Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba Percobaan 06 Restriksi DNA

Nama NIM Tgl. Percobaan Tgl. Pengumpulan Kelompok Asisten

: Ridwan Muhamad Rifai : 10408040 : 14 Oktober 2010 : 21 Oktober 2010 :6 : Rahma

Program Studi Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung 2010

1. Tujuan a. Merestriksi suatu fragmen insert dengan panjang 750 bp dari vektor pGEMTEasy dengan enzim restriksi EcoRI

2. Metode Dalam ilmu rekayasa biologi molekuler dikenal suatu metode yang disebut dengan restriksi DNA. Restriksi DNA adalah proses pemotongan DNA baik untai ganda maupun untai tunggal dengan menggunakan enzim DNA restriksi (DNA nuklease) pada sisi spesifik yang dikenal sebagai sisi pengenalan (recognition site). Pada organisme, enzim ini digunakan untuk mendegradasi fragmen DNA asing yang masuk ke dalam sel, misalnya DNA virus. DNA organisme itu sendiri aman dari proses restriksi karena mengalami proses metilasi. (Lodish, 2004)

Enzim restriksi mengenali sisi restriksi dari urutan nukleotidanya yang cocok. Sisi restriksi ini kebanyakan dan hampir semuanya bersifat palindrom yaitu sama baik dari forward maupun reverse.

Palindrom pada DNA

Sistem palindrom ini akan menimbulkan pemotongan yang bersifat sticky end. Namun ada pula enzim restriksi yang memotong sisi pengenalan sebagai blunt end.

Saat ini dikenal empat jenis enzim nuklease restriksi. Keempat jenis enzim ini digolongkan berdasarkan pada komposisi, jenis kofaktor, target DNA yang akan dipotong, dan posisi sisi aktif enzim relatof terhadap target DNA. Keempat jenis enzim tersebut adalah a. Tipe I, enzim membelah di lokasi terpencil dari sisi pengenalan, membutuhkan baik ATP dan S-adenosyl-L-methionine berfungsi; protein multifungsi dengan aktivitas restriksi dan metilasi b. Tipe II, enzim bersatu dalam atau pada jarak tertentu dari sisi pengenalan, paling membutuhkan magnesium, fungsi tunggal enzim tidak bergantung metilasi

c. Tipe III, enzim membelah di lokasi jauh dari sisi pengenalan, membutuhkan ATP (tetapi tidak menghidrolisisnya), S-adenosyl-L-metionin merangsang reaksi namun tidak diperlukan, ada sebagai bagian dari kompleks modifikasi metilasi d. Tipe IV, enzim menarget DNA termetilasi (Bickle,1993)

Pada praktikum ini akan dilakukan restriksi terhadap plasmid pGEMT-Easy dengan memanfaatkan sisi pengenalan pada EcoRI. Karena itu digunakan enzim restriksi yang khusus akan memotong sisi pengenalan EcoRI. Bahan-bahan yang digunakan adalah sebagai berikut. Buffer EcoRI Enzim EcoRI Deion Plasmid DNA

Kesemua bahan tersebut dicampur dalam tube dan diinkubasi semalaman dalam es.

Selanjutnya larutan tersebut dielektroforesis dengan terlebih dahulu ditambahkan loading dye. Selain itu sebagai pembanding, dielektroforesis pula plasmid uncut, yaitu plasmid yang belum direstriksi. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100V selama 45 menit. Hasil elektroforesis akan menunjukan apakah plasmid terestriksi atau tidak dilihata dari ukuran band yang terdeteksi.

3. Hasil Pengamatan Pada saat pencampuran dan setelah inkubasi tidak ada suatu indikator pun yang dapat terlihat dari tube, misalnya perubahan warna yang mengindikasikan restriksi telah selesai. Karena itu digunakan elektroforesis untuk mendeteksi apakah restriksi berjalan atau tidak. Berikut adalah gambar hasil elektroforesis.

5 cut

5 uncut

6 cut

6 uncut

7 cut

7 uncut

8 cut

8 uncut

5C 5U 6C 6U L 7C 7U 8C 8U

Keterangan: : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 5 : Hasil Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 5 : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 6 : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 6 : Ladder : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 7 : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 7 : Hasil Elektroforesis plasmid cut Kelompok 8 : Elektroforesis plasmid uncut Kelompok 8

4. Pembahasan Pada praktikum ini dilakukan pemotongan fragmen DNA target dari plasmid pGEMTEasy dengan menggunakan enzim restriksi yang memiliki sisi pengenalan pada fragmen EcoRI. Larutan restriksi ini kemudian dielektroforesis untuk mengetahui keberhasilan proses. Fragmen yang berhasil direstriksi akan tampak dalam elektroforesis dan menunjukan band lebih pendek dari band plasmid yang panjangnya sekitar 3018 bp.

Plasmid yang digunakan dalam percobaan ini adalah plasmid pGEMT-Easy. Plasmid ini memiliki banyak sisi pengenalan spesifik, salah satunya adalah EcoRI. Berikut adalah gambar dari pGEMT-Easy.

Terlihat dari gambar di atas ada dua buah sisi pengenalan EcoRI sehingga dengan penambahan enzim restriksi ini maka akan terisolasi fragmen insert yang berada di tengah-tengah kedua sisi pengenalan EcoRI ini. Enzim EcoRI memotong DNA dengan menghasilkan sticky end, yaitu pemotongan yang tak hanya memotong ikatan fosfodiester dari DNA namun juga ikatan hidrogennya sehingga akan menghasilkan ujung yang reaktif dan dapat menempel dengan ujung sticky end lainnya. (Clark,2005)

Untuk mengetahui keberhasilan restriksi maka dilakukan elektroforesis. Ada duam amcam plasmid yang dielektroforesis, yaitu plasmid yang direstriksi (cut) dan tidak direstriksi (uncut). Secara teori maka plasmid yang dicut akan menghasilkan dua buah band, yaitu band plasmid dan band insert. Sedangkan plasmid uncut hanya

akan menghasilkan satu buah band yang menunjukan band plasmid itu sendiri. Karena plasmid berasal dari praktikum sebelumnya yaitu ligasi, maka dapat diketahui panjang fragmen DNA insert yaitu sebesar 750 bp. Bila plasmid cut benar benat terestriksi maka akan ada band 3015 bp dan 750 bp. Sedangkan plasmid uncut akan menghasilkan band dengan besaran 3715 bp.

6C

6U

Dari hasil pengamatan terlihat bahwa pada plasmid cut menghasilkan tiga buah band serta smear. Terdeteksi band dengan besaran 3000 bp yang mengindikasikan band plasmid namun tidak ada band 750 bp, yang ada hanya smear. Ada pula band di atas band 3000 bp. Hal ini dapat dijelaskan karena plasmid memiliki bentuk yang berbeda-beda, ada yang linear, open circular, superkoil, dan lainnya. Band yang berada di atas band 3000 bp diasumsikan adalah band yang memiliki konformasi open circular sedangkan band yang berada di bawah band 3000 bp diasumsikan memiliki konformasi superkoil. Bentuk-bentuk plasmid memengaruhi kecepatan geraknya dalam menembus gel karena perbedaan sisi kontaknya.

Pada plasmid uncut terlihat adanya dua band, yaitu band 3000 bp dan band di atasnya. Band 3000 bp mengindikasikan adanya plasmid uncut sedangkan band di atasnya juga menunjukan plasmid yang sama namun berbeda konformasi yaitu opencircular yang lebih sulit dalam menembus gel. Mengenai tidak adanya band 750

bp yang mengindikasikan restriksi berhasil dapat disebabkan oleh berbagai asumsi, salah satunya adalah tidak ditambahkannya enzim restriksi pada larutan sehingga proses restriksi tak dapat berjalan dan tak menghasilkan fragmen DNA insert.

5. Kesimpulan a. Tidak terestriksi suatu fragmen insert dengan panjang 750 bp dari vektor pGEMT-Easy dengan enzim restriksi EcoRI

6. Daftar Pustaka Bickle, T. A., D. H. Krger. 1993. Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev. 57 (2): 43450 Clark, David P.. 2005. Molecular Biology: Understanding the Genetic Revolution. New York : Elsevier Academic Press Lodish H, Berk A, Matsudaira P, et al. 2004. Molecular Cell Biology 5th ed. . New York : W. H. Freeman PROMEGA. 2009. pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems. USA : PROMEGA