BAB III

METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai Agustus 2015 di
Laboratorium Kimia Analitik Jurusan Kimia UIN Maulana Malik Ibrahim Malang
Jalan Gajayana No. 50 Malang.
3.2 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilaksanakan adalah experimental laboratory
pembuatan sensor urea berbasis variasi konsentrasi reagen diasetil monoksimtiosemikarbazida dan teknik immobilisasi
3.3.
Alat dan Bahan
3.3.1. Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah neraca analitik,
tabung sentrifus, alat sentrifugasi, oven, stopwatch, gelas arloji, beaker glass 50
mL, beaker glass 100 mL, labu ukur 100 mL, pipet ukur 1 mL, pipet ukur 10 mL,
pipet ukur 20 mL, pipet tetes, danperalatan gelas lain yang biasa digunakan di
laboratorium kimia.
3.3.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah urea, diasetil
monoksim (DAM), tiosemikarbazida (TSC), FeCl3, H2SO4 p.a, H3PO4 p.a, plat
silika gel, aquades dan sampel serum darah.
3.4.

Tahapan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan beberapa tahapan yaitu:
1. Preparasi sampel
2. Preparasi bahan
3. Immobilisasi reagen diasetil monoksim-tiosemikarbazida (DAMTSC) dan reagen asam pada plat silika gel untuk pembuatan sensor
urea secara adsorpsi
4. Penentuan konsentrasi optimum reagen DAM-TSC dalam

pembuatan sensor urea secara adsorpsi pada plat silika gel

5. Pengumpulan data
6. Analisis data
3.4.1. Preparasi Sampel

26

27

Dipipet 10 ml sampel darah lalu dimasukkan dalam tabung sentrifus.

Diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37 C. Supernatan yang dihasilkan
dipisahkan dari endapannya lalu dipindahkan dalm tabung reaksi. Dilakukan
sentrifugasi pada supernatan tersebut dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit.
Serum darah yang dihasilkan merupakan supernatan hasil sentrifugasi. Sebelum
penggunaan, serum disimpan pada suhu 4 C.
3.4.2. Preparasi Bahan
Preparasi bahan yang dilakukan meliputi pembuatan sampel larutan urea,
pembuatan reagen diasetil monoksim, pembuatan reagen tiosemikarbazida dan
pembuatan reagen asam.
3.4.2.1.

Pembuatan Larutan Standar Urea 25 mg/dL

Larutan standar urea 25 mg/dL dibuat sebanyak 100 mL dengan cara;

dilarutkan 0,025 gram urea ke dalam 50 mL aquades dalam beaker glass

kemudian dipindahkan ke labu takar 100 mL. Ditambahkan aquades hingga
volumenya mencapai tanda batas dan dihomogenkan.
3.4.2.2.

Pembuatan Reagen Identifikasi Urea

Reagen ini terdiri dari tiga jenis reagen, yaitu reagen diasetil monoksim,

tiosemikarbazida dan reagen asam.

a. Pembuatan Reagen Diasetil monoksim (DAM)
Reagen diasetil monoksim dibuat dengan tiga variasi konsentrasi yaitu
80; 100; dan 120 mmol/L. Masing-masing reagen dibuat sebanyak 50 mL.
b. Pembuatan Reagen Tiosemikarbazida (TSC)
Reagen tiosemikarbazida dibuat dengan tiga variasi konsentrasi yaitu 4; 8;
dan 16 mmol/L. Masing-masing reagen dibuat sebanyak 50 mL.
c. Pembuatan Reagen Asam Fosfat dan Asam Sulfat (Shanmugam, 2010)
Dipipet 1 ml H3PO4 dan 6 ml H2SO4 pekat dan dimasukkan ke dalam
beaker glass 100 mL. Ditambahkan aquades 75 mL. Didinginkan campuran
tersebut dan ditambahkan 0,1 mL larutan FeCl3 10%. Diencerkan larutan dengan
aquades di labu takar 100 mL sampai volume mencapai tanda batas dan
dihomogenkan.
3.4.3. Immobilisasi Reagen Diasetil Monoksim dan Tiosemikarbazida
(DAM-TSC) dan Reagen Asam pada Plat Silika Gel Untuk
Pembuatan Sensor Urea secara Adsorpsi

28

3.4.3.1.Penentuan Teknik Adsorpsi Terbaik Reagen DAM-TSC dan Reagen

Asam pada Plat Silika Gel
Disiapkan plat silika gel ukuran 2 x 2 cm serta reagen identifikasi urea
yang terdiri dari campuran reagen DAM-TSC serta reagen asam sebanyak 30 mL
dengan komposisi sebagai berikut:
Tabel 3.1 Komposisi Reagen Identifikasi Urea dalam Penentuan Teknik Adsorpsi
Terbaik
No

Nama Bahan

Volume (mL)

Diasetil monoksim 100 mmol/L

7,5

Tiosemikarbazida 8 mmol/L

7,5

Reagen asam

15

Diimmobilisasikan reagen identifikasi urea tersebut di atas plat silika gel ukuran 2
x 2 cm dengan variasi teknik adsorpsi, yaitu direndam, dilapiskan (coating) dan
disemprot masing-masing selama 20 menit. Dikeringkan plat silika gel yang telah
terimmobilisasi reagen identifikasi pada suhu ruang. Ditetesi plat dengan sampel
larutan urea menggunakan pipet tetes. Plat didiamkan 5 menit sambil dipanaskan
dalam oven pada suhu 100 C selama 20 menit dan dihitung waktu bercak warna
mulai terlihat serta diamati kejelasan dan kestabilan dari bercak warna yang
tersebut, sehingga diketahui teknik adsorpsi paling baik untuk mendeteksi urea.
Reagen DAM-TSC dan reagen asam akan membentuk warna merah muda dengan
urea. Diulangi prosedur di atas sebanyak tiga kali pengulangan.
3.4.3.2.Penentuan Waktu Adsorpsi Terbaik Reagen DAM-TSC dan Reagen
Asam pada Plat Silika Gel
Disiapkan plat silika gel ukuran 2 x 2 cm dan reagen identifikasi urea
sebanyak 30 mL dengan komposisi seperti yang tertera pada Tabel 3.1.
Diimmobilisasikan reagen identifikasi urea tersebut ke atas plat silika gel ukuran
2 x 2 cm dengan teknik adsorpsi terbaik selama 10, 20 dan 30 menit kemudian
dikeringkan plat silika gel yang telah terimmobilisasi reagen identifikasi urea pada
suhu ruang. Ditetesi plat dengan sampel larutan standar urea menggunakan pipet
tetes. Plat didiamkan 5 menit kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100 C
selama 20 menit. Dihitung waktu bercak warna mulai terlihat serta diamati
kejelasan dan kestabilan dari bercak warna yang tersebut, sehingga diketahui

29

waktu adsorpsi terbaik untuk mendeteksi urea. Reagen DAM-TSC dan reagen
asam akan membentuk warna merah muda dengan urea. Diulangi prosedur di atas
sebanyak tiga kali pengulangan. Dihitung dan diidentifikasi jumlah zat cair yang
teruapkan pada plat silika gel dari masing-masing perlakukan.
3.4.3.3.Penentuan Waktu Pemanasan Terbaik Reagen DAM-TSC dan Reagen
Asam pada Plat Silika Gel
Disiapkan plat silika gel ukuran 2 x 2 cm serta reagen identifikasi urea
yang terdiri dari reagen diasetil monoksim, reagen tiosemikarbazida dan reagen
asam dengan komposisi seperti yang tertera pada Tabel 3.1. Diimmobilisasikan
reagen identifikasi urea tersebut di atas plat silika gel ukuran 2 x 2 cm dengan
teknik adsorpsi terbaik selama x menit dikeringkan plat silika gel yang telah
terimmobilisasi reagen identifikasi urea pada suhu ruang. Ditetesi plat dengan
sampel larutan urea menggunakan pipet tetes. Plat didiamkan 5 menit kemudian
dipanaskan dalam oven pada suhu 100 C selama 10; 20; dan 30 menit, Dihitung
waktu bercak warna mulai terlihat serta diamati kejelasan dan kestabilan dari
bercak warna yang tersebut, sehingga diketahui waktu pemanasan terbaik untuk
mendeteksi urea. Reagen DAM-TSC dan reagen asam akan membentuk warna
merah muda dengan urea. Diulangi prosedur di atas sebanyak tiga kali
pengulangan.
3.4.4. Penentuan Konsentrasi Optimum Reagen Diasetil Monoksim (DAM)
dan Tiosemikarbazida (TSC) dalam Pembuatan Sensor Urea Secara
Adsorpsi pada Plat Silika Gel
Disiapkan plat silika gel ukuran 2 x 2 cm serta reagen identifikasi urea
sebanyak 30 mL yang merupakan campuran reagen DAM 80 mmol/L (7,5 mL),
reagen TSC 8 mmol/L (7,5 mL) dan reagen asam (15 mL). Diimmobilisasikan
reagen identifikasi urea tersebut di atas plat silika gel dengan teknik adsorpsi
terbaik selama x menit lalu dikeringkan plat silika gel yang telah terimmobilisasi
reagen identifikasi urea pada suhu ruang. Ditetesi plat dengan sampel larutan urea
menggunakan pipet tetes. Plat didiamkan selama 5 menit kemudia dipanaskan
dalam oven pada suhu 100 C selama x menit. Dihitung waktu bercak warna
mulai terlihat serta diamati kejelasan dan kestabilan dari bercak warna yang
tersebut. Reagen DAM-TSC dan reagen asam akan membentuk warna merah
muda dengan urea. Diulangi prosedur di atas dengan reagen diasetil monoksim

30

100 mmol/L dan 120 mmol/L. Konsentrasi optimum reagen diasettil monoksim
diperoleh dengan membandingkan waktu bercak warna merah muda mulai
terbentuk pada masing-masing plat, kejelasan dan kestabilan dari bercak warna
tersebut. Prosedur di atas diulangi sebanyak tiga kali pengulangan.
Prosedur yang sama juga dilakukan dalam penentuan konsentrasi optimum
reagen tiosemikarbazida dengan variasi konsentrasi sebagai berikut; 4; 8; dan 16
mmol/L sementara konsentrasi diasetil monoksim yang digunakan adalah
konsentrasi optimum yang telah didapat.
3.4.5. Penentuan Urea dalam Serum Darah dengan Plat Silika Gel
Terimmobilisasi Reagen Diasetil Monoksim-Tiosemikarbazida dan
Reagen Asam secara Adsorpsi pada Plat Silika Gel
Disiapkan plat silika gel ukuran 2 x 2 cm serta reagen identifikasi urea
sebanyak 30 mL yang merupakan campuran reagen DAM dengan konsentrasi
optimum (7,5 mL), reagen TSC dengan konsentrasi optimmum (7,5 mL) dan
reagen asam (15 mL). Diimmobilisasikan reagen identifikasi urea tersebut ke atas
plat silika gel dengan teknik adsorpsi terbaik selama x menit lalu dikeringkan plat
silika gel yang telah terimmobilisasi reagen identifikasi urea pada suhu ruang.
Ditetesi plat dengan sampel serum darah menggunakan pipet tetes. Plat didiamkan
selama 5 menit kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100 C selama x
menit. Dihitung waktu bercak warna mulai terlihat serta diamati kejelasan dan
kestabilan dari bercak warna tersebut. Reagen DAM-TSC dan reagen asam akan
membentuk warna merah muda dengan urea. Prosedur di atas diulangi sebanyak
tiga kali pengulangan.
3.4.6. Pengumpulan Data
Pengumpulan data dilakukan secara langsung mengamati hasil penelitian
secara berulang (repeated measurement). Warna yang timbul pada plat silika gel
yang terimobilisasi reagen identifkasi urea diamati secara langsung dan diambil
gambarnya menggunakan kamera. Data yang diperoleh ditulis pada tabel dengan
format sebagai berikut:
Tabel 3.2 Hasil penentuan teknik adsorpsi terbaik reagen DAM-TSC dan reagen
asam pada plat silika gel dalam pembuatan sensor urea
Kejelasan bercak Kestabilan bercak
Teknik adsorpsi
Waktu respon
warna*
warna

31

Perendaman
Pelapisan
Penyemprotan
Tabel 3.3 Hasil penentuan waktu adsorpsi terbaik reagen DAM-TSC dan reagen
asam pada plat silika gel dalam pembuatan sensor urea
Waktu adsorpsi
Kejelasan bercak
Kestabilan bercak
Waktu respon
(menit)
warna*
warna
10
20
30
Tabel 3.4 Hasil penentuan waktu pemanasan terbaik plat silika gel yang telah
terimmobilisasi reagen DAM-TSC dan reagen asam dalam pembuatan
sensor urea
Waktu
Kejelasan bercak Kestabilan bercak
Pemanasan
Waktu respon
warna*
warna
(menit)
10
20
30

Tabel 3.5 Hasil penentuan konsentrasi optimum reagen DAM dalam pembuatan
sensor urea secara adsorpsi pada plat silika gel
Konsentrasi
Kejelasan bercak Kestabilan bercak
reagen DAM
Waktu respon
warna*
warna
(mmol/L)
80
100
120

32

Tabel 3.6 Hasil penentuan konsentrasi optimum reagen TSC dalam pembuatan
sensor urea secara adsorpsi pada plat silika gel
Konsentrasi
Kejelasan bercak Kestabilan bercak
reagen TSC
Waktu respon
warna*
warna
(mmol/L)
4
8
16
Tabel 3.7 Hasil penentuan urea dalam sampel serum darah dengan plat silika gel
terimmobilisiasi reagen DAM-TSC dan reagen asam secara adsorpsi
Kejelasan bercak Kestabilan bercak
Pengulangan
Waktu respon
warna*
warna
1
2
3
*Keterangan
+
: warna merah muda lemah
++
: warna merah muda kuat
+++ : warna merah muda sangat kuat

3.4.7. Analisis Data

Konsentrasi optimum dari reagen DAM dan TSC maupun teknik
immobilisasi terbaik yang meliputi teknik adsorpsi terbaik, waktu adsorpsi terbaik
serta waktu pemanasan terbaik diketahui dari waktu bercak warna mulai terlihat,
kestabilan dan kejelasan bercak warna yang terbentuk pada plat silika gel yang
terimmobilisasi reagen identifikasi urea setelah ditetesi sampel urea buatan dalam
pelarut air. Setelah diperoleh konsentrasi DAM-TSC optimum serta teknik
immobilisasi terbaik, sensor urea yang dibuat diujikan terhadap sampel yang
berupa serum darah sehingga diketahui apakah sensor urea yang dibuat dapat
mendeteksi urea yang terdapat pada sampel serum darah.