Teknologi DNA Rekombinan

1. Pengklonaan
Rekayasa genetika mampu menghasilkan suatu DNA baru, biasanya dengan cara
menyambung-nyambungkan DNA dari organism-organisme yang berbeda dengan cara-cara
artificial yang menggunakan enzim yang disebut enzim restriksi. Pengklonaan (cloning) adalah
perbanyakan salinan dari DNA yang
telah direkayasa.
Suatu plasmid (vektor) yang sesuai
dipilih untuk menjadi penerima sisipan
gen yang diinginkan (DNA donor).
Lalu, DNA donor dan vektor akan
dipotong dengan enzim restriksi yang
sama, dan kemudian diinkubasi
bersama
dengan
ligase
untuk
menyambungkan
fragmen-fragmen
DNA donor dengan plasmid. Hasilnya
adalah plasmid rekombinan yang
mengandung fragmen DNA yang
diinginkan.
Plasmid
rekombinan
tersebut kemudian digunakan untuk
mentransformasi sebuah sel inang
bakteri sehingga dihasilkan sebuah
galur barudari bakteri tersebutyang
dapat menjaga plasmid rekombinan
dengan stabil.
Tujuan dari pengklonaan adalah
mengisolasi gen atau DNA yang
diinginkan dari suatu organisme dan
memasukkannya ke dalam sel inang
yang sesuai sehingga diperoleh gen atau fragen DNA yang diinginkan dalam jumlah banyak.

2. Restriksi Endonuklease
Enzim restriksi endonuklease adalah enzim-enzim bakteri yang dapat mengenali dan
memotong sekuens nukleotida tertentu di dalam molekul DNA beruntai ganda. Enzim-enzim
tersebut memotong DNA menjadi fragmen-fragmen dengan panjang bervariasi, bergantung
berapa banyak sekuens yang dikenali tersebut di dalam molekul DNA. Hasil potongan enzim

restriksi endonuklease pada DNA dapat berupa fragmen-fragmen dengan ujung yang kohesif
(sticky) atau tumpul (blunt). Contoh enzim restriksi yang menghasilhan potongan ujung kohesif
adalah EcoRI mengenali sekuens 5-GAATTC-3 dan BamHI mengenali sekuens 5-GGATCC-3
dan enzim restriksi yang menghasilkan potongan ujung tumpul adalah HaeIII mengenali sekuens
5-GGCC-3.

3. Vektor
Setelah suatu segmen DNA dipotong dari genom donor menggunakan enzin restriksi
endonuklease, segmen DNA tersebut akan diligasi ke dalam molekul DNA vektor, biaanya
genom suatu plasmid. Ligase adalah suatu enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara gugus 3-hidroksil pada segmen DNA donor dengan gugus 5-fosfat pada
DNA vektor. Vektor adalah molekul DNA yang disisipi DNA asing yang diligasi ke dalamnya.
Vektor dimasukkan ke dalam sel sedemikian rupa sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi.
Karakteristik vektor yang baik adalah stabil, dapat bereplikasi sendiri kecil, mudah diisolasi,
mempunyai berbagai situs pemotongan tunggal, dan mudah dideteksi.

4. Sel Inang
Agar suatu plasmid tertentu dapat direplikasi oleh sel inangnya, maka titik awal situs replikasi
atau origin (oriC-nya) harus dapat dikenali oleh sel. Vektor plasmid rekombinan normalnya
dimasukkan ke sel-sel kompeten sedemikian rupa dan kemudian diseleksi menggunakan medium
kultur sel yang sesuai. Sebagai contoh, jika suatu vektor mempunyai gen ampR yang
mengkodekan resistensi terhadap ampisilin, maka medium kultur yang digunakan harus
mengandung antibiotic ampisilin aga hanya sel yang mengandung gen ampR saja yang dapat
tumbuh. Sel inang yang umum digunakan adalah E. coli dan S. cerevisiae.