7eus memiliki
bentuk bulat (c4ccus) dengan tipe koloni rantai seperti anggur (staphy4c4cci) dan
berwarna ungu dengan kontras kuning.
G. DaItar pustaka
Astuti, Puji, Indah Purwantini dkk. 2011. Percobaan II Teknik Aseptis dalam uku
Petunfuk P7aktiku2 ik74-i44gi Fa72asi. Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Fakultas
Farmasi Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. ik74-i44gi Dasa7 Daa2 P7aktek. Gramedia. Jakarta.
Pratiwi, Sylvia T. 2008. ik74-i44gi Fa72asi. Erlangga. Jakarta.
hLLp//ldwlklpedlaorg/wlkl/Lscherlchla_coll dlakses Langgal 29 november 2011
hLLp//ldwlklpedlaorg/wlkl/SLaphylococcus_aureus dlakses Langgal 29 november 2011


Yogyakarta, 30 November 2011
Praktikan



Desi Riza Pratiwi
10/304988/FA/08652