(ESBL) merupakan salah satu bakteri Multi Drugs Resistant Gram Negative Bacteria (MDRGNB) yang dilaporkan telah resisten terhadap antibiotik penicillin, sefalosporin generasi I,II, III dan aztreonam (kecuali cephamycin dan carbapenem). Hidrolisis antibiotik beta laktam oleh beta laktamase adalah mekanisme yang paling sering mendasari terjadinya resistensi terhadap antibiotik golongan beta laktam pada bakteri gram negatif yang penting secara klinis. ESBL dimediasi oleh plasmid yang banyak ditemukan pada family Enterobacteriaceace khususnya spesies Escherichia coli dan Klebsiella pneumonia. Kemampuan galur ESBL menghidrolisis antibiotik laktam secara luas disebabkan adanya sejumlah mutasi pada beberapa gen seperti SHV, TEM, OXA dsb. Mutasi tersebut umumnya mengenai daerah active site dari enzim sehingga aktivitas enzim tersebut meningkat. Bakteri yang memproduksi ESBL dapat menyebabkan sulitnya pengobatan karena pilihan antibiotik menjadi terbatas. Identifikasi bakteri basil Gram negatif dengan ESBL positif hasil Isolat fasilitas dan peralatan medis pada ruang Intensive care Unit (ICU) RSUD S.K LERIK Kupang. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri penghasil ESBL dengan menggunakan metode difusi. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dengan desain cross sectional. sampel penelitian ini adalah hasil swab pada fasilitas dan peralatan medis yang ada di ruang ICU RSUD S.K LERIK Kupang dengan menggunakan teknik Accidental sampling kemudian dilakukan uji sensitifitas menggunakan metode difusi. Hasil penelitian menunjukkan dari 20 sampel uji yang telah diidentifikasi, 18 sampel merupakan bakteri basil Gram negatif. Escherichia coli diisolasi dari 14 sampel uji, sedangkan 4 sampel uji tidak dapat diidentifikasi karena keterbatasan dalam penelitian. Hasil uji sensitivitas menggunakan antibiotik Cefotaxime 30g dan Ceftriaxone, 2 dari 18 sampel uji menunjukkan hasil resisten. Pada uji Double Disc Sinergy Test, 2 sampel uji yang telah resisten tidak memproduksi ESBL. Key word : ESBL, Enterobacteriaaceae, Cefotaxime, Ceftriaxone