MIKROORGANISME PENGHASIL ENZIM KITINASE

Mutiara Syafitri (3425083268) Nur Azizah (3425083261) PROGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA 2010 Enzim merupakan suatu kelas protein yang berfungsi sebagai katalis, agen kimiawi yang mengubah laju suatu reaksi tanpa harus dipergunakan oleh reaksi itu (Campbell, 2002). Suatu enzim mempercepat suatu reaksi dengan cara menurunkan energi aktivasi dalam sebuah reaksi. Reaktan dimana suatu enzim bekerja disebut sebagai substrat enzim. Pada saat enzim dan substrat berikatan, kerja katalitik enzim tersebut akan mengubah substrat menjadi produk (atau beberapa produk) reaksi. Aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti inhibitor, aktivator, kofaktor, suhu, pH, waktu reaksi enzimatis, konsentrasi enzim, dan konsentrasi substrat. Enzim ini terdapat pada sel-sel tumbuhan, fungi, bakteri, dan hewan. Kitinase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu menghidrolisis kitin menjadi monomernya yaitu N-asetilglukosamin. Semua enzim yang dapat mendegradasi kitin disebut sebagai kitinase total atau kitinase non-spesifik. Enzim kitinase dibagi menjadi tiga, yaitu: (i) Eksokitinase atau kitobiosidase, mengkatalisis pembebasan N-asetil-glukosamin; (ii) Endokitinase, enzim yang mendegradasi kitin secara acak dari dalam menghasilkan oligomer pendek N-asetil-glukosamin; (iii) N-asetilglukosaminidase bekerja pada pemutusan diasetilkitobiosa menghasilkan N-asetil-glukosamin (Herdyastuti, 2009). Kitinase dihasilkan oleh fungi, tumbuhan tingkat tinggi, serangga, udang, kepiting, cumi-cumi dan artropoda lainnya (Rahayu, 2000). Organisme-organisme tersebut umumnya memiliki beragam gen kitinase yang ekspresinya diinduksi oleh ekstraseluler kitin dan derivatnya. Enzim yang disekresikan oleh hewan, tumbuhan, bakteri bahkan manusia memiliki fungsi yang berbeda tergantung pada kebutuhan masing-masing makhluk hidup (Kasprzewska, 2003). Sebagai contoh, kitinase yang disekresikan oleh kepiting, udang, atau bekicot membantu pelunakan cangkang pada proses pemanjangan dan pelebaran cangkangnya. Pada tumbuhan, sekresi kitinase berfungsi sebagai mekanisme pertahanan terhadap serangan hama fungi (Kasprzewska, 2003; Nampoothiri dkk., 2004). Pada hewan, kitinase digunakan untuk mengkonversi kitin menjadi monomer atau oligomernya. Kitinase menjadi perhatian yang besar, terutama karena peranannya dalam morfogenesis fungi dan parasitisme (Dewi, 2008). Kitinase juga dimanfaatkan oleh bakteri untuk mendegradasi kitin menjadi kitobiosa yang akan diubah sebagai sumber karbon (energi) dan nitrogen (Tsujibo et al., 1999). Enzim kitinase yang dihasilkan oleh mikroorganisme kitinolitik mempunyai potensi tinggi untuk mendegradasi limbah yang mengandung kitin, karena dengan adanya enzim kitinase memungkinkan konversi kitin yang melimpah menjadi produk yang berguna (Muharni, 2009). Oleh karena itu, di bidang industri enzim yang digunakan sebagian besar diisolasi dari mikroorganisme. Pemilihan mikroorganisme sebagai sumber enzim mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan dengan yang diisolasi dari tumbuhan maupun dari hewan. Antara lain adalah sel mikroorganisme relatif lebih mudah ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relative lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah ditingkatkan bila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya relatif rendah, kondisi selama produksi tidak bergantung oleh adanya pergantian musim dan waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Poernomo dan Purwanto, 2003). Kitin merupakan polimer N-asetilgluoksamin yang cukup banyak ditemukan dalam dinding sel fungi dan eksoskleton dari serangga dan crustaceae. Kitin (C6H9O4.NHCOCH)n merupakan zat padat yang larut dalam asam-asam mineral pekat, tetapi tidak larut dalam air, pelarut organik, alkali pekat, dan asam mineral lemah. Dengan adanya ikatan hidrogen yang sangat kuat pada rantai kitin, membuat kitin tidak dapat larut dalam air dan membentuk fibril. Kitin dapat larut dalam fluoroalkohol dan asam mineral pekat. Koloidal kitin merupakan kitin yang banyak digunakan sebagai substrat dalam medium fermentasi (Haran et al., 1995). Gambar 1. Struktur Kitin.

Berdasarkan pola penyusun rantai polimer, kitin fibril terbagi atas -kitin (Cabib, 1987). Pada -kitin, rantai-rantai-kitin, -kitin, polimer yang berdekatan tersusun secara antiparalel. Bentuk ini ditemukan pada fungi dan arthropoda. Jenis -kitin mempunyai rantai -kitin fibrilnyapolimer yang tersusun parallel, sedangkan masing-masing terdiri dari tiga rantai, dua rantai tersusun parallel dan rantai ketiga antiparalel (Cabib, 1987). Sumber kitin bermacam-macam, namun secara komersial kitin dieksplorasi dari cangkang udangudangan dan crustaceae. Sebanyak 50-60% dari limbah udang, dihasilkan 25% kitin dari 32% berat kering limbah tersebut (Meidina et al., 2005). Kitin terdapat melimpah di tanah dengan struktur dan karakteristik yang unik. Banyak hewan dan mikroorganisme seperti fungi dan alga memberikan kontribusi terbanyak atas ketersediaan kitin di dalam tanah. Mekanisme Pendegradasian Kitin Kitin merupakan polisakarida pembangun struktur seperti dinding sel pada fungi atau cangkang pada hewan bercangkang seperti serangga, kepiting, kerang, dan udang (Kasprzewska, 2003). Kitin disintesis oleh fungi atau hewan bercangkang akan tetapi proses degradasi kitin lebih banyak diperankan oleh bakteri, terutama bakteri laut (Seki, 1965; Bassler et al., 1991; Yu et al., 1991). Gambar 2. Skema biodegradasi kitin secara aerob menghasilkan fruktosa-6-fosfat yang selanjutnya memasuki siklus glikolisis. Degradasi kitin secara aerob melalui tahap pemutusan kitin menjadi kitobiosa oleh kitinase. Kitobiosa yang terbentuk didegradasi lebih lanjut menjadi N-asetiglukosamin yang akhirnya akan diubah menjadi glukosa (Bassler et al., 1991; Yu et al., 1991). Degradasi kitin secara anaerob mellibatkan proses reduksi sulfat menjadi asam sulfide dan pembentukan ammonia merupakan salah satu bagian dari siklus sulfur dan nitrogen di laut (Seki, 1965). Kitin dapat didegradasi melalui dua jalur, yaitu : 1. Pendegradasian yang diinisiasi oleh kitinase dengan memotong ikatan -1,4-glikosida. Jalur ini dikenal dengan jalur mekanisme kitinolitik. 2. Pendegradsian yang diinisiasi oleh kitin deasetilase yang mengubah kitin menjadi kitosan selanjutnya oleh kitosanase akan menghidrolisis ikatan -1,4 menghasilkan kitobiosa dan kemudian kitobiosa dihidrolisis menjadi glukosamin oleh Glukosaminidase. Gambar 3. Jalur pendegradasian Kitin (Gooday et al., 1991). Mikroorganisme Penghasil Kitin Salah satu mikroorganisme yang mampu menghasilkan kitinase adalah bakteri, yang dikenal sebagi bakteri kitinolitik. Bakteri kitinolitik merupakan bakteri yang kompeten memproduksi enzim kitinase dan memanfaatkan kitinase untuk asimilasi kitin sebagai sumber karbon dan nitrogennya (Wu et al., 2001). Berikut beberapa genus dari bakteri yang mampu menghasilkan kitinase (Chernin et al., 1998): Selain bakteri, fungi juga merupakan kelompok organism yang diketahui memiliki aktivitas kitinase yang baik, diantaranya dari kelompok Deuteromycetes dan Ascomycetes misalnya Aspergillus, Trichoderma, Verticillium, Thielavia, Penicillium, Humicola, dan Colletotrichum. Dari kelompok Myxomycetes, Physarium polichepalum. Uji Kitinase pada Mikroorganisme Apabila ingin mengetahui suatu mikroorganisme berpotensi dan memiliki aktivitas kitinase, secara sederhana dapat dilakukan beberapa langkah pengujian seperti berikut: 1. Isolasi dan seleksi bakteri kitinase Mengambil sampel dari beberapa lokasi yang menjadi tempat hidup mikroorganisme, bisa berupa air laut, sumber air panas, danau, sungai, dll. Lalu sampel tersebut diinokulasikan ke dalam media kitin padat (menambahkan koloidal kitin dengan garam minimum, tepung agar, dan aquadest). Selanjutnya menginkubasikannya selama 48-72 jam pada suhu 60C. Jika terbentuk zona bening di sekitar koloni, bararti membuktikan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri kitinase yang mampu mendegradasi kitin (Rahayu, 2000). 2. Pengujian aktivitas kitinase a. Secara kualitatif Bakteri dari biakan tersebut kemudian dibiakan kembali agar didapatkan biakan murni, untuk isolate murni diinkubasikan pada suhu 60 C selama 1-5 hari. Lalu mengukur diameter zona bening yang terbentuk. Zona bening terbentuk karena terjadinya pemutusan ikatan -1,4 homopolimer N-

asetilglukosamin pada kitin oleh kitinase menjadi monomer N-asetilglukosamin. b. Secara kuantitatif Isolate bakteri ditumbuhkan pada medium kitin cair unuk mengetahui kemampuannya dalam merombak kitin secara kuantitatif. Menurut Shaikh dan Deshpande (1993), degradasi kitin secara enzimatik untuk menghasilkan GlcNAc bebas dilakukan oleh system kitinolitik yang telah ditemukan pada mikroba, tumbuh-tumbuhan dan hewan. Keberadaan enzim kitinolitik pada medium pertumbuhan yang diuji dapat dilihat dari reaksi pelepasan GlcNAc dari koloidal kitin. 3. Pengidentifikasian koloni bakteri yang berpotensi sebagai penghasil kitinase Isolate yang telah diseleksi kemudian diidentifikasi karakter sifat morfologi dari koloni bakteri yang terbentuk seperti bentuk dan warna koloni, elevasi, tepian koloni, bentuk sel, sifat gram, sifat aerob/anaerob, spora dan motilitas. Pengamatan motilitas dengan menggunakan medium semi padat sulfide iondole motility (SIM) jika terdapat jejak pergerakan bakteri di dalam medium maka bakteri tersebut positif motil; untuk mengamati sifat pewarnaan gram digunakan safranin, iodine, aseton alcohol, dan Kristal violet. Hasil karakterisasi tersebut dapat diidentifikasi menggunakan Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 4. Pengujian biokimia Selanjutnya dilakukan pengujian biokimia seperti uji sitrat (Simmons Citrate Agar), uji katalase menggunakan larutan 3% H2O2, uji karbohidrat dengan media Triple Sugar Iron Agar, uji amylase dengan media Starch Agar, uji gelatin dengan medium nutrient gelatin, dan uji oksidase dengan menggunakan Bactident oxidase.

5. Penentuan Aktivitas Enzim Kitinase Aktivitas kitinase merupakan ukuran jumlah produk yang dihasilkan dari suatu pemecahan substrat kitin, satu unti aktivitas kitinase didefinisikan sebagai pelepasan 1 mol gula reduksi (N-asetilglukosamin) per menit. Beberapa metode penentuan aktivitas kitinase yang sering dipergunakan adalah sebagai berikut: a. Pengukuran aktivitas hidolitik secara kualitatif Aktivitas hidrolisis merupakan gambaran dari kemampuan isolate bakteri kitinolitik dalam merombak kitin, semakin besar nilai aktivitas hidrolisis maka semakin besar pula diameter zona bening yang terbentuk di sekitar koloni. Aktivitas ini diukur dengan membandingkan diameter zona bening dan diameter koloni (Widhyastuti dan Dewi, 2001) untuk mengetahui isolate bakteri yang memiliki potensial aktivitas kitinase tinggi. b. Pengukuran Aktivitas Kitinase Kasar Penentuan secara kalorimetri Penentuan secara kalorimetri didasarkan pada pelepasan produk hasil degradasi koloidal kitin berupa N-asetil-D-glukosamin ke dalam supernatant dengan menggunakan metode Reissig. Produk tersebut dikomplekskan dengan reagen tertentu seperti p-dimetilamino-benzaldehid atau reagen asam dinitrosalisilat menghasilkan serapan pada panjang gelombang 540 nm. Substrat lain yang bisa digunakan pada metode ini adalah kitin azure, yaitu kitin yang direaksikan dengan senyawa Remasol Brillian Violet 5R dan serapam yang dihasilkan dapat diukur pada panjang gelombang 420 nm. Untuk menentukan konsentrasi produk digunakan Spektrofotometer AssayN-asetil-D-glukosamin sebagai standar. Metode ini dapat ditentukan dengan menggunakan senyawa kromogen seperti 4-nitrofenil--D-N-Ndiasetilkitobiosa dan 4-nitrofenil--D-N-N-N-triasetilkitobiosa yang disiapkan dalam larutan stok dimetil sulfoksida (DMSO) seperti yang telah dilakukan oleh Imoto dan Yagishita (1977) dan ditentukan serapan pada panjang gelombang 410 nm. Pembentukan Fluoresens Uji ini digunakan untuk menentukan perbedaan aktivitas degradasi kitin dengan menggunakan substrat 4-metilumbeliferil-N-asetil--D-glukosaminida, 4-metil umbeliferil-N-asetil--D-N-N-diasetil kitobiosida, 4-metilumbeliferil-N-asetil--D-N-N-N-triasetil kitotriosida, dan 4-metilum beliferil-Nasetil--D-N-N-N-N-tetraasetil kitotetraosida dalam larutan DMSO menurut metode Mc Creath dan Gooday. Pembentukan fluoresens diakibatkan karena pelepasan 4-metil umbeliferil yang tereksitasi pada panjang gelombang 390 nm dan diemisikan pada panjang gelombang 485 nm. Zymogram dengan menggunakan etilen glikol Metode ini didasarkan pada degradasi substrat etilen glikol pada media padat yang mengandung glikool kitin oleh aktivitas kitinase yang ditunjukkan oleh zona bening di sekitar bakteri. Glikol kitin yang disintesis dengan cara Trudel dan Aselin (1989) juga bisa digunakan pada metode Zymogram, suatu teknik yang melibatkan dua tahapan yaitu pemisahan engan elektroforesis kemudian dilanjutkan

dengan deteksi penentuan aktivitas kitinase. Pada proses ini terjadi kopolimerasasi antara gel poliakrilamid dengan glikol kitin, kitin yang didegradasi oleh kitinase akan membentuk zona bening. Gel kemudian distaining dengan Coomassie Brilliant Blue R-250, dimana muatan positif glikol kitin akan berinteraksi dengan Coomassie Blue membentuk ikatan elektrostatik. Setelah dilakukan destaining dengan air, maka warna glikol kitin akan hilang karena aksi kitinase. Menurut beberapa peneliti metode ini lebih mudah untuk mendeteksi aktivitas kitinolitik tetapi metode ini mempunyai keterbatasan karena tidak dapat digunakan untuk staining protein lebih lanjut dan mobilitas kitinase dalam gel terganggu karena adanya polisakarida dalam gel. Metode Staining pada Plate Agar Kitin dan Elektroforesis Gel Poliakrilamid Pada awalnya dikembangkan screening hiperkitinase yang diproduksi bakteri dengan menggunakan Calcofluor white M2R dalam plate yang mengandung kitin swollen. Calcofluor M2R berikatan dengan rantai glukan membentuk lingkar linier -(1,4)-glikosidik dengan masing-masing unit N-asetilglukosamin. Pada pengikatan dengan polisakarida seperti kitin akan mengeluarkan cahaya fluorokrom saat dideteksi di bawah sinar ultra violet. Mikroorganisme yang berpotensi kitinolitik akan membentuk zona bening di bawah sinar UV seperti yang telah dilakukan pada hiperkitinase mutan Alcaligenes xylosoxydans. Metoide ini kemudian dikembangkan oleh Gohel dengan cara memisahkan kitinase pada gel poliakrilamid dan ditransfer pada cawan petri yang mengandung agar kitin. Metode ini sederhana, reproducible, sensitive, mudah bagi pengguna, dapat dipercaya, dan harganya efektif untuk deteksi kitinase natural dan terdenaturasi pada gel poliakrilamid. Pemilihan terhadap metode yang akan digunakan disesuaikan dengan tujuan dari penelitian tersebut. Bila akan menentukan aktivitas kitinase secara kuantitatif, maka dapat digunakan metode kolorimetri dengan menggunakan substrat tertentu. Pembentukan fluoresens juga dapat digunakan secara langsung untuk menentukan jenis kitinase yang dihasilkan dengan menggunakan beberapa substrat. Sedangkan Zymogram dan agar kitin dapat digunakan untuk penentuan kualitatif kitinase, yaitu mengidentifikasi mikroorganisme tertentu sebagai penghasil kitinase dan juga dapat mengetahui berat molekul kitinase yang dihasilkan. 6. Purifikasi enzim Purifikasi enzim dilakukan untuk dapat mengetahui berat molekul kitinase yang dihasilkan dan sebagai bahan untuk menguji karakteristik kitinase. Purifikasi merupakan proses untuk mendapatkan enzim murni agar dapat dilakukan pengujian karakteristik dari enzim tersebut. Adapun tahapan dari purifikasi suatu enzim itu bergantung pada enzim apakah yang ingin dipurifikasi. Pada makalah ini kami akan mencoba memaparkan secara singkat tahapan dari purifikasi kitinase. Inti dari tahapan purifikasi adalah presipitasi enzim dengan ammonium sulfat lalu diinkubasi, selanjutnya didialisis dan terakhir dikromatografi. 7. Pengujian antagonism terhadap fungi pathogen tanaman Untuk mengujinya bisa menggunakan Fusarium semitectum, atau Ganoderma boninense atau Penicillium citrinum. Hifa dari fungi pathogen tersebut ditumbuhkan dalam medium nutrient broth yang ditambahkan 3% potato dextrose agar kemudian diambil seukuran 0.5x0.5 cm lalu dikulturkan dalam media garam kitin. Setelah itu diinkubasik pada suhu kamar 28 C selama 2 hari, jika jamur sudah terlihat tumbuh kira-kira 0.5 cm dari hifa terluar digoreskan secara lurus bakteri kitinolitik dari hasil isolasi sebelumnya. Pengamatan dilakukan setelah diinkubasi selama 2 hari, jika terbentuk zona bening maka bakteri tersebut positif menghambat pertumbuhan fungi. 8. Pengujian karakteristik aktivitas kitinase Untuk mengetahui krakteristik kitinase efektif pada keadaan yang seperti apa, umumnya peneliti akan melakukan pengujian temperatur, pH, salinitas, dan ion metal pada biakan bakteri yang berpotensi sebagai penghasil kitinase. a. Pengujian temperatur Hasil dari purifikasi kitinase kemudian diinkubasikan pada suhu yang berbeda kisaran optimum dari kitinase yang dihasilkan oleh bakteri yang diuji. Misalnya kisaran antara 30-60C selama 24 jam. b. Pengujian pH Untuk menguji kondisi pH yang optimum untuk aktivitas kitinase dapat digunakan hasil purifikasi dari kitinase yang kemudian diinkubasi pada larutan buffer yang berbeda-beda tingkat keasam-basaannya selama 24 jam pada suhu 50C. c. Pengujian salinitas Untuk menguji salinitas yang optimum terhadap aktivitas kitinase dapat dilakukan dengan menginkubasi kitinase pada larutan garam yang memiliki salinitas yang bervariasi (g psu). Misalnya pada kisaran 5 g 50 g d. Pengujian ion logam

Untuk menguji efek dari ion logam dapt dilakukan dengan menginkubasi kitinase pada larutan Ca2+, Fe2+, Ba2+, Mn2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, dan Mg2+ pada konsentrasi tertentu (5 mM atau 10 mM) pada suhu 40C selama 24 jam.

DAFTAR PUSTAKA Bassler, B.L., Yu, C.L., dan Saul, R.. 1991. Chitin Utilization by Marine Bacteria : Degradation and Catabolisme of Chitin Oligosaccharides by Vibrio furnissi., J. Biol. Chem., 266, 24276-24286. Brzezinska, M. Swiontek dan W. Donderski. 2000. Occurrence andActivity of the Chitinolytic Bacteria of Aeromonas Genus. Polish Journal of Environmental Studies 10 (1) :27-31. Cabib, E. 1987. The Synthesis & Degradation of Chitin. Dalam A. Meister (Ed) Advances in Enzymology. An Interscience Publication John Willey & Sons Inc. New York. 59:59-101. Campbell, Neil A., Jane B. Reece, dan Lawrence G.M. 2002. Biologi edisi kelima jilid 1. Jakarta: Penerbit Erlangga. Dewi, Iche Marina. 2008. Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Kitinase Termofilik Kasar dari Sumber Air Panas Tinggi Raja, Simalungun. Medan: Universitas Sumatera Utara. Gohel, Vipul, Pranav Vyas, dan H.S. Chhatpar. 2005. Activity Staining Method of Chitinase on Chitin Agar Plate Through Polyacrylamide Gel Electrophoresis. India: African Journal of Biotechnology Vol. 4(1), pp. 87-90. Gooday, G.W., 1990. Physiology of Microbial Degradation of Chitin and Chitosan, Biodegradation, 1, 177-190 Haran, S. dan Chet, I. 1995. New Components of the Chitinolytic System of Trichoderma harzianum, Mycol Rev. 94 : 441-446. Herdyastuti, Nuniek, dkk. 2009. Chitinase and Chitinolytic Microorganism:Isolation, Characterization and Potential. Indo. J. Chem 9 (1), 37-47. Kasprzewska, Anna. 2003. Plant Chitinase Regulation and Function. Cell Molec. Biol. Lett., 8, 809824. Meidina, Sugyono, Jenie, B.S.L. Suhartono, M.T. 2005. Aktivitas Antibakteri Oligomer Kitin yang Diproduksi Menggunakan Kitin dari Isolat B. licheniformis MB-2, Departemen Teknologi Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor, Bogor. 288-293 Muharni. 2009. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Kitinase dari Sumber Air Panas Danau Ranau Sumatera Selatan. Jurnal Peneliti Sains Edisi 09:12-15. Nampoothiri, K.M., Baiju, T.V., Sandhya, C., Sabu, A., Szakacs, G., dan Pandey, A., 2004. Process optimization for antifungal chitinase production by Trichoderma harzianum. Process Biochem., 39, 1583-1590. Omumasaba, Crispinus A., Naoto Y,.dan K. Ogawa. 2001. Purification and Characterization of Chitinase from Trichoderma viride. Japan: J. Gen, Appl. Microbiol. 47: 53-61. Park, Shin Hye, dkk. 2000. Purification and Characterization of Chitinase from a Marine Bacterium, Vibrio sp. 98CJ11027. The Journal of Microbiology 38 (4), pp.224-229. Poernomo. 2004. Kitinase dalam Pengendalian Hayati. Majalah Farmasi Airlangga. Jakarta. 4(2): 2427. Rahayu, S. 2000. Karakterisasi dan Pemurnian Kitinase dan Kitin Deasetilase Termostabil dari Isolat K29-14 asal Kawah Kamojang, Jawa Barat (tesis). Bogor: Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Seki, H., (1965): Microbiological Studies On The Decomposition of Chitin in Marine Environment-X., J. Oceanograph. Soc. Jpn, 21, 261-269. Shaikh S.A., Deshpande M.V. 1993. Chitinolytic Enzymes: their contribution to basic and applied research. World J. Microbiol. Biotechnol. 9: 468-475. Tsujibo, H., N. Kondo, K. Tanaka, K. Miyamoto, N. Bao, dan Y. Imamori. 1999. Molecular Analysis of The Gene Encoding a Novel Transglycosylative Enzyme from Alteromonas sp. Strain 0-7 and Its Physiological Role in The Chitinolitic System. J. Bacteriol. 81: 5461-5466. Wang S.L., Chiou S.H., Chang w.T. 1997. Production of Chitinase from shellfish waste by Pseudomonas aeruginosa K-187. Proc Nat Sci Council ROC 21: 71-78. Widyastuti N, Dewi R.M. 2001. Isolasi Bakteri Proteolitik dan Optimalisasi Produksi Protease. Puslit Biologi-LIPI, Bogor. 373-384. Zarei, Mandana, dkk. 2010. Serratia marcescens B4A Chitinase Product Optimization using Taguchi Approach. Iranian Journal of Biotechnology 8 (4).
http://razzelara.blogspot.com/2012/01/mikroorganisme-penghasil-enzim-kitinase.html