RESTRIKSI ENDONUCLEASE

Klasifikasi, Properties and Aplikasi

Raymond J. Williams

Abstrak
Restriksi endonuklease telah menjadi alat fundamental biologi molekuler dengan
banyak vendor komersial dan lini produk yang luas . Sementara sebagian besar telah
mempelajari tentang keragaman restriksi enzim, organisasi genom , dan mekanisme , ini terus
menjadi daerah aktif penelitian dan membantu dalam upaya pengklasifikasian. Baru-baru ini,
salah satu fokus mereka sudah menjadi spesifisitas sempurna untuk mengenali urutan yang tepat
dan pengenalan urutan antara enzim yang kurang homolog pada DNA yang sama. Beberapa
pertanyaan juga tetap mengenai fungsi in vivo. Mutagenesis dan fusi protein berdasarkan
pengetahuan endonuklease menunjukkan harapan untuk rancangan pembelahan yang lazim.
Pemahaman tentang enzim dan sifat mereka dapat meningkatkan aplikasi produktif dengan
mempertahankan parameter inti kritis dan meningkatkan atau menghindari kegiatan alternatif.
Entri indeks : endonuklease restriksi; Sistem R / M; star activity; pembelahan untai tunggal;
spesifik lokasi nickases.
1. Perkenalan
Restriksi Endonuklease, yang
membelah kedua untaian DNA secara
spesifik, adalah alat mendasar biologi
molekuler. Penemuan endonuklease dimulai
pada tahun 1960 dan menyebabkan
ketersediaan komersil di awal 1970-an.
Jumlah enzim tersebut terus berkembang
seperti halnya jumlah vendor dan ukuran
produk mereka. Meskipun ada banyak
kesamaan antara endonuklease dalam hal
struktur, mekanisme, dan penggunaan,
perbedaan tetap penting. Sekarang inti
biologi molekuler, pembatasan endonuclease
tetap area penelitian aktif mereka mengenai
mekanisme pembelahan, fungsi in vivo, asal
evolusi, dan sebagai model untuk situs
pengenalan DNA yang tepat. Enzim asli
yang baru terus ditemukan, enzim yang
dikenal kloning, dan kegiatan baru
endonuklease
dikembangkan
dengan
menggunakan protein teknik dan fusi untuk
menghasilkan polipeptida baru.

1.1 .Fungsi Keanekaragaman

dan In Vivo
Meskipun
pada
awalnya
ditemukan dalam genom bakteri dan
plasmid, restriksi endonuklease juga ada
dalam archaea, virus, dan eukariota.
Diperkirakan bahwa 1 dari 4 bakteri
diperiksa mengandung satu atau lebih (1).
Neisseria dan Helicobacter pylori sumber
yang kaya untuk beberapa enzim dalam satu
strain. Masing-masing, sebanyak 7 dan 14
endonuklease gen telah ditemukan dalam
strain individu, meskipun beberapa gen
dinyatakan tidak aktif (2,3). Termasuk
semua jenis, lebih dari 3500 retriksi enzim
yang dikenali bahwa 259 DNA yang berbeda
urutan sekarang sudah dikenal. Sebagian
besar ini, kira-kira 3460 enzim dikenal 234
urutan DNA, diklasifikasikan sebagai
ortodoks Type II atau subclass Tipe II. Ini
adalah alat umum biologi molekuler dengan
lebih dari 500 enzim terdiri lebih dari 200

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 1

spesifisitas komersial yang tersedia. Selain

itu, 58 endonuklease homing, disebut
demikian karena mereka dikodekan oleh gen
yang mobile, self-splicing introns atau
inteins, masing-masing dengan situs
pengenalan yang unik, telah ditemukan.
Sebanyak 16 lokasi nickase spesifik saat ini
dikenal juga. Semua, 297 resriksi enzim
telah diklon dan diurutkan. Database semua
endonuclease yang dikenal diperbarui
bulanan oleh Dr Richard J. Roberts dan
Dana
Macelis
dan
tersedia
di
http://www.neb.com/rebase.
Sejumlah
format yang tersedia, referensi diberikan,dan
statistic dipertahankan .

yang termetilasi. Juga, situs pengenalan

enzim besar akan cenderung langka di fage
kecil genom. Menghindari situs restriksi
tampaknya lebih penting dalam kelompok
bakteri dari pada kelompok yang sesuai
fage. Para endonuklease umumnya memiliki
paruh hidup lebih panjang dari pada
methylase, yang berpotensi mematikan
masalah bagi host jika methylase tidak benar
dipertahankan. Untuk alasan ini, ia juga
telah mengusulkan bahwa sistem restriksimethylase mungkin mobile, unsur selfish
genetik yang menjadi penting untuk
kelangsungan hidup host setelah diakui sisi
(4, 5).

Restriksi
Endonuklease
yang
awalnya bernama karena kemampuan
mereka untuk membatasi pertumbuhan fage
dalam host sel bakteri dengan pembelahan
DNA yang diserang. Dengan cara ini,
mereka dapat bertindak sebagai sistem
perlindungan bakteri. DNA dari host
dilindungi dari restriksi oleh aktivitas suatu
methylase (s),yang diketahui urutan yang
sama seperti restriksi enzim dan methylates
nukleotida tertentu (4-methylcytosine, 5methylcytosine, 5- hydroxymethylcytosine,
atau 6-methyladenine) pada setiap untai
dalam urutan ini. Setelah alkohol, host DNA
tidak lagi substrat untuk endonuklease
tersebut. Karena kedua untai DNA host
termetilasi dan bahkan DNA hemi-alkohol
dilindungi, DNA inang baru direplikasi tidak
dicerna oleh endonuklease

2. Nomenklatur dan Organisasi Genomic

Enzim individu diberi nama sesuai
dengan usulan Smith dan Nathans (6).
Secara singkat, tiga huruf dalam huruf
miring yang berasal dari huruf pertama dari
genus dan dua huruf pertama dari spesies
mikroba darimana enzim itu berasal.
Tambahan huruf tanpa italics mungkin
digunakan untuk menunjuk strain tertentu.
Ini diikuti oleh angka romawi untuk
menandakan
pertama,
kedua
,dan
sebagainya, enzim yang ditemukan dari
organisme. Dapat disimpulkan dari sejumlah
besar enzim dan terbatasnya jumlah urutan
DNA berbeda yang mereka akui, banyak
enzim dari sumber biologis yang berbeda
dikenali dari urutan DNA yang sama dan
disebut isoschizomers. Sebuah subset
dimana dua enzim dikenali urutan DNA
yang sama tetapi membelah pada posisi
yang
berbeda
disebut
sebagai
neoschizomers.
Poin
penting
untuk
menekankan sebagai hasil dari cloning dan
urutan perbandingan adalah bahwa sedikit
homolog
antara
endonuklease
dan
methyltransferase urutan DNA yang sama.
Selain itu, bahkan restriksi isoschizomers
dapat menunjukkan sedikit atau tidak ada
homologi, termasuk asam amino yang
terlibat dalam pengenalan, dan dengan

Peran
restriksi
endonuklease
sebagai
system
perlindungan
dapat
disederhanakan
namun
berbagai
karakteristik menurunkan potensial enzim
yang protektif. Tidak akan ada efek pada
fage tanpa setidaknya DNA untai ganda
intermediate atau untuk DNA yang juga
dimodifikasi pada kondisi kritis. Sejumlah
kecil fage dapat termetilasi oleh host
sebelum restriksi dapat terjadi, dan sehingga
dapat menyebarkan protektif sendiri salinan

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 2

demikian kandidat baik untuk studi banding

interaksi protein-DNA. Sebagai contoh,
enzim HhaII dan HinfI keduanya terisolasi
dari strain Haemophilus, mengenali
GANTC, dan bersatu antara G dan A.
Namun , mereka berbagi hanya 19 %
identitas
urutan
asam
amino
(7).
Endonuclease / sistem methylase mengakui
urutan yang sama juga menunjukkan pola
metilasi yang berbeda dan sensitivitas
restriksi. Hanya motif umum terbatas asam
amino, PD...D/EXK, telah dibuktikan oleh
mutasi atau analisis struktur untuk
berpartisipasi dalam katalisis untuk 10
endonuklease. Namun, 10 enzim termasuk
anggota yang diklasifikasikan sebagai
Endonuklease tipe II, IIe, IIs, IV, atau intron
dikodekan (8). Sebaliknya, motif umum
telah ditemukan untuk 30 6-metiladenin, 4metilcytosin, dan 5-metilcytosin metilase
(9).
Sebagai sistem / M R, restriksi
endonuklease dan modifikasi methylase gen
bekerja dengan menempel satu sama lain
pada bakteri DNA dan dapat berorientasi
transcriptionally baik secara konvergen,
divergen, atau cara berurutan. Kedekatan
gen ini tampaknya bersifat universal dan
digunakan dalam metode kloning umum
yang disebut sebagai "Trick Hungaria" (10).
Pada
dasarnya,
endonuklease
yang
digunakan untuk mencerna DNA genomik
dari bakteri yang berisi sistem R/M yang
kemudian
menyatu
membentuk
duplikat/klon. Ekspresi vektor yang
digunakan harus mengandung sistem R/M.
Plasmid yang sudah dimurnikan dari klon,
maka kemudian enzim yang menarik in
vitro. Jika plasmid mengandung gen
methylase, maka akan tahan terhadap
terjadinya
pembelahan.
Seringkali,

endonuklease teraktifasi tanpa perlu terjadi

subcloning.
Hal ini diasumsikan bahwa metilasi
harus terjadi sebelum aktivitas restriksi
untuk melindungi DNA inang. Salah satu
bakteri digunakan untuk membatasi
kemungkinan terjadinya restriksi secara
signifikan mengurangi jumlah genom
mereka. Atau, ekspresi methylase mungkin
mendahului endonuklease tersebut. Salah
satu cara yang dapat dicapai adalah melalui
pembacaan lebih dekat yang terletak di
ujung gen endonuklease encoding "C" atau
protein kontrol dalam beberapa sistem R /
M. Protein C ini positif mengatur
endonuklease gen yang memungkinkan
untuk terjadinya aktivitas konstitutif
methylase yang mendahului ekspresi
endonuklease (11). Gen C sering ditemukan
dalam situasi di mana methylase dan
endonuklease gen dalam orientasi transkripsi
divergen atau konvergen . Menggunakan
sistem R / M cloning pada gen C yang
terganggu untuk BamHI, SmaI, PvuII, dan
EcoRV R / M, berbagai gen C dengan
plasmid yang terpisah. BamHI gen C
menstimulasi aktivitas restriksi PvuII juga
sebagai gen PvuII C (12). Alasan mengapa
beberapa gen C merangsang ekspresi
endonuklease alternatif tidak sepenuhnya
dipahami, tetapi fenomena mungkin
memiliki implikasi evolusi untuk sistem R /
M.
3. Struktur, Spesifitas dan Mekanisme
3.1. Klasifikasi dan Mekanisme
Umum
Restriksi Endonuklease
diklasifikasikan
menurut struktur mereka, lokasi ditemukan,

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 3

tempat pembelahan, kofaktor (s), dan

aktivator (s). Kriteria ini digunakan untuk
menentukan jenis (I, II, III, dan IV) dan
subclass (IIe, IIF, IIs, dll), yang dijelaskan
secara rinci pada Tabel 1. Beberapa subunit
dan holoenzyme majelis yang mungkin
untuk mencapai diperlukan restriksi,
methylase, dan spesifisitas domain. Ketiga
domain mungkin hadir pada tiga polipeptida
terpisah, dua polipeptida, atau polipeptida
tunggal. Minimal, semua sistem R / M
berbagi syarat mutlak Mg2+ untuk kegiatan
endonuklease dan AdoMet (juga disebut
sebagai S-adenosyl metionin) sebagai donor
metil untuk aktivitas methylase. Pada
umumnya, restriksi Tipe I memerlukan
Mg2+, AdoMet, dan ATP (yang menjadi
dihidrolisis). Restriksi tipe II hanya
membutuhkan Mg2+, meskipun lokasi
ditemukan keduanya atau AdoMet dapat
distimulasi. Restriksi tipe III memerlukan

Tipe

Contoh

Subunit
struktur
endonuklease
Biasanya
merupakan
kompleks
pentamerik
(2R, 2M, dan
1S)

I
(EC
3,1,2
1,3)

EcoKI,
EcoAI,
EcoBI,
CfrAI,
StySPI,
etc.

Ortho
dox II
(EC
3,1,2
1,4)

EcoRI, Homodimer
BamHI, (2 R-S)
HindIII
,
KpnI,
NotI,
PstI,

Mg+ dan ATP (yang tidak dihidrolisis) dan

dapat dirangsang oleh AdoMet dan lokasi
ditemukan kedua. Jenis Restriksi IV
memerlukan Mg dan AdoMet, serta
memiliki sifat yang tidak biasa membelah
kedua DNA helai di kedua sisi tempat yang
dikenalinya. Endonuklease homing adalah
berbagai perbedaan dari Jenis I-IV. Perlu
dicatat bahwa Eco57I dan seperti enzim,
sebelumnya diklasifikasikan sebagai Tipe IV
(25,26), telah direklasifikasi sebagai Tipe
IIG (16). Selain itu, itu baru diusulkan
dalam artikel ini bahwa enzim yang
sebelumnya diklasifikasikan Type IIb,
termasuk BcgI, Bsp24I, BaeI, CjeI, dan
CjePI, menjadi pindah ke Tipe IV klasifikasi
karena sifat unik mereka seperti disebutkan
di atas. Sebagian besar site ke empat, enam,
atau delapan basis panjang dan palindromic.
Beberapa enzim mengenali situs dengan
tingkat terbatas.

Kofaktor Titik Yang

2
dan
dikenali
aktivator
Mg2+,
Interrupted,
AdoMet, bipartite
ATP
(hidrolisi
r)

Mg2+

Palindromic,
atau
interrupted
palindrome,
ambiguity
diperbolehka
n

Titik pembelahan

Perangkat
Methylase

Jarak dan variabel dari

lokasi
pengenalan,
sebagai contoh, EcoKI :
AAC(N6)GTGC(N>400)
TTG(N6)CACG(N>400)

Dapat
berupa
heterodime
r ( 1 M, 1
S)
atau
heterotrime
r (2 M, 1 S)
Terpisah,
tunggal,
monomer
(M-S),
metiltransf
erase,
beberapa

Ditetapkan, dalam lokasi

pengenalan,
dapat
menghasilkan 3, 5, atau
blunt end, sebagai contoh
EcoRI :
GAATT C
C TTAAG

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 4

SmaI,
XhoI,
etc.

IIe3

NaeI,
NarI,
BspMI,
HpaII,
SacII,
EcoRII,
AtuBI,
Cfr9I,
SauBM
KI, dan
Ksp632
1

IIf

Sfi
I, Homotetrame
NgoM
r (4 R-S)
IV, Cfr
10
I,
Aat II

IIg
(Pem
bentu
k
Tipe
IV)

Eco571
,Bce
831,
HaeIV,
Mme1,
BspLU
11III,
BseMII

Homodimer
(2 R-S) atau
monomer (RS),
menyerupai
Tipe II atau
tipe IIs

R-M-S
monomer

Mg2+,
situs
pengakua
n kedua,
bertindak
sebagai
cis atau
trans,
mengikat
endonukl
ease
sebagai
afektor
allosteric
Mg2+

Mg2+
(AdoMet
)*

sistem
mengandun
g
2
metiltransf
erase
Terpisah,
tunggal,
monometri
k
(M-S),
metiltransf
erase

Palindromic,
palindromic
dengan
ambiguity,
atau
nonpalindro
mic

Potong dengan cara yang

telah ditentukan dalam
situs pengenalan atau
jarak
yang
pendek,
memerlukan
activator
DNA yang mengandung
situs pengenalan untuk
pemotongan
yang
lengkap, sebagai contoh
NaeI :
GCCGGC
CGGCCG

Palindromic,
atau
interrupted
palindrome,
2
lokasi
celah harus
di gunakan
untuk
aktifitas
Nonpalindro
mik

Ditetapkan, dalam lokasi

pengenalan,
dapat
menghasilkan 3 atau 5,
sebagai contoh : NgoM
IV :
G CCGG C
C
GGCCG

Terpisah,
single,
monomer
(M-S),
metiltransf
erase

Pemotongan dari jarak

dekat melalui tempat yg
ditentukan, yang tidak
dipotong menjadi
lengkap. Misalnya
Eco571:
CTGAAG(N)16
GACTTC(N) 14

Terpisah,
tunggal,
monomer
(M-S)
methyltran
sferase
(aktivitas
methylase
dari
pembatasa
n
monomer
hanya

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 5

Iim

DpnI

Homodimer
(2 R-S)

Mg2+

IIs

FokI,
Alw26I
,
BbvI,
BsrI,
EarI,
HphI,
MboII,
PleI,
SfaNI,
Tth111I
, dll

Monomeric
(R-S)

Mg2+

IIt

Bpu10 I Heterodimer
Bsl I
(, ) atau
Heterotetrame
r
(2 , 2)

Mg2+

Palindromik

Memotong dalam titik

Yang dikenali
meninggalkan tumpul
terakhir, titik Yang
dikenali
harus dimetilisasi
Nonpalindro Pemotongan dengan cara
mic,
yang ditentukan dengan
hampir selalu setidaknya
berdekatan
Di luar salah satu tempat
dan
pembelahan. Titik Yang
tanpa
dikenali,
jarang
ambiguitas
meninggalkan
tumpul
berakhir,misalnya,Fokl:
GGATG (N) 9
CCTAC (N) 13

Terputusnya
dua pihak
atau
terputusnya
palindrom

Ditetapkan, titik Yang

dikenali atau dalam jarak
jauh, sehingga 3 ',
misalnya, Bsl I:
C C N N N N N N N G
G
G G N N N N N N N C
C

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

seuntai
methylates)
Tidak ada

Mungkin
salah satu
monomer
(MS)
dengan
satu
methyltran
sferase,
satu
tiap
helai
mungkin
juga
methylate
dengan
nukleotida
yang
berbeda
Mungkin
salah satu
monomer
(M-S) yang
methylates
pada
Kedua
ikatan, atau
monomer
terpisah
(M-S)
methyltran
sferase,
salah satu
untuk
setiap helai
Page 6

III
(EC
3.1.2
1.5)

EcoP15
I,
EcoPI,
HinfIII,
and
StyLTI

R dan M-S
yang diminta

IV
(form
erly
Type
IIb)

BcgI,
Bsp24I,
BaeI,
CjeI,
and
CjePI

Heterotrimer 6
(2 R-M, 1 S)

Intron
atau
intein
yang
dikod
ekan

I-PpoI,
I-CeuI,
I-HmuI
I-SceI,
I-TevI,
PIPspI,
FSceII,
etc.

Monomer,
homodimer,
atau protein
lain, RNA
yang
dibutuhkan

Mg2+,
(AdoMet
)*
ATP
(tidak
terhidroli
sasi) 4
Mungkin
memerlu
kan titik
modifika
si yang
berlawan
an
orientasi,
variabel
dengan
jarak
jauh
Mg2+
AdoMet

Nonpalindro
mik

Pemotongan kira-kira 25
basa dari titik Yang
dikenali, mungkin tidak
dipotong sempurna ,
misalnya,
EcoP15I:
CAGCAG (N) 25-26
GTCGTC (N) 25-26

Adenin
metil, satu
untai
secara
independen

Mengganggu
dua pihak

Mg2+
Dapat
berikatan
dengan
Zn2+

1240 bp,
Toleransi
untuk
substitusi
pasangan
basa yang
ada

Memotong Kedua
untaian sisi Yang
dikenali, simetris,
didefinisikan, jarak
pendek dan daun
3 'serambi, misalnya,
BcgI:
10 (N) CGA (N) 6TCG
(N) 12
12 (N) GCD (N) 6ACG
(N) 10
3 'dan 5' dari 1-10
basa, belum dapat
Ditentukan,
dapat membelah 1 untai
sempuna atau jika tidak
ada Mg2+, 2 enzim
membelah hanya satu
untai, misalya, I-PpoI:
C T C T C T T A A G G
TAG C
G A G A GA A T T C C

Heterotrim
er yang
sama (2RM,1 S)
hanya
methylates
adenines
simetris
pada titik
Yang
dikenali
Tidak ada

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 7

ATC G
Lima kolom pertama daftar contoh dan sifat restriksi endonuklease. Titik Yang dikenali dan
pembelahan Pada contoh pertama diberikan di bawah kolom "titik Pembelahan." Urutan untai
atas diberikan dari 5 'ke 3'. titik Pembelahan ditunjukkan oleh panah. Kolom terakhir merujuk
pada aktivitas methyltransferase. AdoMet, disebut juga sebagai S-adenosyl metionin, selalu
diperlukan untuk metilasi. Ini Perlu dicatat bahwa endonuklease sebelumnya diklasifikasikan
sebagai
Tipe
IV
telah
direklasifikasi
sebagai Tipe IIG (16). Juga, diusulkan untuk pertama kalinya sebelumnya Itu endonuklease
diklasifikasikan sebagai Tipe IIb yang akan Pindah ke klasifikasi tipe IV dikosongkan karena ada
perbedaan yang signifikan dari Jenis lain tipe enzim II. Informasi Disajikan berupa pengetahuan
terbaru dan Penemuan masa depan yang dapat memberikan pengecualian.
*Komponen tersebut merangsang aktivitas yang tidak dibutuhkan. Untuk ulasan, lihat referensi
yang berikut ini: Tipe I (13,14), Tipe II (1,15,16), Type IIe (17,18), Type IIs (19), Tipe III (13),
Type IV (20 21), dan penggerak endonuklease (Intron atau Intein yang dikodekan) (22).
1

R, M, dan S menunjukkan endonuklease, methyltransferase, dan substrat spesifisitas yang

domain mungkin ada sebagai subunit terpisah (R, M, S) atau digabungkan (RS, MS, RM) dalam
polipeptida tunggal. Dalam kasus sistem tipe II, urutan utama dari pembatasan restriksi dan
methyltransferase spesifisitas domain yang sedikit, jika banyak, sama,
2

Meskipun menunjukkan preferensi yang kuat untuk Mg2+, Logam divalen lain mungkin
Pengganti Biasanya Mn2+ Tutapi juga Ca2+, Co2+, Fe2+, Ni2+, dan Zn2+. Namun, spesifisitas dapat
santai dan pembelahan secara signifikan menurun.
3

Banyak isoschizomers ada yang umum Tipe II. Ada bukti yang menunjukkan Eco57I Yang Bisa
juga diklasifikasikan sebagai Tipe IIe (17).
4

aktivitas ATPase yang dilaporkan sebelumnyaadalah 1% Dibandingkan dengan tipe

endonuklease pembatasan I dan ATP karena itu dianggap sebagai kofaktor Daripada substrat.
Namun, bukti yang lebih baru menunjukkan EcoP15I dengan aktivitas ATPase pada Type III
kegiatan endonuklease (23).
5

Dalam mekanisme perlindungan host untuk EcoP15I, DNA hemi-termetilasi sepenuhnya

dilindungi dan DNA yang direplikasi dilindungi oleh fakta kedua, konvergen, dan juga titik yang
benar-benar dimodifikasi diperlukan untuk pembelahan. Mekanisme perlindungan host ini
mungkin benar untuk jenis lainnya sistem III juga (ECOP, HinfIII, dan StyLTI) (23,24).
6

structure tersier ini Telah ditunjukkan hanya untuk BcgI sedangkan struktur dari empat sistem
lain dari jenis ini (Bsp24I, BaeI, CjeI, dan CjePI) tidak diketahui

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 8

Beberapa enzim mengenali bagian

dengan tingkat yang terbatas dari ambiguitas
atau terdiri dari palindrome terganggu.
Ketika kekhususan domain memungkinkan
ambiguitas, substitusi nukleotida yang
mungkin pada posisi tertentu didefinisikan
dan lain-lain yang dikecualikan secara ketat.
Hal ini menyebabkan palindromic dan
sebagian-sebagian palindromic yang diakui
dan dibelah oleh Type II endonuklease.
Sebagaicontoh, bagian pengenalan untuk
StyI terdaftar sebagai CCWWGG. Oleh
karena itu, urutan substrat untuk StyI dapat
palindromic (CCTAGG atau CCATGG)
atau sebagian palindromic (CCTTGG atau
CCAAGG)
(27).
Pengenalan
yang
fleksibilitas saat ini tidak dipahami. Yang
menarik adalah situasi dimana nukleotida
yang diperbolehkan dapat berupa purin atau
pirimidin atau ketika hanya nukleotida
tunggal yang disingkirkan. Kode tunggal
yang ditulis untuk ambiguitas ini adalah
sebagai berikut:
R _ A or G
K _ G or T
B _ not A

Y _ C or T
S _ G or C

(C or G or T)
H = not G)
(A or C or T)

M _ A or C
W _ A or T
D _ not C
(A or G or T)
V = not T
(A or C or G)

N = A or C or G or T
Mekanisme umum untuk bagian
spesifik pembelahan DNA oleh enzim
restriksi melibatkan beberapa langkah.
Pertama, air mulai dikecualikan sebagai
enzim mengikat DNA secara spesifik yang
biasanya hanya melibatkan interaksi dengan
backbone fosfat. Enzim kemudian bergerak

disepanjang DNA oleh difusi linier. Untuk

EcoRV, telah diperkirakan enzim yang
mampu memindai 2 106 pasangan basa
pada tingkat 1,7 106bp s-1selama
pengikatan (28). Pada saat bagian
pengenalan spesifik ditemukan, tambahan
air ditiadakan dan ikatan hidrogen (biasanya
15-20) dibentuk dengan dasar pengenalan
bagian selain kontak dasar van der Waals
dan ikatan hydrogen ke backbone (16).
Urutan pengenalan bagian juga dapat
mempengaruhi ikatan yang spesifik. Untuk
BamHI, ikatan meningkatkan 5400 kali lipat
sebagai oligonukleotida panjang yang
meningkat mulai dari 10 hingga 14 bp dan
variasinya 30 kali lipat berdasarkan yang
terbaik sampai terburuk menjadi kembar tiga
(29). Beberapa perbedaan apakah suatu
ikatan enzim DNA serupa dengan
peningkatan afinitas pada ketiadaan Mg2+.
Kebanyakan enzim, seperti EcoRI, mampu
mengikat secara khusus tanpa Mg2+ namun
tidak dapat membelah. Kelompok ikatan lain
yang serupa dan DNA tidak serupa dengan
afinitas yang relative sama dengan tidak
adanya kation logam divalent meskipun
beberapa kontroversi mengenai sebagian
sisa dari anggota yang diteliti, EcoRV (16,
29). Sebagai bentuk spedifik yang
kompleks, perubahan structural terjadi di
kedua enzim dan DNA. Dalam suatu
dikristalografi di EcoRV, dua DNA-binding /
enzim katalitik diputar 25 sehubungan
dengan satu sama lain dan DNA serupa
melengkung 57 dan 42 dalam dua
perbedaan yang diperoleh (30).
Enzim spesifik : Kompleks DNA
terbentuk dengan adanya Mg2+, ikatan
fosfodiester tertentu di setiap helai dibelah.
Secara singkat, dasar umum menghasilkan

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 9

ion hidroksida yang bertindak sebagai

nukleofil menyerang scissile phosphorous.
Hasil yang negative membebankan keadaan
transisi pentakovalen yang distabilkan oleh
asam Lewis dan asam umum memberikan
proton untuk meninggalkan kelompok,
hidroksil DNA 3'(15). Sebuah variasi dari
mekanisme ini juga dapat terjadi, dengan air
bertindak sebagai nukleofil yang menyerang
lemah dan membutuhkan stabilisasi kuat
pada keadaan transisi dan meninggalkan
kelompok (16). Dikedua kasus, fosfor
ditahan di ujung 5 DNA menjadi terbalik.
Posisi pembelahan dapat menghasilkan
ujung yang tumpul atau single-stranded 3'
atau 5' bergantung antara 1 sampai 4 basa.
Sudah seharusnya dicatat bahwa enzim
dengan perbedaan akhir dari pengenalan
bagian mungkin masih menghasilkan
penggantung yang melengkapi dan oleh
karena itu cocok untuk ligasi, meskipun
pengenalan bagian untuk satu atau kedua
enzim mungkin akan hilang pada produk
ligasi. Misalnya, NariI MspI, AcyI, TaqI,
ClaiI, Csp45I, HpaII, dan AccI semua
menghasilkan
penggantung
5'-CG,
meskipun masing-masing memiliki urutan
pengenalan yang berbeda. Beberapa
informasi yang lebih spesifik mengenai
beberapa jenis enzim dan subkelas yang
diberikan di bawah.
3.2. Ortodoks Endonuklease Tipe II
Secara umum, endonuklease tipe II
adalah homodimer (kebanyakan antara 25
dan 35 kDa untuk subunit monomer), hanya
membutuhkan Mg2+, dan membelah dalam
palindrom,
palindrome
parsial,
atau
palindrome terputus.
Meskipun urutan
utamanya berbeda, endonuklease tipe II

memiliki struktur 3D yang sama : holoenzim

dimerik berbentuk "U" dengan masingmasing subunit yang identik berkontribusi
pengenalan dan domain katalitik pada tiap
bagian dan menjembatani domain di bagian
bawah. Monomer mengurangi aktivitasnya
sendiri. Struktur kristal pada enzim tipe II
termasuk subkelas yang berbeda tampaknya
memiliki inti umum terdiri lima -sheet
yang diapit di setiap sisi oleh -helix, mirip
dengan enzim MutH dan -exonuclease (3133). Ini menunjukkan bahwa enzim tipe II
juga bisa dikategorikan berdasarkan
penambahan struktur homologi antara
produksi penggantung 5, yang mendekati
DNA dari alur utama, dan menghasilkan
penggantung 3 atau ujung tumpul, yang
mendekati DNA dari alur kecil. Untuk
diketahuinya struktur kristal, endonuklease
tipe II menghasilkan penggantung 5 tampak
untuk
menggunakan
-heliks
untuk
membedakan bagian khususnya dan
sementara telah ditandai untuk pengenalan
-helix. Sebagai contoh, BamHI mengenali
GGATCC sementara BglII mengenali
keterkaitan yang erat pada bagian AGATCT.
Keduanya menghasilkan sama 5', empat
dasar penggantung GATC. Namun, kontak
dasar proteinuria untuk empat basa internal
umum dan distorsi DNA dalam kompleks
spesifik secara signifikan berbeda untuk dua
enzim (34). Sebaliknya, 3' dan blunt end
memproduksi enzim tampaknya bergantung
pada -strand dan sementara ditandai
sebagai pengenalan -strand. Ada perbedaan
pada polaritas -sheets antara kedua
kelompok (35).
3.3. Endonuklease Tipe IIe

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 10

Endonuklease tipe IIe yang mirip

dengan tipe II umum atau tipe IIs dalam
struktunya,
pengenalan
pola,
dan
mekanisme. Namun, mereka dibedakan
dalam yang aktif untuk membelah lambat
atau bagian yang resisten oleh pengikatan
urutan pengenalan kedua kearah distal,
bagian non katalitik pada enzim. Biasanya,
enzim membelah tidak sempurna pada
subset dari bagian pengenalan. Isokhizomer
endonuclease tipe IIe membelah secara
lengkap. Untuk EcoRII dan pBR322 (enam
pengenalan bagian tiap molekul DNA) rasio
enzim untuk mengenali bagian dalam
campuran reaksi untuk aktivitas yang
optimal yaitu 0,25-0,5 atau dua sampai
empat pengenalan bagian tiap dimer enzim.
Hal ini menunjukkan masing-masing dimer
enzim mengikat urutan pengenalan di bagian
katalitik dan kedua di bagian alosterik (36).
Berdasarkan observasi pembelahan pada
bagian khusus, klasifikasi asli aktivitas
endonuclease tipe IIe dalam 1 jam secara
singkat adalah sebagai berikut : bagian
cleavable, >90% pembelahan dengan 1
sampai 5 kali lipat lebih enzim; bagian
lambat, 5-90% pembelahan dengan 5 kali
lipat lebih enzim dan tambahan pembelahan
dengan 10 sampai 30 kali lipat lebih ; bagian
resisten, <5% pembelahan dengan lima kali
lipat lebih enzim dan tidak ada tambahan
pembelahan lebih dari 10-30 kali lipat.
Enzim IIe dapat membelah satu bagian DNA
secara perlahan sedangkan bagian lain yang
sama atau molekul DNA yang berbeda
resisten terhadap pembelahan (18).
Enzim tipe IIe dapat dipisahkan
menjadi dua kelas dengan cara yang lebih
deskriptif berdasarkan pada perubahan
kinetika pembelahan setelah mengikat dari

urutan afektor, yang mungkin merupakan

oligonukleotida, linear phage, atau DNA
super koil. Dienzim kelas K (NarI, HpaII,
SacII),
activator
peningkatan
DNA
menurunkan
Km
tanpa
mengubah
pembelahan Vmax,
menunjukkan bahwa
pengikatan
kooperatif
menginduksi
konformasi pergeseran yang meningkatkan
afinitas enzim untuk substrat. Di kelas V
(NaeI, BspMI), mengikat aktivator DNA
meningkatkan Vmax tanpa mengubah Km,
menunjukkan bahwa peningkatan aktivitas
katalitik tidak berhubungan dengan afinitas
enzim untuk substrat (18). Hal ini
diasumsikan bahwa kinetika pembelahan
bagian pengenalan yang berbeda adalah
dipengaruhi oleh pengapitan urutan untuk
enzim tipe IIe. Preferensi pengapitan urutan
saat ini tidak dipahami. Namun, urutan
termasuk bagian yang mudah dibelah dan
yang mengapit daerah adalah titik awal
untuk menentukan activator urutan yang
baik.
Pencernaan tidak lengkap oleh enzim
tipe IIe yang sering terjadi dapat membuat
interpretasi ikatan pola dan aplikasi
berikutnya yang sulit.
Menambahkan
activator dapat meningkatkan pembelahan.
Misalnya, oligos mengandung bagian
pengenalan untuk EcoRII yang uncleavable
karena metilasi spesifik atau adanya analog
nukleotida, dapat mengikat bagian alosterik
dan merangsang pembelahan bagian yang
sulit di pBR322 (37).
Pendekatan yang hampir sama, yang
dikembangkan oleh Topal dan rekan kerja,
menggunakan sebuah oligonukleotida yang
berisi bagian pengenalan yang untuk NaeI
dengan fosforotioat pada obligasi scissile

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 11

(38). Pembelahan substrat lengkap dicapai

tanpa mengkonsumsi aktivator oligo
nukleotida ketika belerang mencegah
hidrolisis oleh NaeI. Strategi yang sama juga
telah digunakan dengan berhasil untuk NarI,
menunjukkan utilitas dari pendekatan ini
untuk kedua enzim kelas V dan K. Beberapa
enzim ini tersedia secara komersial dengan
mengaktifkan oligo yang tercampur dalam
buffer reaksi yang disediakan (misalnya,
Promega Turbo NaeI dan Turbo Nari).
Kehadiran oligo tidak tercampur dengan
ligasi atau pelabelan primer acak dan
pemurnian satu langkah menghasilkan
sebuah pembelahan DNA yang cocok untuk
akhir
pelabelan
(39).
NaeI mengandung sedikit varian, TD ...
DCK, motif endonuklease di wilayah Nterminal
dan
motif 10 asam amino, 39TLDQLYDGQR48
di wilayah N-terminal yang mirip dengan
motif di DNA ligase I pada manusia (35).
Leusin pada posisi 43 di NaeI adalah lisin
dalam motif ligase yang terlibat dalam
adenilasi menengah dan sangat penting
untuk
ligasi.
Sebuah
mutan
dari
endonuklease, NaeI L43K, menunjikkan
aktivitas topoisomerase tipe I (pembelahan,
untai bagian, dan pengumpulan). Hal ini
menunjukkan sebuah awal yang mungkin
untuk situs pengikatan DNA penggerak di
wilayah C-terminal dan hubungan potensial
antara endonuklease ini dan topoisomerase
dan rekombinasi (40,41). Selain itu,
berdasarkan analisis mutasi, telah diusulkan
bahwa residu 182-192 terlibat dalam
komunikasi antara endonuklease dan
topoisomerase (NaeI L43K) atau domain
DNA
penggerak
(NaeI)
(42).
3.4. Tipe IIs endonuklease

Endonuklease tipe IIs monomer, 45110 kD, hanya membutuhkan Mg2,

mengenali urutan mic non-palindro, dan
membelah setidaknya satu dari dua rantai
diluar situs pengenalan. Sebagian besar
informasi
struktural
tersedia
untuk
endonuklease ini didasarkan pada struktur
kristal dari satu anggota, FokI, terikat pada
DNA. Bagian amino terminal berisi domain
pengenalan DNA dan bagian terminal
karboksi berisi domain belahan. Dengan
tidak adanya Mg2, struktur kristal FokI
terikat ke 20 bp fragmen yang mengandung
situs pengenalan menunjukkan dua anomali
yang jelas. Pertama, domain pembelahan
tidak
berhubungan
dengan
tempat
pembelahan. Pengamatan ini juga telah
dibuktikan oleh penelitian footprinting.
Domain pembelahan diposisikan jauh dari
DNA, sementara enzim mencari situs
pengenalannya. Ketika terikat ke situsnya,
dan dengan hadirnya Mg2,
domain
pembelahan FokI bergeser ke posisi aktif
melalui
serangkaian
perubahan
intramolekuler (43). Namun, hanya ada satu
domain pembelahan per monomer. Dalam
rangka untuk membelah kedua untai,
langkah berikutnya melibatkan dimerisasi
sementara dari domain katalitik dari
monomer kedua di tempat pembelahan.
Kesamaan struktural dengan domain
katalitik dan menjembatani domain dari
enzim homodimerik Tipe II BamHI lebih
jauh menyokong model ini meskipun antar
permukaan dimer lebih kecil untuk FokI,
mendukung
keberadaannya
sebagai
monomer dalam larutan bebas (44). Juga
telah ditemukan bahwa molekul FokI kedua
juga harus terikat untuk mengenali DNA
untuk pembelahan substrat awal. Pada saat
ini tidak diketahui apakah duplex DNA

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 12

kedua adalah sejajar dengan yang pertama,

yang akan memungkinkan interaksi proteinprotein dan stabilisasi atau antiparalel, yang
menempatkan molekul protein dalam
orientasi yang lebih simetris (45).
Pengambilan domain pembelahan non
spesifik dan memerlukan beberapa kondisi
tertentu yang harus dipenuhi sebelum
aktivasi katalitik yang mungkin penting
untuk menjaga tingkat ketetapan yang
serupa dengan enzim tipe II lain.
3.5. Tipe Endonuklease IIf, IIg, dan IIt
Endonuklease tipe IIF mirip dengan Tipe II
ortodoks dalam banyak hal. Dua perbedaan
adalah bahwa mereka ada sebagai
homotetramers, dua dimer khas dalam
orientasi bolak-balik, dan yang mengenali
DNA harus terikat pada kedua celah
katalitik agar pembelahan terjadi. Contoh
dari sub-class ini adalah SfiI (46), AatII
(47), Cfr10I (48) dan NgoMIV (49). Karena
mereka membutuhkan dua salinan dari situs
pengenalan untuk pembelahan, enzim tipe
IIF mirip dengan enzim tipe IIe dalam
hidrolisis pada beberapa situs terakhir dalam
suatu reaksi dapat menjadi masalah bahkan
ketika enzim lebih relatif terhadap substrat.
Untuk SfiI, telah ditunjukkan bahwa
homotetramer harus berinteraksi dengan dua
situs pengenalan utuh yang mengandung
ikatan fosfodiester yang bisa terbelah
sebagai lawan satu segmen DNA yang berisi
kelompok yang fosforotioat yang tak
terhidrolisis seperti dalam urutan aktivator
menjelaskan untuk enzim tipe IIe (50).
Karena konsentrasi tinggi efektif, memiliki
dua lokasi di cis daripada trans lebih disukai
dan kedua situs dibelah dalam pergantian

tunggal (51,52). Pengamatan tambahan

mengenai palindrom terganggu diketahui
oleh Sfi I adalah perbedaan 70 kali lipat laju
reaksi berdasarkan urutan yang lebih lapang,
yang berisi fosfat scissile. Telah diusulkan
bahwa sejumlah kekakuan DNA awal yang
terpapar oleh hasil urutan yang lebih lapang
pada ketegangan kekuatan tambahan setelah
pencampuran yg diinduksi enzim, yang
berkontribusi
untuk
katalisis
(53).
Endonuklease
tipe
IIG
sebelumnya
diklasifikasikan sebagai Tipe IV (15,25,26),
tetapi baru-baru ini digunakan kembali
berdasarkan satu-satunya syarat mutlak
untuk pembelahan menjadi Mg2, meskipun
AdoMet
bersifat stimulus (16). Sifat
enzimatik tambahan juga terbagi dengan
endonuklease tipe II lain. Pembelahan di
luar situs pengenalan nonpalindromic
meniru enzim tipe IIs. Reaksinya mungkin
tidak berlanjut sampai selesai mirip dengan
tipe IIe dan IIF. Sebagai tambahan untuk
kontribusi dari AdoMet, Tipe IIG dibedakan
oleh anggota pembentuknya, Eco57I, yang
ada sebagai monomer yang mengandung
pengenalan, pembelahan, dan kegiatan
methylase. Sebuah gen mengekspresi
methylase terpisah juga ada (25).
Sebuah subclass yang relatif baru yang
berisi enzim Bpu10I dan BslI telah dinamai
tipe IIt (16). Meskipun keduanya telah
mengganggu
situs
pengenalan
dan
membelah di wilayah non spesifik, situs
Bpu10I non-palindromic dan situs BslI
adalah palindromic. Ciri utama dari
pembatasan Tipe IIt adalah persyaratan
untuk kedua polipeptida dan . Hubungan
antara subunit untuk Bpu10I tampaknya
lemah karena mereka terpisah dengan
mudah selama pemurnian dan memerlukan

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 13

pemulihan (54). Dalam studi dengan BslI,

pergeseran mobilitas DNA hanya terjadi
dengan pencampuran subunit dan kloning
dari gen dan dapat dinyatakan secara
tunggal dalam ketiadaan methylase tanpa
membunuh host. Telah diusulkan bahwa
bentuk aktifnya adalah 22 heterotetramer
meskipun heterodimers dan oligomer juga
ada
dalam
larutan
(55).
3.6 Endonuklease tipe IV
Endonuklease
tipe
IV
sebelumnya
diklasifikasikan sebagai Tipe IIb (15,16,26).
Hal ini baru diusulkan dalam artikel ini
untuk memindahkan mereka ke dalam
klasifikasi yang baru dikosongkan dari Tipe
IV karena mereka memerlukan AdoMet
serta Mg2 untuk kegiatan pembatasan.
Namun, karakteristik yang paling unik dari
kelompok ini adalah pembelahan dari empat
untai DNA, dua untai yang terpisah dari
kedua sisi dari situs pengenalannya, yang
mengakibatkan
eksisi
dari
situs.
Pengumpulan subunit dan hubungan antara
pembatasan dan metilasi tak cocok juga.
Satu-satunya model holoenzyme diusulkan
sejauh ini adalah untuk BcgI dan ini belum
didasarkan pada data kristallografik. Dalam
larutan, berat molekul ditentukan oleh
filtrasi gel yang menunjukkan hetero
heksamer yang terdiri dari dua unit kerja
yang identik, yang masing-masing mampu
mengikat situs pengenalan yang terpisah
(20). Unit kerja model ini, berasal dari motif
urutan, analisis mutasi dan pemotongan, dan
subunit stoikiometri, adalah heterotrimer
yang terdiri dari satu polipeptida khusus
ditambah dua polipeptida yang identik yang
berisi pembatasan dan domain metilasi.

Subunit pembatasan metilasi terikat satu di

setiap
sisi
dari
subunit
spesifik,
memposisikan mereka berdua di hulu dan
hilir dari situs pengenalan. Pembelahan untai
ganda oleh kedua subunit pembatasan
metilasi dari setiap heterotrimer sehingga
memotong situs pengenalannya. Substrat
yang mengandung satu situs dibelah di
tingkat yang lebih rendah dibandingkan
dengan dua lainnya, menunjukkan bahwa
kedua
domain
pengenalan
dari
heterohexamer yang lengkap harus diduduki
(56). Sebuah situs pengenalan yang
hemimetilasi, seperti setelah bereplikasi
baru-baru ini, secara istimewa termetilasi
pada untai lain. Sebaliknya, sebuah situs
pengenalan yang tidak termetilasi pada
kedua untai, seperti DNA asing, yang
dibelah
(57).
3.7. Endonuklease homing
Endonuklease homing, kadang-kadang
disebut sebagai intron dan intein (protein
intron) dikodekan endonuklease, yang
berbeda dari restriksi enzim standard di
beberapa aspek.
kemungkinan monomer atau dimer dan
mungkin memerlukan protein atau RNA
untuk aktivitas. Mereka mentolerir beberapa
substitusi dasar dalam urutan pengakuan
yang besar, terutama daerah di luar, dengan
hanya perubahan kecil dalam tingkat
pembelahan.
Mereka
juga
dapat
mempertahankan aktivitas yang signifikan
dan relatif kesetiaan setelah mengganti
logam divalen lainnya untuk Mg2. Untuk
satu anggota, I-PpoI, studi menunjukkan
kristal residu histidin bertanggung jawab

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 14

atas lebih tepat spasial aktivasi air

nukleofilik menyerang dan ion logam hanya
terlibat dalam stabilisasi kurang membatasi
dari keadaan transisi, yang dapat
menjelaskan hal ini toleransi logam (58).
Mereka telah ditemukan di archaea dan
bakteri dan, tidak seperti endonuklease khas,
bahkan terjadi pada eukariota. Lokasi genom
mereka dapat mitokondria, kloroplas,
kromosom, atau ekstrakromosomal. Mereka
dapat dibagi menjadi empat kelompok
berdasarkan motif urutan. Sampai saat ini,
58 telah diidentifikasi dan ditandai untuk
berbagai tingkat(22).
4. Spesifitas , Fusi Protein, dan Aplikasi
Khusus
Meskipun endonuklease mengikat DNA
nonspesifik, mereka menunjukkan preferensi
yang sangat tinggi katalis untuk situs
pengakuan mereka atas situs bahkan dengan
sepasang perbedaan satu basa. Sebuah
relaksasi sebagian kekhususan dalam
kondisi digest suboptimal adalah properti
yang melekat beberapa enzim yang sering
disebut
sebagai
"aktivitas
bintang."
Tergantung pada enzim, aktivitas bintang
paling dipengaruhi oleh excluders volume
(gliserol, ethyleneglycol) atau penggantian
Mg2 dengan logam lain dan, pada tingkat
lebih rendah, oleh pH (15). Jumlah molekul
air biasanya hadir pada antarmuka DNA
proteinuria untuk EcoRI di situs noncognate
berkurang pada tekanan osmotik tinggi
karena volume yang eksklusi dan ketat
mengikat hasil enzim dalam konformasi
aktif yang lebih mudah dicapai di lokasi star
(59) . Sebagai contoh, EcoRI memotong
situs pengakuan (5'-GAATTC-3 ') pada

tingkat 105 kali lebih cepat dari urutan

terbaik berikutnya (5'-TAATTC-3') dalam
kondisi optimal (60). Kompleks dengan ini
urutan terbaik berikutnya dan gen- eral
urutan non-spesifik keduanya mengandung
sekitar 110 molekul air lebih dari kompleks
spesifik pada tekanan osmotik rendah (61).
Dengan meningkatnya konsentrasi glikol
etilena, tingkat pembelahan berkurang di
situs serumpun tetapi meningkat pada situs
terbaik berikutnya sampai tingkat mendekati
kesetaraan di 4 M etilena glikol (59). Pada
pH tinggi, tinggi [OH] dapat mengurangi
kebutuhan air diaktifkan terbentuk pada
situs katalitik sebagai phile menyerang
nucleoprotein (15). Bergantian, pH dan
kekuatan ion dapat mengubah disosiasi
protein
nonspesifik
terikat
daripada
mempengaruhi spesifik / ekuilibrium nonspesifik atau terlibat langsung dalam
katalisis (61). Semua endonuklease restriksi
pra- fer Mg2 untuk kegiatan. Beberapa dapat
menggunakan logam divalen yang berbeda,
biasanya Mn2, tapi kadang-kadang Ca2 Fe2,
Co2, Ni2, dan Zn2. Namun, domen belahan
dengan ion ini biasanya kurang specificand
lambat (19). Mn2 terikat H2O mungkin
lebih baik Mg2 terikat H2O untuk
memberikan proton yang diperlukan untuk
kelompok meninggalkan 3 'OH. ForEcoRV,
aktivitas di situs serumpun adalah 106 time
shigher daripada di lokasi bintang dengan
Mg2, tapi onlysix-kali lipat lebih tinggi
dengan Mn2 (62). Jenis saltions, melacak
pelarut organik, dan enzim yang tinggi to
DNA rasio juga dapat mengakibatkan
aktivitas bintang. Read the informasi yang
dikirim dengan preparasi-tions komersial
untuk menghindari aktivitas bintang bagi
mereka enzim itu adalah rentan.

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 15

2 Pembelahan Stran Tunggal

Pembatasan Enzim dan Nickases

oleh

Semua endonuklease restriksi memotong

DNA beruntai ganda, tetapi beberapa enzim
menghidrolisis ssDNA dengan harga
berkurang secara signifikan. Dua teori yang
ada mengenai mekanisme jelas ssDNA
domen belahan. Meskipun pembelahan
ssDNA sebenarnya telah dilaporkan (63),
dalam kasus lain enzim benar-benar dapat
bertindak atas transien membentuk DNA
beruntai ganda (64). Salah satu metode
untuk membelah ssDNA menggunakan
adaptor oligonukleotida dan enzim aType IIs
mana situs pengakuan dan tempat
pembelahan secara signifikan dipisahkan
asFokI
tersebut.
Oligonukleotida
mengandung sebuah hairpin loop, wilayah
untai ganda dengan pengakuan siteof enzim,
dan ekor beruntai tunggal memperluas
melewati situs pengakuan. Wilayah ini untai
tunggal dari oligonukleotida menonjol
melewati situs pengenalan melengkapi
substrat ssDNA. Endonuklease ini kemudian
mampu mengenali situs serumpun pada
wilayah untai ganda dari oligonukleotida
dan membelah di wilayah yang dibentuk
oleh oligo yang: ssDNA hybrid seperti yang
diilustrasikan pada Gambar. 1A. Setelah
pembelahan, fragmen oligonukleotida terikat
pada ssDNA dapat panas didenaturasi.
Metode ini tidak dapat digunakan untuk
membelah ssRNA, namun (19). Pendekatan
serupa
untuk
memotong
ssDNA
menggunakan enzim XcmI, yang mengakui
terpanjang (9 nt) urut degeneratif dikenal
(5'-CCANNNNN / NNNNTGG-3 '). Sebuah
oligo dirancang dengan dua hairpin loop dan
berdekatan di dalam daerah dsDNA
mengandung nukleotida pengakuan tetapi
meninggalkan pusat, nukleotida spesifik
untai tunggal. Sebuah ssDNA pelengkap
yang hybridizes untuk nukleotida nonspesifik akan dibelah seperti yang
digambarkan pada Gambar. 1B (65).

Gambar.
1.
Gunakan
adapter
oligonukleotida untuk cleavingss DNA
dengan endonuklease FokI (A) dan XcmI
(B) an ssDNA muncul dalam huruf tebal,
situs pengakuan endonuklease yang
terkandung dalam oligonukleotida disorot,
dan posisi pembelahan ditunjukkan panah.
kelompok kecil yang terjadi secara alami
nickases
sekarang
diketahui
bahwa
pembatasan meniru enzim dalam mengenali
situs DNA untai ganda tapi membelah hanya
satu spesifik fosfat diester obligasi. Dua
nickases ditandai terbaik, N.BstSE (66) dan
N.BstNBI (67), adalah isoschizomers
mengakui urutan nonpalindromic GAGTC
dan cleav- ing untai empat basis dari ujung 3
'dari situs pengakuan. N.BstNBI telah
dikloning dan menunjukkan tingkat tinggi
kesamaan urutan dengan Type IIs enzim Plei
dan MlyI, yang juga justru menemukan
perubahan tadi GAGTC. Selain itu, Plei
memotong untai teratas di posisi yang sama
seperti N.BstNBI. Berdasarkan gel filtrasi
dengan DNA terikat, pembelahan DNA, dan
analisis mutasi, struktur dan mekanisme
mirip dengan FokI tanpa perlu dimerisasi di
tempat pembelahan telah diusulkan untuk
N.BstNBI (68).

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 16

4.3. Perubahan Khusus Melalui Rekayasa

Protein
Meskipun urutan lengkap dan data struktur
3D yang tersedia, mutagenesis situsdiarahkan dari enzim restriksi untuk
mengubah urutan DNA mereka mengakui
secara
umum
hanya
menyebabkan
kekhususan santai dan / atau penurunan
tingkat domen belahan. Mutasi sederhana
yang mudah mengubah situs pengakuan
untuk pembatasan akan mematikan ke host
tanpa perubahan sama dalam kegiatan
methylase; Oleh karena itu, endonuklease
telah berkembang menjadi sangat spesifik
dan
berlebihan
dalam
pengakuan.
Mutasi untuk menerima dasar dimodifikasi
atau meningkatkan spesifisitas situs sejauh
ini terbukti lebih mudah. Mutan EcoRV
telah dibangun bahwa situs pengakuan
membelah dengan urasil bukan timin oleh
lebih dari dua kali lipat lebih wild type
(N188Q)
(69)
atau
dengan
methylphosphonate di salah satu posisi
tulang punggung fosfat dengan tiga lipat
lebih Jenis Wild- (T94V) (70). Selain itu,
EcoRV A181K dan mutan A181E istimewa
membelah situs dengan purin atau timin,
masing-masing, 5 'ke situs pengakuan (71).
Pendekatan
evolusi
diarahkan
telah
menghasilkan N97T / S183A / T222S mutan
dengan preferensi 20 kali lipat untuk
oligonukleotida dengan mengapit wilayah
kaya GC dan mutan K104N / A181T dengan
preferensi tujuh kali lipat untuk di- wilayah
mengapit kaya (72 ). Heterodimers dari
EcoRV berisi katalis aktif mutan subunit
bertindak sebagai spesifik lokasi nickase
(73). Untuk memfasilitasi rekayasa enzim
tambahan, informasi yang lebih struktural

diperlukan mengenai jumlah besar kontak

enzim-DNA dan intra / pergeseran protein
antarmolekul.

* Berdasarkan 660 Dalton per bp DNA.

** Enzim memiliki kemampuan berbeda
dalam memotong superkoil vs substrat
linear.
DNA

Base
pairs

Picomol Cut
es dalam site
1 g*
s

Cut
sites
pico
mole
s

Unit
enzy
me
yang
dibut
uhka
n

Unit
48,5
definis 02
i (cnth
:lambd
a)

0.0312

0.15
6

Plasmi
d

0.5

0.5

34**

3,00
0

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 17

Fragm
en
PCR

700

Oligon 25
ucleoti
da

2.16

2.16

1215

60.6

60.6

400380

Sebuah pencernaan yang berlebih atau

pengujian nonspesifik exo dan endonuclease
yang dilakukan dengan kebiasaan yang sama
seperti aktivitas penelitian, kecuali sebuah
unit enzyme yang besar dan berlebihan yang
digunakan (5-100 U) dan waktu inkubasi
yang panjang (biasanya 16 jam). Seringkali
hasilnya dilaporkan sebagai (X) lipatoverdigestion (unit x jam') meskipun fakta
bahwa aktivitas enzim biasanya berkurang
secara signifikan selama jangka waktu ini
pada suhu reaksi. Meskipun aktivitas star
adalah properti yang melekat dari enzim itu
sendiri dan tidak terpisah, kontaminan yang
jelas, itu akan mengakibatkan pembelahan di
lokasi noncognate, yang akan mengganggu
aplikasi hilir, dan karena itu harus
dipertimbangkan dalam menentukan titik
akhir dari pengujian ini. Beberapa pemasok
hanya
mempertimbangkan
adanya
kontaminan diskrit dalam spesifikasi
mereka, yang bisa saja menyesatkan.
Uji potong-ligasi-pemotongan kembali lebih
sensitif berkaitan dengan mencemari
exonuclease dan kemudian dapat mendeteksi
aktivitas
fosfatase.
DNA
sedikit
overdigested, diikat dengan T4 DNA ligase,
dan kemudian mengalami pemotongan
kembali. Ujung terdeposforilase tidak akan
diikat dan ujung yang telah tumpul oleh
aktivitas exonuclease untai tunggal akan

menunjukkan ligasi yang kurang efisien.

Kehilangan salah satu nukleotida awal
terminal setelah pembelahan akan hampir
selalu juga mengakibatkan hilangnya sisi
penempelan untuk pemotongan ulang
bahkan jika substrat kembali berikatan.
Meskipun ligasi satu basis masih cukup
efisien untuk menjadi cloning dalam T-vector dari PCR fragmen, untuk alasan yang
tidak diketahui untuk efisiensi ligasi, seperti
yang
diindikasikan
oleh
efisiensi
transformasi dari plasmid, dapat digunakan
sebanyak dua perintah yang besarnya lebih
rendah daripada yang diamati untuk akhir
ligasi. Sebaliknya, empat basis G-C cukup
stabil untuk mengubah bahkan tanpa ligasi
in vitro.
Beberapa vendor juga menguji keberadaan
nickase dengan menginkubasi enzim dan
super coiled substrat (bentuk RF I) yang
tidak mengandung situs recognisi untuk
menentukan jumlah substrat yang diubah
menjadi lingkaran yang terelaksasi (bentuk
RF II). Namun, dampak dari aktivitas
nicking pada aplikasi utama dari kloning dan
pemetaan adalah minimal. Salah satu
aplikasi yang akan terpengaruh oleh
aktivitas
nicking
adalah
generasi
penghilangan dengan exonuclease III.
Namun, DNA yang tidak dimurnikan secara
benar menjadi sumber nick yang lebih
berpengaruh daripada aktivitas kontaminan
yang ada dalam endonuclease. Metode
pemurnian saat ini dan sensitivitas dari tes
lain sangat jarang, walaupun ada tudak bisa
menjamin tes nikase.
Tes lain yang digunakan untuk mendeteksi
exonuclease adalah pencernaan 3H-ds dan
-ssDNA, TCA pra cipitate DNA yang

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 18

tersisa, dan mendeteksi nukleotida dengan

perhitungan sintilasi dari supernatan.
Sadarilah bahwa jika memotong enzim
substrat dalam waktu 30 bp dari ujung DNA,
presipitasi yang tidak efisien dari fragmen
kecil yang dihasilkan dapat menyebabkan
interpretasi yang salah yang menunjukkan
aktivitas exonuclease. Pelabelan 5 'atau 3'
dari ujung DNA dengan 32P adalah salah
satu cara sensitif untuk mendeteksi fosfatase
yang terkontaminasi atau exonuclease.
Namun, metode ini membutuhkan persiapan
substrat yang sering.
Blue / white assay menggabungkan
sensitivitas yang sangat baik dan verifikasi
kinerja. Sebuah kloning plasmid digunakan
yang berisi beberapa situs kloning yang
diapit oleh promotor RNA polimerase (s)
dalam urutan coding untuk gen lacZ apeptida dan kemudian penanda dipilih
terpisah seperti resistensi ampisilin. Plasmid
ini beberapa kali lipat dicerna berlebihan
dengan enzim yang memiliki situs tunggal
dalam beberapa wilayah kloning. DNA yang
diikat (tanpa insert) dan kemudian dirubah
menjadi sel yang kekurangan regio a-peptida
pada dari lacZ. Gel agarosa potong, diikat,
dan DNA yang dipotong kembali juga
diperiksa. Jika integritas potongan akhir
yang dipertahankan sempurna, ligasi akan
menghasilkan berat molekul concatamers
yang lebih tinggi dan jumlah yang lebih
rendah dari monomer diedarkan. Setelah
transformasi dan ekspresi peptida, produk
fungsional gen lacZ b-galaktosidase
dihasilkan melalui-komplementasi. Ketika
dihadapkan adanya kehadiran IPTG dan XGal, koloni biru akan dihasilkan. Efisiensi
transformasi yang diharapkan akan menjadi
1-2 kali lipat lebih rendah dari kontrol

supercoiled plasmid. Baik fosfatase dan

exonuclease yang mengalami kontaminasi
akan menurunkan efisiensi ligasi dan dengan
demikian
menurunkan
efisiensi
transformasi. Lebih penting lagi, kehilangan
nukleotida di lokasi pemotongan, bahkan
jika dapat diligasi, menghasilkan populasi
yang tercampur dari klon yang mengandung
pergeseran frame dan penghapusan kodon
pada gen lacZ a-peptida. Ini menyebabkan
koloni putih, yaitu positif palsu dari
eksperimen kloning dengan insert (91).
Sebuah kasus khusus adalah kontaminan
yang belum teridentifikasi yang ditemukan
dalam preparat asli dan kloning dari
endonuklease yang menghilangkan 3
nukleotida tunggal dari ujung DNA. Hasil
dari koloni yang kemudian dapat
menggunakan alternatif start kodon yang
bergeser menjadi di dalam frame. Namun,
menghasilkan inisiasi transalasi lemah dan /
atau komplementasi tidak tepat untuk
mengaktifkan secara penuh b galactosidase
dan koloni mengembangkan warna biru
yang samar, yang dengan mudah keliru
dengan putih. Hal ini terutama bermasalah
dengan ujung tumpul dari pemotongan
enzim. Tidak semua vendor komersial
membuat spesifikasi uji Cally dan
menghapus kontaminan ini (92).
Ucapan Penghargaan
Penulis mengucapkan terima kasih
kepada Michael Slater, Mark Klckamp, Terri
Sundquist, dan Isobel Maciver untuk
usahanya untuk mereview artikel ini dan
saran-saran yang sangat bermanfaat.

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Referensi

Page 19

1. Roberts, R. J. and Halford, S. E. (1993),

Type II Restriction Endonucleases, in
Nucleases, 2nd Edition (Linn S. M., Lloyd,
S. R., and Roberts, R. J. eds.), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, pp. 3588.
2. Stein, D.C., Gunn, J.S., Radlinska, M.,
and Piekarowicz, A. (1995) Restriction and
modification
systems
of
Neisseria
gonorrhoeae. Gene 157, 1922.
3. Lin, L-F. Posfai, J., Roberts, R. J., and
Kong, H. (2001) Comparative genomics of
the restriction-modification systems in
Helicobacter pylori. Nuc. Acids Res. 98,
27402745.
4. Rocha, E. P. C., Danchin, A., and Viari, A.
(2001)
Evolutionary
Role
of
Restriction/Modification
Systems
as
Revealed by Comparative Genome Analysis.
Genome Res. 11, 946958.
5. Nobusato, A., Uchiyama, I., and
Kobayashi, I. (2000) Diversity of restrictionmodification
gene
homologues
in
Helicobacter pylori Gene 259, 8998.
6. Smith, H. O. and Nathans, D. (1973) A
suggested nomenclature for bacterial host
modification and restriction systems and
their enzymes. J. Mol. Biol. 81, 419423.
7. Wilson, G. G. and Murray, N. E. (1991)
Restriction and Modification Systems.
Annu. Rev. Genet. 25, 585627.
8. Stahl, F., Wende, W., Jeltsch, A., and
Pingoud, A. (1998) The Mechanism of DNA
Cleavage by the Type II Restriction Enzyme
EcoRV: Asp36 Is Not Directly Involved in
DNA Cleavage but Serves to Couple
Indirect Readout to Catalysis. Biol. Chem.
379, 467473.
9. Smith, H. O., Annau, T. M., and
Chandrasegaran, S. (1990) Finding sequence
motifs in groups of functionally related
proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
826830.
10. Szomolanyi, E., Kiss, A., and Venetianer,
P. (1980) Cloning the modification

methylase gene of Bacillus sphaericus R in

Escherichia coli. Gene 10, 219225.
11. Tao, T., Bourne, J. C., and Blumenthal,
R. M. (1991) A Family of Regulatory Genes
Associated with Type II RestrictionModification Systems. J. Bact. 173, 1367
1375.
12. Ives, C. L., Sohail, A., and Brooks, J. E.
(1995) The Regulatory C Proteins from
Different Restriction-Modification Systems
Can Cross-Complement. J. Bact. 177, 6313
6315.
13. Bickle, T. A. (1993) The ATP-dependent
Restriction Enzymes, in Nucleases, 2nd ed.
(Linn S. M., Lloyd, S. R., and Roberts, R. J.
eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, pp. 3588.
14. Murray, N. E. (2000) Type I restriction
systems: sophisticated molecular machines.
Microbiol. Mol. Biol. Revs. 64, 412434.
15. Pingoud, A. and Jeltsch, A. (1997)
Recognition and cleavage of DNA by type-II
restriction endonucleases. Eur. J. Biochem.
246, 122.
16. Pingoud, A., Jeltsch, A. (2001) Structure
and function of type II restriction
endonucleases. Nuc. Acids Res. 29, 3705
3727.
17. Reuter, M., Kupper, D., Pein, C. D.,
Petrusyte, M., Siksnys, V., Frey, B., and
Kruger, D. H. (1993) Use of Specific
Oligonucleotide Duplexes to Stimulate
Cleavage of Refractory DNA Sites by
Restriction Endonucleases. Anal. Biochem.
209, 232237.
18. Oller, A. R., Broek, W. V., Conrad, M.,
and Topal, M. (1991) Ability of DNA and
Spermidine To Affect the Activity of
Restriction Endonucleases from Several
Bacterial Species. Biochemistry 30, 2543
2549.
19. Szybalski, W., Kim, S. C., Hasan, N.,
and Podhajska, A. J. (1991) Class-IIS
restriction enzymes - a review. Gene 100,
1326.

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 20

20. Kong, H. (1998) Analyzing the

Functional Organization of a Novel
Restriction Modification System, the BcgI
System. J. Mol. Biol. 279, 823832.
21. Sears, L. E., Zhou, B., Aliotta, J. M.,
Morgan, R. D., and Kong, H. (1996) BaeI,
another unusual BcgI-like restriction
endonuclease. Nucleic Acids Res. 24, 3590
3592.
22. Belfort, M. and Roberts, R. J. (1997)
Homing endonucleases: keeping the house
in order. Nuc. Acids Res. 25, 33793388.
23. Meisel, A., Mackeldanz, P., Bickle, T.
A., Kruger, D. H., and Schroeder, C. (1995)
Type
III
restriction
endonucleases
translocate DNA in a reaction driven by
recognition site-specific ATP hydrolysis.
EMBO J. 14, 29582966.
24. Kruger, D. H., Kupper, D., Meisel, A.,
Reuter, M., and Schroeder, C. (1995) The
significance of distance and orientation of
restriction endonuclease recognition sites in
viral DNA genomes. FEMS Microbiol. Rev.
17, 177184.
25. Janulaitis, A., Petrusyte, M., Maneliene,
Z., Klimasauskas, S., and Butkus, V. (1992)
Purification and properties of the Eco57I
restriction endonuclease and methylase
prototypes of a new class (type IV). Nucl.
Acids Res. 20, 60436049.
26. Williams, R. J. (2001), Restriction
Endonucleases and Their Uses, in The
Nucleases (Schein, C. H., ed.), Humana
Press, New York, NY, pp. 409429.
27. Mise, K. and Nakajima, K. (1985)
Purification
of
a
new
restriction
endonuclease, StyI, from Escherichia coli
carrying the hsd_ minplasmid. Gene 33,
357361.
28. Jeltsch, A., and Pingoud, A. (1998)
Kinetic Characterization of Linear Diffusion
of the Restriction Endonuclease EcoRV on
DNA. Biochemistry 37, 21602169.
29. Engler, L. E., Sapienza, P., Dorner, L. F.,
Kucera, R., Schildkraut, I., and Jen-

Jacobson, L. (2001) The Energetics of the

Interaction of BamHI Endonuclease with its
Recognition Site GGATCC. J. Mol. Biol.
307, 619636.
30. Horton, N. C. and Perona, J. J. (2000)
Crystallographic snapshots along a proteininduced DNA-bending pathway. Proc. Natl.
Acad. Sci. 97, 57295734.
31. Kovall, R. A. and Matthews, B. W.
(1998)
Structural,
functional,
and
evolutionary relationships between exonuclease and the type II restriction
endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. 95,
78937897.
32. Kovall, R. A. and Matthews, B. W.
(1999) Type II restriction endonucleases:
structural, functional and evolutionary
relationships. Curr. Opin. Chem. Biol. 3,
578583.
33. Kubareva, E. A., Thole, H., Karyagina,
A. S., Oretskaya, T. S., Pingoud, A., and
Pingoud, V. (2000) Identification of a basespecific contact between the restriction
endonuclease SsoII and its recognition
sequence by photocross-linking. Nucl. Acids
Res. 28, 10851091.
34. Lukacs, C. M., Kucera, R., Schildkraut,
I., and Aggarwal, A. K. (2000)
Understanding
the
immutability
of
restriction enzymes: crystal structure of
BglII and its DNA substrate at 1.5
resolution. Nature Struc. Biol. 7, 134140.
35. Huai, Q., Colandene, J. D., Chen, Y.,
Luo, F., Zhao, Y., Topal, M. D., and Ke, H.
(2000) Crystal structure of NaeI-an
evolutionary
bridge
between
DNA
endonuclease and topoisomerase. EMBO J.
19, 31103118.
36. Reuter, M., Kupper, D., Meisel, A.,
Schroeder, C., and Kruger, D. H. (1998)
Cooperative
Binding
Properties
of
Restriction Endonuclease EcoRII with DNA
Recognition Sites. J. Biol. Chem. 273,
82948300.
37. Pein, C. D., Reuter, M., Meisel, A., Cech
D., and Kruger, D. H. (1991) Activation of

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 21

restriction endonuclease EcoRII does not

depend on the cleavage of stimulator DNA.
Nuc. Acids Res. 19, 51395142.
38. Conrad, M., and Topal, M. (1992)
Modified DNA fragments activate NaeI
cleavage of refractory DNA sites. Nuc.
Acids Res. 20, 51275130.
39. Senesac, J. H. and Allen, J. R. (1995)
Oligonucleaotide Activation of the Type IIe
Restriction Enzyme NaeI for Digestion of
Refractory Sites. BioTechniques 19, 990
993.
40. Jo, K. and Topal, M. D. (1995) DNA
Topoisomerase and Recombinase Activities
in NaeI Restriciton Endonuclease. Science
267, 18171820.
41. Jo, K. and Topal, M. D. (1998) Stepwise DNA relaxation and decatenation by
NaeI-43K. Nucleic Acids Res. 26, 2380
2384.
42. Colandene, J. D. and Topal, M. D.
(2000) Evidence for Mutations That Break
Communication between the Endo and Topo
Domains
in
NaeI
Endonuclease/
Topoisomerase. Biochemistry 39, 13703
13707.
43. Wah, D. A., Hirsch, J. A., Dorner, L. F.,
Schildkraut, I., and Aggarwal, A. K. (1997)
Structure of the multimodular endonuclease
FokI bound to DNA. Nature 388, 97100.
44. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A.
K., and Schildkraut, I. (1998) FokI
dimerization is required for DNA cleavage.
Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 1057010575.
45. Scheuring, E. S., Santagata, S., and
Aggarwal, A. K. (2001) FokI Requires Two
Specific DNA Sites for Cleavage. J. Mol.
Biol. 309, 6978.
46. Wentzell, L. M., Nobbs, T. J. and
Halford, S. E. (1995) The SfiI restriction
endonuclease makes a 4-strand DNA break
at two copies of its recognition sequence. J.
Mol. Biol. 248, 581595.
47. Sato, H., Suzuki, T., and Yamada, Y.
(1990)
Purification
of
Restriction

Endonuclease from Acetobacter aceti IFO

3281 (AatII) and its Properties. Agric. Biol.
Chem. 54, 33193325.
48. Siksnys, V., Skirgaila, R., Sasnauskas,
G., Urbanke, C., Cherny, D., Grazulis, S.
(1999) The Cfr10I restriction enzyme is
functional as a tetramer. J. Mol. Biol. 291,
11051118.
49. Deibert, M., Grazulis, S., Sasnauskas,
G., Siksnys, V., and Huber, R. (2000)
Struture of the tetrameric restriction
endonuclease NgoMIV in complex with
cleaved DNA. Nature Struct. Biol. 7, 792
799.
50. Nobbs, T. J., Williams, S. A., Connolly,
B. A., and Halford, S. E. (1998)
Phosphorothioate Substrates for the SfiI
Restriction Endonuclease. Biol. Chem. 379,
599604.
51. Nobbs, T. J. and Halford, S. E. (1995)
DNA cleavage at two recognition sites by
the SfiI restriction endonuclease: salt
dependence of cis and trans interactions
between distand DNA sites. J. Mol. Biol.
252, 399411.
52. Embleton, M. L., Sidsnys, V., and
Halford, S. E. (2001) DNA Cleavage
Reactions by Type II Restriction Enzymes
that Require Two Copies of their
Recognition Sites. J. Mol. Biol. 311, 503
514.
53. Williams, S. A. and Halford, S. E. (2001)
SfiI endonuclease activity is strongly
influenced by the non-specific sequence in
the middle of its recognition site. Nucl.
Acids Res. 29, 14761483.
54. Stankevicius, K., Lubys, A., Timinskas,
A., Vaitkevicius, D., and Janulaitis, A.
(1998) Cloning and analysis of the four
genes
coding
for
Bpu10I
restrictionmodification enzymes. Nucl.
Acids Res. 26, 10841091.
55. Hsieh, P.-C., Xiao, J.-P., OLoane, D.,
and Xu, S.-Y. (2000) Cloning, Expression,
and Purification of a Thermostable

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 22

Nonhomodimeric Restriction Enzyme, BslI.

J. Bact. 182, 949955.
56. Kong, H. and Smith, C. L. (1998) Does
BcgI, a Unique Restriction Endonuclease,
Require Two Recognition Sites for
Cleavage? Biol. Chem. 379, 605609.
57. Kong, H. and Smith, C. L. (1997)
Substrate DNA and cofactor regulate the
activities of a multi-functional restrictionmodification enzyme, Bcg I. Nucl. Acids
Res. 25, 36873692.
58. Galburt, E. A., Chevalier, B., Tang, W.,
Jurica, M. S., Flick, K. E., Monnat, R. J.,
and Stoddard, B. L. (1999) A novel
endonuclease mechanism directly visualized
for I-PpoI. Nature Struct. Biol. 6, 1096
1099.
59. Robinson, C. R. and Sligar, S. G. (1998)
Changes in solvation during DNA binding
and cleavage are critical to altered
specificity of the EcoRI endonuclease. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95, 21862191.
60. Lesser, D. R., Kurpiewski, M. R., and
Jen-Jacobson, L. (1990) The Energetic Basis
of Specificity in the EcoRI EndonucleaseDNA Interaction. Science 250, 776786.
61. Sidorova, N. Y. and Rau, D. C. (2001)
Linkage of EcoRI Dissociation from its
Specific DNA Recognition Site to Water
Activity, Salt Concentration, and pH:
Separating their Roles in Specific and Nonspecific Binding. J. Mol. Biol. 310, 801
816.
62. Vermote, C. L. M. and Halford, S. E.
(1992) EcoRV restriction endonuclease:
Communication between catalytic metal
ions and DNA recognition. Biochemistry 31,
60826089.
63. Yoo, O. J. and Agarwal, K. L. (1980)
Cleavage of single strand oligonucleotides
and bacteriophage phiX174 DNA by Msp I
endonuclease. J. Biol. Chem. 255, 10559
10562.
64. Blakesley, R. W., Dodgson, J. B., Nes, I.
F., Wells, R. D. (1977) Duplex regions in
single-stranded phiX174 DNA are cleaved

by a restriction endonuclease from

Haemophilus aegypius. J. Biol. Chem. 252,
73007306.
65. Shaw, P. C. and Mok, Y. K. (1993) XcmI
as a universal restriction enzyme for singlestranded DNA. Gene 133, 8589.
66. Abdurashitov, M. A., Belichenko, O. A.,
Shevchenko, A. V. and Degtyarev, S. K.
(1996) N.BstSE-site-specific nuclease from
Bacillus
stearothermophilus
SE-589restriction endonuclease production. Mol.
Biol. (Mosk.) 30, 12611267.
67. Morgan, R. D., Calvet, C., Demeter, M.,
Agra, R. and Kong, H. (2000)
Characterization of the specific DNA
nicking activity of restriction endonuclease
N.BstNBI. Biol. Chem. 381, 11231125.
68. Higgins, L. S., Besnier, C. and Kong, H.
(2001) The nicking endonuclease N.BstNBI
is closely related to Type IIs restriction
endonucleases MlyI and PleI. Nucl. Acids
Res. 29, 24922501.
69. Wenz, C., Selent, U., Wende, W., Jeltsch,
A., Wolfes, H., and Pingoud, A. (1994)
Protein engineering of the restriction
endonuclease EcoRV: replacement of an
amino acid residue in the DNA binding site
leads to an altered selectivity towards
unmodified and modified substrates.
Biochim. Biophys. Acta. 1219, 7380.
70. Lanio, T., Selent, U., Wnez, C., Wende,
W., Schulz, A., Adiraj, M., Katti, S. B., and
Pingoud, A. (1996) EcoRV-T94V: a mutant
restriction endonuclease with an altered
substrate specificity towards modified
oligodeoxynucleotides. Protein Eng. 9,
10051010.
71. Schottler, S., Wenz, C., Lanio, A.,
Jeltsch, A., and Pingoud, A. (1998) Protein
engineering of the restriction endonuclease
EcoRV: Structure-guided design of enzyme
variants that recognize the base pairs
flanking the recognition site. Eur. J.
Biochem. 258, 184191.
72. Lanio, T., Jeltsch, A., and Pingoud, A.
(1998) Towards the Design of Rare Cutting

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 23

Restriction Endonucleases: Using Directed

Evolution to Generate Variants of EcoRV
Differing in Their Substrate Specificity by
Two Orders of Magnitude. J. Mol. Biol. 283,
5969.
73. Stahl, F., Wende, W., Jeltsch, A., and
Pingoud, A. (1996) Introduction of
asymmetry in the naturally symmetric
restriction
endonuclease
EcoRV
to
investigate intersubunit communication in
the homodimeric protein. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93, 61756180.
74. Dervan, P. B. (1992) Reagents for the
site-specific cleavage of megabase DNA.
Nature 359, 8788.
75. Ebright, Y. W., Chen, Y., Pendergrast P.
S., and Ebright, R. H. (1992) Incorporation
of an EDTA-metal complex at a rationally
selected site within a protein: application to
EDTA-iron DNA affinity cleaving with
catabolite gene activator protein (CAP) and
Cro. Biochemistry 31, 1066410670.
76. Pendergrast, P. S., Ebright, Y. W., and
Ebright, R. H. (1994) High-Specificity DNA
Cleavage Agent: Design and Application to
Kilobase and Megabase DNA Substrates.
Science 265, 959962.
77. Shang, Z., Ebright, Y. W., Iler, N., et al.
(1994) DNA affinity cleaving analysis of
homeodomain-DNA
interaction:
Identification of homeodomain consensus
sites in genomic DNA. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91, 118122.
78. Koob, M., Burkiewicz, A., Kur J.,
Szybalski, W. (1992) RecA-AC: single-site
cleavage of plasmids and chromosones at
any predetermined restriction site. Nucl.
Acids. Res. 20, 58315836.
79. Schoenfeld, T., Harper, T., and Slater, M.
(1995) RecA Cleavage and Protection for
Genomic Mapping and Subcloning.
Promega Notes 50, 914.
80. Strobel, S. A. and Dervan, P. B. (1991)
Single-site enzymatic cleavage of yeast
genomic DNA mediated by triple helix
formation. Nature 350, 172174.

81. Xu, Y., Lunnen, K. D., and Kong, H.

(2001) Engineering a nicking endonuclease
N.AlwI by domain swapping. Proc. Natl.
Acad. Sci. 98, 1299012995.
82. Kim, Y. G. and Chandrasegaran, S.
(1994) Chimeric restriction endonuclease.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 883887.
83. Kim, Y. G., Shi, Y., Berg, J. M., and
Chandrasegaran, S. (1997) Site-specific
cleavage of DNA-RNA hybrids by zinc
finger/FokI cleavage domain fusions. Gene
203, 4349.
84. Kim, Y. G., Smith, J., Durgesha, M., and
Chandrasegaran, S. (1998) Chimeric
Restriction Enzyme: Gal4 Fusion to FokI
Cleavage Domain. Biol. Chem. 379, 489
495.
85. Smith, J., Berg, J. M., Chandrasegaran,
S. (1999) A detailed study of the substrate
specificity of a chimeric restriction enzyme.
Nucl. Acids Res. 27, 674681.
86. Smith, J., Bibikova, M., Whitby, F. G.,
Reddy, A. R., Chandrasegaran, S. and
Carroll, D. (2000) Requirements for doublestrand cleavage by chimeric restriction
enzymes with zinc finger DNA-recognition
domains. Nucl. Acids Res. 28, 33613369.
87. Bibikova, M., Carroll, D., Segal, D. J.,
Trautman, J. K., Smith, J., Kim, Y-G. and
Chandrasegaran, S. (2001) Stimulation of
Homologous
Recombination
through
Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases.
Mol. and Cell. Biol. 21, 289297.
88. New England BioLabs 200001 Catalog
(2000). New England BioLabs, Inc., 210
211.
89. Dallas-Yang, Q., Jiang, G., and Sladek,
F. M. (1998) Digestion of Terminal
Restriction Endonuclease Recognition Sites
on PCR Products. BioTechniques 24, 582
584.
90. Moreira, R. F. and Noren, C. J. (1995)
Minimum Duplex Requirements for
Restriction Enzyme Cleavage Near the
Termini of Linear DNA Fragments.
BioTechniques 19, 5759.

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 24

91. Hung, L., Murray, E., Murray, W.,

Bandziulis, R., Lowery, R., Williams, R.,
Noble, R. (1991) A Blue/ White Cloning
Assay for Quality Control of DNA
Restriction and Modifying Enzymes.
Promega Notes 33, 1213.

92. Murray, E., Singer, K., Cash, K., and

Williams, R. (1993) Cloning-qualified blunt
end restriction enzymes: Causes and cures
for light blue colonies. Promega Notes 41,
15.

Molecular Biotechnology, Williams, Volume 23, 2003.

Page 25