Studi Perbandingan Hidroksiapatit yang Berasal dari Cangkang Telur dan

Hidroksiapatit Sintetis untuk Regenerasi Tulang.

Sang-Woon Lee, DDS,a Seong-Gon Kim, DDS, PhD,a Csaba Balzsi, PhD,b Weon-Sik Chae,
PhD,c Hee-Ok Lee,c Gangneung, REpub;lik Korea: dan Budapest, Hungaria
UNIVERSITAS

NASIONAL

GANGNEUNG-WONJU

dan

UNIVERSITAS

SAINS

HUNGARIA

TUJUAN : Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi sifat fisik hidroksiapatit sintetis
(synthetic hydroxyapatite /sHA) dan hidroksiapatit yang berasal dari cangkang telur(
hydroxyapatite from eggshells / eHA) dengan Fourier-transform infrared (FT-IR) dan x-ray
diffraction (XRD), dan untuk membandingkan kemampuan regeneratif dari tulang menggunakan
sHA dan eHA dalam suatu model penelitian dengan menggunakan kelinci calvarial yang
memiliki kelainan (defek).
DESAIN PENELITIAN : FT-IR dan XRD digunakan untuk membandingkan sifat fisik dari
sHA dan eHA. sHA yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Sigma, dan eHA merupakan
hasil sumbangan dari sebuah akademi Sains di Hungarian. Enam belas ekor kelinci putih New
Zealand digunakan untuk penelitian ini. Setelah terbentuknya suatu kelainan (defek) bilateral
dari tulang parietal (diameter 8,0 mm), kemudian dilakukan pencangkokan baik sHA atau eHA
pada kelainan (defek) yang terbentuk. Kelainan yang terjadi pada kelompok kontrol tidak
diberikan perlakuan (tindakan). Regenerasi dari tulang dievaluasi dengan histomorfometri pada
minggu 4 dan 8 setelah operasi.
HASIL: Puncak luasnya percobaan XRD, dilakukan dengan penyesuaian melalui pengamatan
menggunakan mikroskop elektron, sHA memiliki ukuran butiran yang lebih kecil dibandingkan
dengan eHA. eHA memiliki senyawa tunggal CaO (International Center for Diffraction Data
(ICDD) 075-0264) dan Ca (OH)2 (ICDD 072-0156). Jumlah total tulang baru yang terbentuk
adalah 17,11 10,24% pada kelompok kontrol, 28.81 12,63% pada kelompok sHA, dan 25,68

 10,89% pada kelompok eHA pada minggu ke 4 setelah operasi. Perbedaannya tidak signifikan
secara statistik (P> 0,05). Jumlah total tulang baru yang terbentuk pada minggu ke 8 setelah
operasi adalah 27.50 10,89% pada kelompok kontrol, 38,62 17,42% pada kelompok sHA,
dan 41.99 8.44% pada kelompok eHA. Bila dibandingkan antara kelompok sHA dengan
kelompok kontrol, perbedaannya tidak signifikan secara statistik (P> 0.05). Namun, kelompok
eHA secara signifikan berbeda dari kelompok kontrol (P = 0,038). Bila dibandingkan kelompok
eHA dengan kelompok sHA, perbedaan tersebut tidak signifikan secara statistik (P> 0,05).
KESIMPULAN : Kedua tipe dari hidroksiapatit (hydroxyapatite /HA) memperlihatkan
pembentukan tulang yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Namun, eHA memiliki pembentukan tulang yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan
kelompok kontrol pada minggu ke 8 setelah operasi

Hidroxyapatite (HA) adalah salah satu zat inorganik yang penting dari tulang dan gigi.
Ketika tulang terputus karena alasan apapun, proses restorasi tulang penting untuk alasan estetik
dan fungsional. Karena HA merupakan bahan utama dari jaringan tulang, banyak tipe dari
material graft tulang memiliki HA sebagai komponen utamanya. Sebagai tambahan, HA bisa
dihasilkan dari banyak sumber, seperti tulang sapi, karang, dan tulang manusia terdeproteinisasi.
Sebagai material graft tulang, HA memiliki kemampuan osteokonduksi. HA akan
menempati area yang terbentuk oleh defek tulang dan digantikan oleh tulang yang beregenerasi
secara bertahap. Kecepatan regenerasi tulang pada defek bergantung pada kecepatan penggantian
jaringan. Bila HA berdegradasi pelan-pelan, defek akan ditempati oleh HA dalam waktu yang
lama. Hipotesis ini telah didukung oleh observasi klinis. HA sapi telah di observasi pada sinus
maksilaris manusia sepuluh tahun setelah prosedur pengangkatan sinus. Namun, komplikasi
akibat degradasi HA yang lambat masih belum diketahui secara luas. HA sebagai bahan graft
bukan merupakan struktur yang baik. Walaupun HA menempel berkontak dengan permukaan
dari implan gigi, ikatan langsung antara HA dan implan gigi tidak dapat berlangsung. Implan gigi
hanya bisa osseointegrate pada jaringan tulang yang hidup. Selain itu, partikel HA hanya akan
seperti kerikil diatas semen.

Faktor yang berhubungan dengan kecepatan degradasi dari HA masih kebanyakan belum
diketahui. Tekstur mikro dari permukaan mungkin berpengaruh terhadapt kecepatan degradasi
dari HA. Respon seluler dari material graft sangat bergantung pada tekstur permukaan dari
material graft. Faktor lainnya yang mungkin ikut berpengaruh pada kecepatan degradasi HA
adalah ketidakmurnian material graft. Bila material graft terbuat dari bahan alami, beberapa
senyawa kalsium, seperti kalsium fosfat atau kalsium oksida, mungkin tidak bisa dilepaskan
seluruhnya. Ketidakmurnian ini mungkin berpengaruh pada pada aktivitas biologis di sekitar
implan gigi. Baru-baru ini, HA telah dibuat dari cangkang telur. Karena cangkang telur
merupakan sumber yang berasal dari sisa makanan dan sangat tersedia, proses mendaur ulang
dan menjadikannya material graft tulang bisa memberikan beberapa keuntungan. Prosedur
produksi HA dari cangkang telur (eHA) adalah hal yang sesederhana carcination (ga ada definisi
inggrisnya) dan mengiling. Namun, terdapat beberapa jurnal yang dipublikasi menunjukan hasil
penelitian eHA terhadap material graft tulang.
Tujuan dari studi ini adalah: 1) untuk mengevaluasi sifat fisik dari HA sintetik murni
(sHA) dan eHA dengan mengunakan Scanning Electron Microscopic (SEM), spektral serapan
Fourier-transform infrared (FT-IR), dan difraksi X-ray(XRD); dan 2) untuk membandingkan
kemampuan regenerasi dari tulang menggunakan sHA dan eHA pada model defek kalvari
kelinci.

Alat dan Metode Penelitian

Hidroxiapetit sintensis (sHA) dibeli dari Sigma (Cat no. 12167.74.7) dan eggshells
hidroxiapetit (eHA) secara sukarela disumbangkan dari Institut Sains Hongaria.

Pencitraan Mikroskop Elektron (SEM : Scanning Electron Microscope)

Pencitraan SEM untuk Hidroxiapetit (sHA dan eHA) dilakukan dengan mikroskop Su-70
(Hitachi, Jepang) yang beroperasi pada 5 KeV.

Difraksi X-Ray dan Fourir-transform infrared (FT-IR) Absorbance spectra

Desain XRD dilakukan pada difraktometer (PANalytical XPert Pro MPD) yang
dilengkapi dengan sebuah detektor pixel (256 saluran) dan menggunakan Cu-K ( = 1.5418 )
sebagai sumber radiasi yang dihasilkan pada voltase 45 KV dan arus 40 mA. Sampel diletakan
pada sebuah pemegang kaca dan diuji antara 250 sampai 800 (2) dengan ukuran 0,0260 dan
waktu 500 detik untuk setiap langkahnya, sehingga total waktu pengukuran 72 menit untuk
setiap desain difraksi yang menggunakan detector pixel multichannel. soller dan divergent slits
berturut-turut pada 0,04 rad dan 0,30 C. Ciri khas kimiawi dari setiap sampel ditentukan dengan
membandingkan pengujian desain XRD terhadap acuan standar yang telah disusun oleh ICCD
(International Center for Diffraction Data).
FT-IR absorbance spectra, diperoleh menggunkan sebuah mikroskop 300 hiperion (optic
Brucar) yang dilengkapi dengan sebuah Germanium Ge-attenuated total reflectances (ATR)
dengan lensa objektif 20X dan sebuh detektor MCT (Mercury cadmium telluride) yang
dilekatkan pada spektometer Fourier transformasi (Verteks 80; Optik Brucar), dengan Ge-onKBr pembias cahaya. Spectrum direkam antara panjang gelombang 600 cm-1 sampai 4000cm-1
pada resolusi 2 cm-1 dan rata-rata diulang 32 kali per spektrum.

Prosedur pada Hewan dan Pembedahan

Pada percobaan ini digunakan 16 kelinci putih New Zealand berumur 4 bulan, dengan
berat badan rata-rata 2,8 kg (dalam rentang 2,5-3,0 kg) yang telah disetujui oleh Institutional
Animal Care and Use Commitee of Gangneung-Wonju National Universitu, Gangneung, Korea
(no.2010-16).
Anestesi umum berupa kombinasi dari 0,4 mL ketamin (100 mg/mL; Ketara;
Yuhan, Seoul, Korea) dan 0,3 mL xylazine (10 mg/kg body weight; Rompun; Bayer Korea;
Seoul; Korea) diinduksikan dengan injeksi secara intramuskular. Daerah kranium dicukur,
kemudian disterilkan menggunakan povidine-iodine. Sebuah insisi longitudinal dilakukan pada
tulang tengkorak mulai dari tulang nasal hingga penonjolan oksipital. Kemudian dilanjutkan

dengan insisi midline pada periosteum. Pembedahan tajam pada subperiosteal memisahkan
bagian pericranium dari tulang kranium sehingga memperlihatkan tulang parietal. Alat yang
digunakan ialah dental trephine bur dengan irigasi copius saline untuk membentuk defek
calvarial dengan kedalaman penuh secara bilateral. 2 buah defek dengan diameter 8 mm dibentuk
masing-masing di sebelah midline. Kedua jenis pencangkokkan, sHa atau eHa, ditempatkan pada
defek calvarial tersebut. Beberapa defek dibiarkan tetap kosong sebagai kontrol. Penetapan tiap
kelompok dilakukan secara acak, dan tiap kelompok terdiri dari 10 hewan (10 defek tiap
kelompok). Tidak ada hewan yang menerima jenis pencangkokkan yang sama pada kedua defek
calvarial. Desain experimental yang dilakukan pada penelitian yang telah dipublikasikan dahulu
digunakan sebagai referensi dari rencana penelitian saat ini.17 Kemudian pericranium dan kulit
ditutup menggunakan benang 3-0 silk. Sesudah pembedahan, kelinci-kelinci tersebut diberi
gentamicin 1 mg/kg (Kookje, Seoul, Korea) secara intramuskular sebanyak 3 kali sehari selama
3 hari. Tiap kelinci dikandangkan secara individual dan menerima makanan serta minuman. Pada
penelitian sebelumnya direkomendasikan untuk menentukan poin observasi. 8 hewan dibunuh
pada minggu keempat dan kedelapan. Ukuran dari spesimen calvarial yang terbesar adalah 25 x
12 x 3 cm, termasuk kedua defek. Hewan tersebut ditetapkan menggunakan 10% formalin.
Evaluasi histomorfometri
Tulang didehidrasi dalam larutan etanol dan didekalsifikasi dengan menggunakan asam
format 5% selama 2 minggu. Tulang parietal kiri dan kanan dipisahkan oleh garis tengah dari
sutura sagitalis. Kedua segmen ditanam pada blok parafin untuk memperlihatkan bagian
sagitalis. Bagian tersebut kemudian diiris dan dilakukan pewarnaan dengan mason trichrome.
Bagian yang dipilih adalah bagian dengan daerah defek terluas, potongan dari 50 um sebelum
dan sesudah bagian tersebut juga ikut dipilih. Gambaran digital dari bagian yang terpilih diambil
dengan menggunakan kamera digital (DP-20; Olympus, Tokyo, Jepang). Gambar-gambar
tersebut kemudian dianalisis dengan menggunakan Sigma Scan Pro (SPSS, Chicago, IL).
Jumlah seluruh tulang baru dihitung sebagai nilai presentase dari seluruh bagian defek.

Analisis statistika
Independent sample t test digunakan sebagai pembanding kelompok tersebut. Tingkat
signifikan statistika ditentukan pada nilai p < 0.05.

Hasil
Hasil SEM, XRD, dan FT-IR
Gambaran SEM menunjukkan bahwa ukuran butir dari komponen sHA <1 um sedangkan
eHA memiliki ukuran butir >1 um (gambar. 1, A dan B). Berdasarkan hal tersebut kekasaran
mikroskopis dari permukaan sHA juga menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan eHA.
(gambar. 1, C dan D). Spektrum serapan inframerah yang diobservasi menunjukkan karakteristik
vibrational modes dari sAH (gambar. 2). Dua serapan vibrational pada 1,090 dan 1,045 cm-1
ditentukan menjadi PO43- v3 asymmetric stretching mode dari HA. Penyerapan dari 962 dan 632
cm-1 ditentukan menjadi PO43- v1 dan v4. Penyerapan vibrational dari karbonat ( CO32-) juga
dideteksi pada 1,647 (v3) dan 870 cm-1 (v2) dengan sedikit pengaruh. Ikatan seluruh serapan
pada daerah 3,000-3,700 cm-1 dihubungkan dengan penyerapan air, hal ini didukung oleh ikatan
lemah H-O-H pada 1,604 cm-1. Puncak penyerapan yang lemah pada 3,571 cm-1 ditentukan
sebagai kelompok -OH pada HA.

Analisa Histomorphometrik
Hasil dari histomorphometric diperlihatkan pada tabel 1. Total dari tulang baru adalah
17.11 10.24% dalam grup kontrol 4 minggu setelah tindakan. 28.8112.63% dalam grup sHA
dan 25.6810.89% dalam grup eHA. Dimana perbedaan tidak signifikan secara statistik
(P>0.05). dari grafik residual 40.6312.19% dalam grup sHA dan 16.843.74% dalam grup
eHA 4 minggu setelah tindakan. Perbedaan signifikan menurut statistik (P=0.001). eHA dan sHA
memiliki respon inflamasi yang rendah.
Total tulang baru dalam 8 minggu setelah tindakan 27.5010.89% pada grup kontrol.
38.6217.42% dalam grup sHA dan 41.998.44% dalam grup eHA. Dibandingkan grup sHA

dengan grup kontrol unfilled perbedaan secara statistik tidak signifikan (P>0.05). Namun,
perbedaan eHA dengan grup kontrol cukup signifikan secara statistik (P=0.038). Tulang lamella
terorganisir dengan baik pada grup eHA. Ketika dibandingkan grup eHA dan grup sHA secara
statistik tidak terdapat perbedaan yang signifikan. (P>0.05). residual graft 28.12 9.58% dalam
grup sHA dan 9.604.95% pada grup eHA pada 8 minggu setelah tindakan. Perbedaan cukup
signifikan secara statistik (P=0.005)
Diskusi
Pada penelitian ini, grup eHA menunjukkan regenerasi tulang yang lebih tinggi
dibandingkan grup kontrol pada minggu ke-8 setelah tindakan. Walaupun grup sHA memiliki
regenerasi tulang yang lebih tinggi dari grup kontrol. Secara statistik perbedaannya tidak
signifikan. Penyebabnya mungkin berhubungan dengan statistikal error tipe II akibat sample
yang sedikit dan besarnya standard deviasi karena kulit telur merupakan produk dari sisa
makanan selain murah, kulit telur juga mudah didapat dan ramah lingkungan. Dengan
pertimbangan sHA masih didapatkan dalam 8 minggu pembentukan tulang masih bergantung
dengan partikel sHA yang tersisa. Variasi yang banyak dari rata-rata pembentukan tulang pada
grup sHA mungkin akibat variasi dari bahan graft yang tersisa.
Partikel dengan ukuran kecil memiliki permukaan yang lebih luas dibandingkan dengan
partikel ukuran besar yang memiliki berat molekul yang sama. Oleh sebab itu partikel dengan
ukuran kecil lebih mudah dikeluarkan dari tubuh. Partikel granul dari sHA lebih kecil
dibandingkan eHA. Permukaan dari sHA lebih kasar dibandingkan eHA. Kasarnya permukaan
tidak mempengaruhi sel osteogenic namun menghambat proliferasi sel. Agregasi dari sHA
tampak lebih ketat dibandingkan eHA. Namun, ukuran partikel sHA lebih besar dari eHA, oleh
sebab itu eHA lebih mudah dikeluarkan dari tubuh. Keefektifan tertinggi pada eHA pada XRD
lebih tinggi dari sHA. Oleh sebab itu kristal pada eHA lebih tinggi dari sHA. Kristal HA yang
lebih tinggi memiliki efek osteogenik lebih tinggi dibandingkan dengan kristal HA yang rendah.
Ukuran HA bukanlah penentu utama dalam kecepatan degradasi. Area defek diisi dengan tulang
regenerasi dalm grup eHA dan eHA partikel yang tersisa disatukan dengan tulang yang
diregenerasi pada minggu ke-8 setelah tindakan. Namun, kebanyakan sisa partikel sHA masih
ditemukan pada minggu ke-8 dan tampak seperti gelembung-gelembung setelah proses
dekalsifikasi.

Apabila dental implant dipasang pada area graft dengan sHA, area dental implant yang
menuju graft lebih besar dibandingkan dengan grup eHA. eHA memiliki fase tidak murni dari
CaO (ICDD075-0264) dan Ca(OH)2 dan karbonat dalam jumlah yang sedikit. Ketidak murnian
dapat ditemukan saat pengambilan sample. Komponen ini dapat resisten terhadap proses
dekalsifikasi. Apabila CaO, Ca(OH)2, dan karbonat lebih cepat didegradasi oleh tubuh.
Degradasi yang cepat dari eHA dapat dijelaskan melalui degradasi progresif dari HA tricalcium
fosfat akibat dari resorpsi tricalcium fosfat.
Comparative Study of Hydroxyapatite From Eggshells And Synthetic Hydroxyapatite For
Bone Regeneration
Ada banyak produk komersial yang menggunakan bahan dasar hidroksiapatit. Walaupun
kecepatan degradasinya berbeda-beda pada setiap subjek penerima transplantasi, namun material
yang tersusun dari hidroksiapatit tidak cepat mengalami proses degradasi. Degradasi yang terjadi
secara lambat akan menimbulkan banyak komplikasi seperti infeksi pada penerima transplantasi
dan hilangnya integritas tulang. Hidroksiapatit punya permukaan yang kasar sehingga
memudahkan terjadinya perlekatan mikroorganisme. Beberapa jenis implant gigi permukaannya
dilapisi oleh hidroksiapatit. Meskipun ada banyak komtroversi,namun implant yang dilapisi oleh
hidroksiapatit mengalami integrasi yang cepat dengan tulang pada pasien diabetes mellitus.
Tingkat kegagalan pada implant yang dilapisi dengan hidroksiapatit akan menurun 5 tahun sejak
dilakukan proses implantasi. Hal ini dapat terjadi karena hilangnya area di sekitar tulang yang
dijadikan tempat implantasi sehingga meningkatnya paparan terhadap permukaan hidroksiapatit
yang belum diabsorbsi. Jika implant gigi dilapisi oleh hidroksiapatit yang berasal dari cangkang
telur, waktu degradasi dari bahan pelapisnya dapat mengurangi area paparan dari hidroksiapatit
yang belum diabsorbsi 5 tahun setelah proses implantasi.
Dalam hal eHA kalsium dengan cepat diserap dari permukaan karena proses degradasi
yang berakibat meningkatnya konsentrasi kalsium local. Konsentrasi kalsium local penting untuk
regenerasi tulang, namun bila degradasi terlalu cepat, tidak dapat mempertahankan volume yang
hasilnya terjadi resorpsi. Degradasi yang terkontrol penting sebagai material tulang dalam proses
regenerasi.
Kesimpulan

Kedua tipe HA memiliki formasi tulang yang lebih tinggi dibandingkan dengan unfilled
bone, namun eHA memiliki formasi tulang yang jauh lebih tinggi dalam 8 minggu setelah
operasi. Dari pemeriksaan histologis menunjukan material graft yang tersisa jauh lebih rendah
pada eHA dibandingkan dengan sHA.
Karena eHA dihasilkan dari cangkang telur, eHA menjadi material tulang yang ekonomis.
Hasil dari studi terhadap hewan ini tidak dapat diaplikasikan, diperlukan pengawasan dan
percobaan lebih lanjut.