Peptida RVG-9dR memungkinkan pengiriman pada siRNA untuk makrofag dan sel mikroglia in vivo Untuk menguji dalam

pengiriman vivo, pertama kita menentukan apakah yang mengikat peptida RVG untuk makrofag dan sel mikroglia in vivo. Kami disuntikkan peptida RVG-FITC intravena (iv) dalam jenis liar dan tikus ACHR KO dan setelah 1 jam, diuji dengan serapan FITC pada CD11b + sel-sel di dalam limpa, darah, dan sel otak.Seperti terlihat pada histogram overlay (panel atas) dan intensitas rata-rata pergeseran neon (panel bawah) pada Gambar 2a, CD11b gated sel dari jenis lain tetapi pada pengujian di tikus KO di dapat hasil FITC positif, menunjukkan bahwa iv yang peptida disuntikkan mampu mengikat sel ACHR-bearing in vivo. pengikatan itu tidak setinggi seperti yang terlihat dalam studi in vitro pada Gambar 1 mungkin karena pengaruh dilusi pada peptida yang beredar (hanya 50 mg peptida disuntik sekali) serta kecenderungan peptida pendek yang akan cepat dibersihkan oleh filtrasi glomerulus.Selanjutnya, dilakukan uji untuk pengiriman pada RNA dan mengikat gen di CD11b + sel in vivo menggunakan peptida RVG-9dR. Untuk ini, tikus disuntik dengan cyclophilin B (CyPB) siRNA (CyPB) dikomplekskan dengan iv RVG9dR Setelah 24 dan 48 jam pengobatan siRNA, CD11b + makrofag dan sel mikroglia yang immunomagnetically diisolasi dari limpa dan otak, masing-masing. Untuk konfirmasi pengiriman, kecil fraksi RNA diisolasi dari CD11b sel yang dipilih dari limpa dan otak diuji keberadaan CyPB siRNA oleh reverse transkripsi kuantitatif (RT)PCR menggunakan primer CyPB siRNA spesifik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, kita bisa mendeteksi keberadaan siRNA hanya di siCyPB/RVG-9dR disuntikkan tikus tapi tidak dalam uninjected dan siLuc/RVG-9dR disuntikkan tikus. Konsisten dengan ini, CyPB gen juga efektif dibungkam setelah melahirkan siRNA RVG-9dR-mediated, yang diukur dengan kuantitatif RT-PCR dari RNA total diambil dari CD11b + sel dari limpa dan otak (Gambar 2c). Dalam percobaan serupa, i.v. suntikan siRNA CyPB telanjang tidak menimbulkan membungkam gen yang menyatakan bahwa tidak makrofag nonspesifik mengambil siRNA.

(GambarS2) 9dRRVGdimediasi dalampemberian siRNA vivo dalam makrofag dan sel mikroglial.(a) Mencit i.v. disuntik dengan RVGFITC dan serapan FITC oleh CD11b + sel dilimpa, da rah perifer, dan otak ditentukan oleh aliran cytometry 1jam setelah penyuntikan. Histogram Perwakilan (panel atas) dan data kumulatif (panel bawah) daridua percobaan independen dengan tiga tikus masing-masing yang akan ditampilkan. Nilai Mean dinormalisasi untuk mengontrol. Gray, tikus wild type tanpa injeksiRVGFITC, hitam, tikus wild type disuntik dengan RVG-FITC; merah, tikus yang disuntik dengan KO ACHR RVG FITC. Kesalahan bar menunjukkan SD; * P <0,05. (b,c) Mencit i.v. disuntik dengan cyclophili n B siRNA (siCyPB) dikomplekskan denganRVG9dR dan + CD11b makrofag dan sel mikroglia yang immunomagneticallydiisolasi dari limpa danotak 24 dan 48 jam setelah perawatan siRNA dan diuji untukkehadiran (b) siRNA spesifik dan (c) cyclophilin B ge n membungkam oleh QRTPCR.Nilai Mean dinormalisasi untuk U6B snRNA di b dan u ntuk aktin dandinyatakansebagai persentase tidakmemilikikontrol siRNA di c. ND, tid ak terdeteksi. Kesalahanbar menunjukkan SD; * P <0,05. ACHR, reseptor asetilkolin; F ITC, fluoresceinisothiocyanate QRT-PCR, kuantitatif reverse transcription PCR; RVG, glikoproteinvirus rabies, siRNA, RNA campur kecil