Pewarnaan Bakteri

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan
cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba
dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan
strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat
(Dwidjoseputro, 2005).
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan
mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara
yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Widjoseputro, 1989).
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia
dapat diketahui.
2.9.

Teknik Pewarnaan
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu

pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.

Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan
tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel
microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan
pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan
bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella
dan pengecatan kapsul (Waluyo, 2010).
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan :
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun,
formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna
Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel
bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan
kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan acid-fast(tahan asam) untuk

genus Mycobacterium. Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan

kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan
untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae.
Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu
sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelczar, 1986). Secara
garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya
digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnapewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zatzat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang
dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk
melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan
adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).
Gambar pewarnaan sederhana
2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam
Pewarnaan differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan
pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri
Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu,
pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding
sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari
genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari
kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding

selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat
warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan
biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat
reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk
melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif
memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan
bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi
suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Contoh bakteri gram positif

Contoh bakteri gram negatif

(http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram)
Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi
sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya
karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan
diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol.
Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat
digunakan

untuk

mendiagnosa

keberadaan

bakteri

penyebab

tuberkulosis

yaitu

Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling
banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen (Irianto, 2006).
Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)

3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan

spora, pewarnaan kapsul.
Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik
pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan
pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada
pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa
menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium (Waluyo, 2010).
Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton
(http://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite)
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel (Waluyo, 2010).
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air
dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang
4.

5.

berwana biru gelap (Waluyo, 2010).

Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :
a. Pewarnaan Neisser (granula volutin)
b. Pewarnaan yodium (granula glikogen)
Pewarnaan negatif
Tujuan: Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi
organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi
mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus teteskan emersi lihat di mikroskop
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahanbahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna
asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel

karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah
dilihat dengan latar belakang berwarna (Koesmadji, 2002).
pembahasan
Pewarnaan (Pengecatan)
1.

Pewarnaan Gram
Pewarnaan (pengecatan) bakteri gram dilakukan dengan menggunakan bahan kristal
violet, burke,s iodine, ethanol 95% dan safranin akuosa. Hal pertama yang dilakukan adalah
membubuhkan kristal violet hingga bakteri terendam semuanya, diamkan selama 1 menit,
kemudian cuci pada air mengalir. Selanjutnya smear dibubuhkan burke,s iodine selama 1
menit dan dicuci dengan menggunakan air mengalir. Deklonisasi dengan ethanol 95% dan
dicuci dengan air mengalir. Langkah selanjutnya penutupan dengan cat safranin akuosa
selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir. Keringkan preparat dan amati dibawah
mikroskop dengan minyak imersi.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan
memberikan reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk
ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau
dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang
bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat
ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi
bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh
kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri
dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan
Reece, 2005).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai
lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam

2.

(Campbell dan Reece, 2005).

Pewarnaan Spora
Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium serta genus, Desulfomaculatum
dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora
merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan
mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan
bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora
dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irianto, 2006).

Pewarnaan spora dengan menggunakan bahan malachite green dan safranin akuosa.
Smear dibubuhkan dengan malachite green kemudian dipanaskan hingga cat menguap (bukan
preparat mendidih), kemudian cuci dengan air mengalir. Selanjutnya ditutup dengan cat
safranin akuosa selama 1-2 menit didiamkan lau dicuci dengan air mengalir. Setelah itu
dikeringkan lalu dapat diamati dibawah mikroskop dengan minyak imersi.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan
tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan
sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel
vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora.
kesimpulan
Pada pewarnaan gram, bahan yang digunakan untuk cat pewarna yaitu
kristal violet, burke,s iodine, ethanol 95% dan safranin akuosa. Pada pewarnaan
spora, bahan yang digunakan untuk yaitu melachite green dan safranin akuosa.
Teknik pewarnaan dengan menggunakan bahan-bahan kimia yang mampu
memberi cat warna pada smear. Teknik pewarnaan ada gram, Zieh-Nehen untuk
bakteri acid fast, spora dan flagella.

DAFTAR PUSTAKA
Ali, Alimuddin. 2005. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Makassar : State University of Makassar
Press.
Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi ke-5. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik
Indonesia.
Baird RM, Hodges NA, Denyer SP. 2000. Handbook of Microbiological Quality Control:
Pharmaceutical Science. USA: CRC Press.
Bardy SL, Ng SY, Jarrell KF. 2003. "Prokaryotic motility structures". Microbiology
(Reading, Engl.) 149 (Pt 2): 295304.
Berg JM, Tymoczko JL Stryer L. 2002. Molecular Cell Biology (edisi ke-5th). WH Freeman
Burdon, Kenneth Livingston, Robert P. Williams. 1969. Microbiology. Macmillan.
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta : Erlangga.
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan.
PAU Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.
Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : PT.Gramedia.
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : PT.Gramedia.
Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Jilid 1. Bandung : Yrama Widya.

Koesmadji. 2002. Teknik Laboratorium. Jakarta : Universitas Pendidikan Indonesia Press.

Lay, B. W. dan Hastowo. 1982. Mikrobiologi. Jakarta : Rajawali Press.
Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2010. Brock Biology of Microorganisms. New Jersey:
Pearson Prentice Hall.
Maier RM, Pepper IL, Gerba CP (2009). Environmental Microbiology, 2nd Edition.
Margosch D, Ehrmann MA, Buckow R, Heinz V, Vogel RF, Ganzle MG. 2006. HighPressure-Mediated Survival of Clostridium botulinum and Bacillus amyloliquefaciens
Endospores

at

High

Temperature.

Appl

Environ

Microbiol

72(5):3476-81.

doi:10.1128/AEM.72.5.3476-3481.2006.
Neidleman SL. 1993. Advances in Applied Microbiology volume 39. United Kingdom:
Academic Press Inc.
Nikiyan H, Vasilchencko A, Deryabin D. 2010. Humidity-Dependent Bacterial Cells
Functional Morphometry Investigations Using Atomic Force Microscope. Int J Microbiol. Vol
2010.
Pelczar, Michael J., et al. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi; Terjemahan. Jakarta : UI Press.
Rollins DM, Joseph SW. 2004. Arrangement of Bacterial Flagella.
Suriawiria, U. 1985. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Papas Sinar Sinanti.
Volk, W.A. dan Wheeler, M.F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Penerbit Erlangga.
Waluyo, lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. Malang.
Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.