1.

A.

Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk : 1) 2) 3) 1. Mengisolasi protein dari tahu. Melakukan uji reaksi dari protein. Mengamati sifat-sifat dari protein. B. Landasan Teori

Protein (protos yang berarti paling utama) adalah senyawa organik kompleks yang mempuyai bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Jika bobot molekul senyawa lebih kecil dari 6.000, biasanya digolongkan sebagai polipeptida. Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi oleh manusia. Seperti pada tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Secara umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh. Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein. Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat. Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik yang melibatkan gugus R-nya. Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut : asam amino non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin, Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya. Protein tersusun atas asam-asam amino melalui ikatan peptide, yaitu ikatan antara gugus karboksil (-COOH) dan gugus amina (-NH2). Oleh karena itu protein juga disebut polipeptida. Ikatan yang terjadi pada protein selain ikatan peptide antar asam-asam amino penyusunnya, juga terjadi ikatanikatan yang lain. Misalnya, ikatan hydrogen yang terjadi pada gugus N-H dan pada gugus O-H, ikatan disulfide yaitu

S S menyokong terjadinya ikatan yang kompleks pada protein. Ikatan ion pada protein juga terjadi bila di dalamnya terdapat gugus ion logam, dan ikatan koordinasi, misalnya ikatan koordinasi antara ion Fe 3+ dengan hemoglobin pada darah. Protein : H2O H+ { NHCHC NHCHC } R R Kalor

H2NCHCO2H + H2NCHCO2H + .. R R

a) b) c)

Sifat-sifat protein : Protein sukar larut dalam air Karen ukuran molekulnya yang sangat besar. Dapat mengalami koagulasi oleh pemanasan, penambahan asam atau basa. Bersifat amfoter karena membentuk zwitter ion, pada titik isoelektriknya protein mengalami koagulasi sehingga

dapat dipisahkan dari pelarutnya. d) Protein dapat mengalami kerusakan (terdenaturasi) oleh pemanasan. Pada denaturasi protein dapat mengalami kerusakan mulai dari kerusakan struktur primernya sampai pada struktur tersiernya. Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsinya, setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milie. Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya. Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu :

Memisahkan sel dari jaringannya. Menghancurkan membrane sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya.

Memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya. Isolasi protein yaitu memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu
dan protein dari protein lain lain yang tidak diinginkan dalam analisa. Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya pemisah terendah seperti pengendapan dengan ammonium sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi olah berbagai factor antara lain jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperature larutan. Pemurnian Protein Pemurnian protein dilakukan untuk mempelajari sifat dan fungsi protein. Pemisahan dilakukan berdasarkan ukuran, kelarutan, muatan dan afinitas ikatan. 1. 1. Cara Dialisis

Pemisahan berdasarkan ukuran molekul melalui selaput semipermiabel, dimana molekul-molekul dengan berat molekul lebih besar dari 15.000 akan tertahan dalam kantong dialysis. Sedangkan molekul yang berukuran lebih kecil dan juga ion-ion akan melewati pori-pori selaput semipermiable tersebut keluar dari kantong dialysis. 1. 2. Cara Kromatografi Filtrasi Sel

Pemisahan berdasarkan ukuran molekul. Prinsipnya, larutan dialirkan dari atas kolom yang berisi butir-butir gel yang terdiri dari karbohidrat berpolimer tinggi. Butir-butir tersebut dikenal sebagai sephadex. Molekul-molekul berukuran kecil dapat masuk ke dalam butir-butir sephadex. Sedangkan yang berukuran besar tidak. Karena itu terjadi pemisahan. Molekul-molekul kecil berada dalam larutan butir-butir sephadex diantara butir-butir sephadex. Karena molekul-molekul besar akan turun lebih cepat, maka molekul-molekul besar terelusi atau keluar terlebih dahulu. 1. 3. Cara Kromatografi Pertukaran Ion

Pemisahan berdasarkan muatannya. Bila sebuah protein mempunyai muatan positif pada pH 7, ia akan terikat pada kolom penukar ion yang berisi gugus yang bermuatan negative. Sedangkan protein yang bermuatan negative tidak. Protein bermuatan positif yang terikat dalam kolom dapat dielusi dengan penambahan garam NaCl atau garam lain pada larutan buffer yang digunakan untuk elusi. Ion Na+ akan berkompetensi dengan protein untuk berikatan dengan gugus pada kolom dan secara bertahap ion Na+ akan menggantikan kedudukan protein. 1. C. Alat dan Bahan 2.

1.

Alat : Tabung reaksi + rak dan penjepit Gelas ukur 50 mL Pipet ukur 1 mL Gelas kimia 100 mL Pembakar bunsen Bola hisap Pipet tetes Corong Bunchner Erlenmeyer bertutup Penjepit tabung Kaca arloji Bahan : Tahu/ampas tahu Kertas saring Larutan KOH 5% Larutan CuSO4 1% Larutan NaOH 6N Larutan HCl 6N Larutan HgCl 1% Larutan Pb-asetat Larutan HNO3 pekat Aquadest Alcohol 95% Indicator metal merah D. Cara kerja Isolasi protein dari tahu dan 100 mL

10 buah 3 buah 1 buah 1 unit 2 buah 2 buah

1. 1) 1. 2.

Tahu (ampas tahu) yang segar dikeringkan pada temperature yang tidak terlalu tinggi, kemudian digerus hingga halus. Tahu yang sudah digerus ditimbang sebanyak 15 gram, kemudian dimasukan kedalam labu Erlenmeyer 250 mL dan ditambahkan 60 mL aquadest dan 30 mL KOH 5%. Kemudian labu ditutup dan dikocok selama 45 menit.

3.

Larutan disaring dengan kain, kedalam filtrat tersebut ditambahkan tetes demi tetes larutan HCl hingga pH larutan menjadi 4,3.

4.

Setelah itu filtrate dipanaskan selama 10 menit. Kemudian disaring dengan corong Buchner. Setelah itu endapan dipindahkan kedalam gelas arloji yang telah ditimbang. Endapan kemudian dikeringkan didalam oven pada 100 untuk menghilangkan air. Setelah itu endapan ditimbang. Reaksi-reaksi protein

2) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 1)

Kedalam 1 mL larutan protein ditambahkan beberapa tetes alcohol 96%. Kedalam 1 mL larutan protein ditambahkan 1 mL larutan NaOH 6N kemudian dipanaskan dengan hati-hati, bau gasnya dicium dan larutannya diuji dengan kertas lakmus. Kedalam 1 mL larutan protein ditambahkan 1 mL larutan NaOH 6N dan beberapa tetes Pb-asetat, kemudian dipanaskan. Kedalam 1 mL larutan proteinditambahkan 1 mL larutan CuSO4 1% dan beberapa tetes larutan NaOH 6N. Kedalam 1 mL larutan protein ditambahkan 1 mL HgCl2 1% (reagen Millon). Kedalam 1 mL larutan protein ditambahkan larutan HNO3 pekat. Larutan dipanaskan kemudian setelah dingin ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 6N sambil dikocok. E. Data Percobaan Isolasi protein dari tahu : 15,07 gram : 84,3840 gram : 0,7832 gram : 89,5760 gram : c (a+b)

Berat tahu Berat kaca arloji (a) Berat kertas saring (b) Berat protein+kertas saring+kaca arloji (c) Berat protein : 89,5760 (84,3840 + 0,7832) : 4,4088 gram Kadar : x 100% : 29, 25% 2) Reaksi protein Pereaksi yang ditambahkan kedalam larutan protein Alcohol 96%

: x 100%

Pengamatan

No. 1.

Terbentuk larutan putih seperti susu (suspensi). Terbentuk larutan beda fasa. Setelah dipanaskan terbentuk larutan kuning dan membirukan kertas lakmus

2.

NaOH 6N

merah (tidak larut) Saat ditambahkan NaOH terbentuk larutan beda fasa, setelah ditambahkan Pb-asetat terbentuk endapan putih,

3.

NaOH 6N + Pb-asetat

setelah dipanaskan terbentuk endapan yang berwarna

hitam. Saat ditambahkan CuSO4 terbentuk suspense berwarna biru kehijauan, setelah ditambahkan NaOH larutan 4. 5. Larutan CuSO4 1% + NaOH 6N Larutan HgCl2 1% menjadi berwarna ungu. Larutan berwarna putih seperti susu. Saat ditambahkan HNO3 terbentuk suspense berwarna 6. Larutan HNO3 pekat + NaOH 6N putih, setelah dipanaskan dan ditambah NaOH terbentuk endapan merah muda. PEMBAHASAN Protein merupakan suatu senyawa organik yang terdiri dari kumpulan asam-asam amino, dimana setiap asam amino terdiri dari gugus amino, sebuah gugus karboksil dan sebuah atom hidrogen dan gugus R yang terikat dengan atom C yang dikenal sebagai karbon , serta gugus R merupakan rantai cabang. Gambar Struktur Asam Amino H N H C R H C OH O

(gambarnya tebak sendiri yah) Dalam percobaannya telah dilakukan analisis terhadap senyawa protein itu. Diantaranya analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif yang dilakukan untuk mengetahui reaksi identifikasi protein dalam dan kereaktifan dari protein. Sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui banyaknya kandungan protein dari suatu sampel. 1. 1. Isolasi Protein Pada Sampel Tahu.

Merupakan analisis kuantitatif untuk mengetahui perbandingan jumlah protein dalam sampel. Pertama-tama sampel dikeringkan bertujuan agar kadar air dalam sampel berkurang karena air dalam sampel dapat mengencerkan preaksi yang digunakan sehingga preaksi tidak sesuai dengan yang seharusnya (terencerkan oleh air yang terdapat dalam sampel). Setelah dikeringkan sampel ditambahkan air, dan basa alkali. Bila suatu protein dihidrolisis dengan asam, alkali atau enzim akan dihasilkan campuran asam-asam amino. Dalam praktikumnya digunakan NaOH sebagai alkali yang ditambahkan yang berfungsi untuk memisahkan dalam asam amino dalam sampel. Kemudian didiamkan selama 45 menit berfungsi mengoptimalkan proses hidrolisis sehingga asam amino pecah dan terpisah dari sampel. Karena protein yang telah terhidroslisis strukturnya berubah maka ikatan rantai polipeptida pada protein mengalami kerusakan inilah yang dinamakan proses denaturasi. Denaturasi dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap stuktur sekunder,tersier dan kuartener tehadap molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan kovalen. Pada praktikumnya setelah ditambahkan basa alkali kemudian ditambahkan asam hingga pH berada pada pH 5 ini berfungsi untuk melarutkan ekstrak selain protein, dan juga berfungsi untuk pemekaran dan pengembangan molekul protein yang terdenaturasi akan membuka gugus reaktif yang ada pada rantai polipeptida selanjutnya akan terjadi

pengikatan kembali pada gugus reaktif yang sama atau berdekatan, dan bila unit tersebut banyak protein tidak terdispersi lagi sebagai koloid maka protein tersebut mengalami koagulasi, dan dari praktikum telah didapat koagulasi dari protein tersebut dan setelah di hitung beratnya telah didapat protein seberat 4,4008 gram. 1. 2. Reaksi Reaksi Pada Protein

A. Reaksi protein dengan alkohol. Reaksi ini untuk membuktikan kelarutan protein dalam alkohol. Karena protein sangat banyak jenisnya. Dan menurut kelarutannya protein dibagi kedalam beberapa kelompok; albumin, globulin, glutelin, prolamin, histon, dan protamin. Yang masing-masing dari jenis protein tersebut memilki kelarutan yang berbeda-beda dalam setiap pelarut. Dan pada sampel yang di uji reaksi protein adalah sampel putih telur yang tergolong jenis albumin karena sampel tersebut larut dalam air dan terkoagulasi oleh pemanasan. Dan ketika ditambahkan oleh alkohol 95% sampel berubah warna menjadi berwarna putih seperti endapan, hal ini terjadi karena koloid-koloid protein pada sampel mengalami koagulasi. 1. Reaksi Protein dengan Basa. Protein albumin telur tidak terhidolisis dalam basa, ini terbutkti ketika basa (NaOH) ditambahkan pada sampel, tidak terbentuk suspensi berwarna putih, melainkan hanya terbentuk larutan yang berbeda fasa. Dan setelah dipanaskan larutan albumin tersebut berubah menjadi sepeerti timbul endpan putih ini membuktikan bahwa albumin terkoagulasi oleh panas (tidak tahan panas yang tinggi) dan ketika diamati larutan sampel yang tadinya berwarna bening berubah menjadi kuning terang ini disebabkan karena adanya reaksi ion Na dalam basa bereaksi dengan asam amino, dan asam amino memutuskan ikatan terhadap atom H nya sehingga terjadi reaksi seperti berikut: H N H C R H C O + NaOH OH NH2 H- C COONa R +H2O

(gambarnya tebak sendiri yah) 1. Uji Reaksi Timbal Asetat Dalam suatu protein terdapat beberapa unsur diantaranya C,H,N,O. Bahkan beberapa jenis protein memiliki unsur S dalam senyawanya. Fungsi dari uji timbal asetat ini adalah mengidentifikasi apakah dalam protein ini terdapat unsur S atau tidak. Dan dalam praktikumnya dalam albumin telur yang diuji ternyata protein dari telur tersebut mengandung unsur S. Ini terbukti ketika sampel ditambahkan Pb-Asetat, pada sampel timbul endapan Hitam PbS. Karena endapan PbS stabil dalam suasana basa makan sebelumnya sampel harus dikondisikan dahulu dalam suasana basa oleh NaOH. 1. Uji Biuret ( CuSO4 dalam NaOH)

Pada praktikum sampel ditambahkan NaOH terlebih dahulu kemudian sampel protein tersebut ditambahkan CuSO4. Kedua preaksi tersebut adalah preaksi Biuret. Fungsi dari penambah preaksi biuret ini untuk mendeteksi ada atau tidaknya ikatan peptida dalam suatu sampel. Karena ada tidaknya suatu protein dalam suatu sampel dapat dilihat apakaha ada tidaknya ikatan peptida dalam sampel tersebut. Dengan kata lain suatu protein pasti memilkik ikatan peptida. Ikatan peptida adalah ikatan yang menghubungkan antara asam amino satu dengan asam amino lainnya. Ikatan ini terjadi antar atom N pada suatu asam amino dengan atom C pada asam amino lain yang mengikat atom O. Reaksi yang terjadi pada uji biuret adalah:

Ikatan peptida tersebut membentuk senyawa kompleks yang berwarna ungu dengan ion Cu 2+ pada larutan CuSO4 dalam basa. Namun reaksi pada zat organik umumnya bereaksi sangat lambat sehingga perlu pemanasan dalam proses reaksinya. 1. Uji Pengendapan dengan Ion Logam Pada larutan protein yang akan diuji, pereaksi yang ditambahkan adalah HgCl 1% (reagen millon). Pengujian ini digunakan untuk menguji atau mengidentifikasi adanya senyawa protein yang memiliki gugus fenol seperti tiroksin. Saat percobaan, penambahan pereaksi millon terhadap larutan protein menghasilkan larutan berwarna putih pada bagian atas, gumpalan putih dibagian tengah, dan larutan berwarna kuning pudar pada bagian bawah. Ini menunjukan bahwa reaksi negatif. Secara literatur, reaksi positif akan didapatkan bila pereaksian tersebut menghasilkan endapan putih. Reaksi yang terjadi adalah : H H

2R C C O- + 2Hg2+ 2R C C O Hg H NH2 Endapan Hitam (gambarnya tebak sendiri yah) Reaksi (negatif) artinya di dalam senyawa protein tersebut tidak mengandung fenol. Pada dasarnya reaksi ini akan positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. 1. Uji Xantoprotein

Dalam praktikum larutan sampel terlebih dahulu direaksikan dengan dengan asam nitrat kemudian ditambahkan NaOH. Ini lah yang disebut dengan uji Xantoprotein. Fugsi dari uji xantoprotein ini adalah untuk mengetahui ada atau tidaknya gugus benzena dalam sampel protein. Karena protein merupakan senyawa yang kompleks maka beberapa jenis protein memiliki gugus benzena didalamnya. Mekanismenya adalah proses nitrasi langsung dari asam nitrat terhadap gugus benzen pada protein. Apabila dalam suatu protein terdapat gugus benzena maka reaksi ditandai dengan perubahan warna sampel menjadi orange setelah penambahan NaOH (basa), biasanya warna timbul dan berada diantara lapisan NaOH dan sampel protein. Didalam literatur protein pada putih terlur (albumin) memiliki gugus benzen. Namun pada praktikumnya, data pengamatan yang didapat setelah melalui proses nitrasi sampel protein berubah warna menjadi berwarna merah muda (pink). Ini terjadi karena adanya kemungkinan preaksi yang rusak atau adanya kontaminan pada preaksi sehingga warna yang timbul menjadi merah muda. Reaksi yang terjadi adalah : H H H NCC=O CH2 OH NO2 Kuning (gambarnya tebak sendiri yah) 1. F. Kesimpulan HCN OHNO2

+ HNO3 NH2-

Jingga

Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa:

1. 2. 1.

protein pada putih telur tergolong jenis protein albumin yang merupakan gabungan beberapa asam amino yang sangat kompleks. Didalamnya terdapat ikatan peptida, gugus benzena, dan berikatan dengan atom S. Dari hasil isolasi protein telah didapat bahwa kadar protein dalam sampel berada disekitar 29, 25% G. Daftar Pustaka

Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia, Jakarta. Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy Thenawidjaya. Erlangga, Jakarta.