BAB III

METODOLOGI PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian
eksperimental laboratorik dengan teknik disc diffusion untuk melihat pengaruh
ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap pertumbuhan bakteri
Propionibacterium acnes.
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah adalah alat-alat gelas
(Iwaki pyrex), alat tulis, autoklaf (LD 2X -40S dan All American no 25X), blender
simplisa, bunsen, cawan penguap, cawan petri, desikator, hot plate (HP 10-2),
inkubator (Memmert), jangka sorong, jarum ose, kamera foto digital (Sony),
korek api, krusibel porselen, label, laminar air flow (LAF) cabinet, lemari
pendingin (Toshiba), mikropipet, mortar, stamper, neraca analitik (Shimadzu
AUY-220), pH-meter (Milipore), plastik tahan panas, pinset, rak tabung, sendok
tanduk, swab kapas, termometer, tisu, vacuum rotary evaporator (Heldolph tipe
Basis Hei-VAP Value), water bath (Memmert tipe WNB-14).
III.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia daun
sirih merah (Piper crocatum), pereaksi Mayer, pereaksi Dragendroff, besi (III)
klorida (FeCl3) 5%, ammonia 1%, asam asetat anhidrida, larutan kalium
hidroksida (KOH) 5%, etanol 96%, larutan natrium klorida (NaCl) 0,9%, akuades
steril, media Mueller-Hilton Agar (MHA), darah kambing steril, asam klorida

(HCl) pekat, asam sulfat (H2SO4) pekat, kloroform (CHCl3), larutan standar
McFarland no 0,5, kultur bakteri Propionibacterium acnes, cakram, dan
klindamisin.
III.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Program Studi
Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Tanjungpura pada bulan Januari-Maret
2016.
III.3 Populasi dan Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun dari
tanaman sirih merah (Piper crocatum) yang diduga memiliki aktivitas antibakteri.
daun sirih merah (Piper crocatum) diperoleh didaerah sekitar Jalan Tanjung Raya
2, Pontianak.
III.4 Besar Sampel
Besar sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah berdasarkan
rumus sebagai berikut(48):
n=

(Z + Z)2 2 D
2

Keterangan :
n

= besar sampel minimal

= batas atas nilai konversi pada tabel distribusi normal untuk batas
kemaknaan (1.96)

= batas bawah nilai konversi pada tabel distribusi normal untuk batas
kemaknaan (0.85)

D/ = 1

= tingkat signifikan (0,05)

Maka hasil perhitungan sampel adalah sebagai berikut :

n

= (1,96 + 0,85)2 2 D
2

= 7.896

=8

Jadi besar sampel minimal berdasarkan perhitungan di atas adalah 8 sampel untuk
tiap kelompok.(48)
III.5 Variabel penelitian
Variabel dalam penelitian ini ada dua yaitu variabel terikat dan variabel
bebas. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah pertumbuhan bakteri
Propionibacterium acnes, yang kemudian dilakukan pengukuran zona hambat
yang terbentuk. Sedangkan variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak
etanol daun sirih merah (Piper crocatum) dengan konsentrasi 2,5%, 5%, dan 10%
III.6 Definisi Operasional
Definisi operasional dalam penelitian ini adalah :
a. Propionibacteium

acnes

merupakan

bakteri

yang

diperoleh

dari

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

b. Ekstrak daun sirih merah adalah jumlah sediaan pekat yang diperoleh
dengan mengektraksi zat aktif dari tanaman daun sirih merah
menggunakan pelarut yang sesuai yaitu etanol 80%.

c. Kontrol negatif pada penelitian ini adalah kelompok kontrol yang tidak
menghasilkan efek atau perubahan pada variabel terikat. Pada penelitian
ini yang digunakan adalah akuades steril.
d. Zona inhibisi adalah diameter zona inhibisi yang tampak bening dan
terbentuk di area medium pertumbuhan setelah diberikan cakram yang
berisi ekstrak etanol daun sirih merah.
III.7 Jalannya Penelitian
III.7.1 Pengumpulan Sampel
Metode pengumpulan sampel secara non-random dan dilakukan secara
purposif yaitu dengan maksud dan tujuan tertentu, tanpa membandingkan dengan
tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang digunakan untuk penelitian
adalah daun sirih merah diambil pada pagi hari pukul 8-10 pagi di Jalan Tanjung
Raya 2, Pontianak.
III.7.2 Determinasi Tanaman
Identifikasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani
Pusat Penelitian Biologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
III.7.3 Pengolahan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, tanpa membandingkan
tumbuhannya dengan tumbuhan daerah lain. Sampel yang digunakan daun sirih
segar (Piper betle Linn.) diperoleh dari daerah Pancur Batu kabupaten Deli
Serdang, Sumatera Utara, Medan. Daun sirih segar dibersihkan dari kotoran,
dicuci dengan air sampai bersih, dipotongpotong, ditiriskan, dikeringkan,
kemudian sampel diblender sampai menjadi serbuk.

III.7.4 Ekstraksi Sampel

Serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 80%, dibiarkan pada suhu
kamar (28-32C) selama 2 hari terlindung dari cahaya dan sering diaduk,
kemudian dipisahkan, ampas dimaserasi kembali dengan pelarut etanol 80% dan
dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas sampai diperoleh maserat jernih.
Semua maserat diuapkan dengan bantuan alat rotary evaporator sampai diperoleh
ekstrak etanol kental, kemudian ekstrak dikeringkan di freeze dryer (-40oC)
hingga diperoleh ekstrak kering daun sirih merah.
III.7.5 Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak
III.7.5.1 Skrining Fitokimia
III.7.5.1.1 Pemeriksaan Tanin
Besi klorida 5% sebanyak 2 ml ditambahkan pada 1 ml ekstrak.
Terbentuknya warna biru atau hijau gelap menandakan adanya tanin.(37)
III.7.5.1.2 Pemeriksaan Flavonoid
Larutan ekstrak sebanyak 1 ml ditambah dengan sedikit serbuk
magnesium sebanyak 1 gram dan larutan HCl pekat. Perubahan warna larutan
menjadi warna merah menandakan adanya flavonoid.(38)
III.7.5.2 Penetapan susut Pengeringan
Penetapan susut pengeringan adalah pengukuran zat sisa setelah
pengeringan pada temperatur 105oC selama 30 menit atau sampai berat konstan
yaitu tidak terjadi lagi perubahan bobot atau tidak terjadi lagi perubahan yang
signifikan (tidak lebih dari 5%). Ekstrak ditimbang sebanyak 1 sampai 2 gram
dan dimasukkan kedalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah

dipanaskan pada suhu 105oC selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang
ekstrak diratakan dalam botol timbang, dengan menggoyangkan botol, hingga
merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm-10 mm. Jika ekstrak yang diuji
berupa ekstrak kental, diratakan dengan bantuan pengaduk. Kemudian
dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya. Keringkan pada suhu
105oC hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam
keadaan tertutup mendingin dalam desikator hingga suhu kamar.(34) Susut
pengeringan dihitung dengan persamaan 1.

Susut pengeringan=

(berat awalberat akhir ekstrak )

x 100 .............................
berat awal ekstrak

......(1)
III.7.6 Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi alat dan bahan dengan cara menutup alat-alat yang telah
disterilkan dengan alumunium foil dan kapas. Semua alat dan bahan tersebut
dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi (per
square inch) selama 15 menit, untuk alat-alat gelas disterilkan di oven suhu 160 o170oC selama 2 jam. Bahan-bahan yang terbuat dari karet disterilkan dengan cara
direndam dalam alkohol 70% dan jarum ose disterilkan dengan cara flambir pada
nyala bunsen. Pengerjaan uji mikrobiologi dilakukan secara aseptis di dalam
lemari aseptis yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu
disinari dengan lampu UV yang dinyalakan 15 menit sebelum digunakan.(39)
III.7.7 Pembuatan Media

III.7.7.1 Mueller-Hinton Agar (MHA) + 5% Darah Kambing

Serbuk MHA 38 gram dilarutkan dalam 1 L akuades hingga terlarut
sempurna. Dipanaskan dan diaduk hingga mendidih selama 1 menit. Media
diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, kemudian didinginkan. Setelah
dingin ditambahkan darah kambing steril yang telah didefibrinasi sebanyak 5%
dan diukur pH hingga 7,30,1. Media yang telah dingin kemudian digunakan
untuk penanaman bakteri dengan metode sebar.(39)
III.7.8 Penyiapan Inokulum
III.7.8.1 Peremajaan Bakteri Propionibacterium acnes
Satu biakan bakteri Propionibacterium acnes dari media diambil dengan
jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media MHA dengan 5%
darah kambing miring, kemudian diinkubasi pada suhu 352oC selama 18-24 jam.
(31)

III.7.8.2 Pembuatan Suspensi Inokulum

Inokulum dibuat dengan mengisolasi koloni bakteri Propionibacterium
acnes dari agar yang telah ditumbuhkan antar 18-24 jam, kemudian disuspensikan
kedalam larutan NaCl 0,9%. Suspensi dihomogenkan dengan alat vortex suspensi
yang dibuat kemudian disesuaikan kekeruhannya dengan larutan standar
McFarland 0,5 yang setara dengan 1,5x108 CFU/ml.(40)
III.7.8.3 Inokulasi Bakteri
Suspensi inokulum yang telah dibuat diambil menggunakan cotton swab
steril dengan cara mencelupkannya ke dalam suspensi, kemudian digores pada
permukaan media. Penggoresan dilakukan sebanyak dua kali dengan arah yang

berlawanan. Media yang telah diinokulasikan kemudian dibiarkan dalam keadaan

tanpa tutup selama 3-5 menit untuk mengurangi kelembaban pada media sehingga
dapat ditaruh kertas cakram yang berisi sampel.(41)
III.7.9 Pembuatan Larutan Ekstrak
Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah yang divariasikan dengan
menggunakan pelarut akuades steril yaitu 10%, 20%, 40%, 60%, dan 80%.
Kontrol negatif yang digunakan adalah akuades steril dan kontrol positif adalah
antibiotik klindamisin. Semua konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dibuat
dalam 5 ml :
a. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 2,5%
Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah adalah dengan
melarutkan 0,125 gram ekstrak etanol daun sirih merah di add kan dengan
akuades steril hingga 5 ml.
b. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 5%
Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah adalah dengan
melarutkan 0,25 gram ekstrak etanol daun sirih merah di add kan dengan
akuades steril hingga 5 ml.
c. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 10%
Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah adalah dengan
melarutkan 0,5 gram ekstrak etanol daun sirih merah di add kan dengan
akuades steril hingga 5 ml.
III.7.10 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak

Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan
dengan metode disc diffusion. Larutan ekstrak dengan masing-masing konsentrasi
2,5%, 5% dan 10% serta kontrol negatif sebanyak 20L dipipet ke kertas cakram.
Kertas cakram kemudian diletakkan pada permukaan media Mueller-Hilton Agar
(MHA) dengan 5% darah kambing yang telah diinokulasikan bakteri
Propionibacterium acnes. Petri dibiarkan pada suhu ruang selama 1 jam sebelum
diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Aktivitas antibakteri diukur dengan
mengukur diameter zona hambat. Untuk kontrol negatif digunakan akuades steril.
Pengujian dilakukan 3 kali pengulangan. Setelah diinkubasi diukur zona hambat
dengan menggunakan jangka sorong.(41)
III.8 Analisis Hasil Penelitian
Uji normalitas data dilakukan dengan uji Saphiro-Wilk. Uji homogenitas
data dilakukan dengan uji Levenes test of Homogenity of Variance. Data
kemudian dianalisis dengan One Way ANOVA (Analysis of Varians) untuk
membandingkan nilai signifikansi diameter zona hambat dari ekstrak konsentrasi
2,5%, 5% dan 10% kontrol positif dan kontrol negatif.