STRILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

Sterilisasi adalah suatu usaha untuk mengurangi pertumbuhan mikroba pada bahan atau
alat yang akan digunakkan . tujuannya agar saat kita ingin mengamati suatu jenis mikroba pada
suatu media , media kita tidak terkontaminasi dengan mikroba lain dari luar. Sterilisasi dapat
dilakukan secara fisika,kimiawi dan mekanik.
Media merupakan pembenihan atau makanan untuk menumbuhkan suatu
microorganisme. Syarat untuk menumbuhkan mikroorganisme ialah yang mengandung nutrisi
yang mudah digunakkan untuk mikroorganisme ; medium juga harus memiliki pH,tekanan
osmosis dan tegangan permukaan yang sesuai agar mikroba dapat tumbuh ; medium tdk
mengandung zat yang dpt menghambat pertumbuhan mikroba; mdium harus steril sebelum
digunakkan agar mikroorganisme dapat tumbuh dengn baik.
ISOLASI MIKROBA DAN LINGKUNGAN
Isolasi merupakan suatu usaha untuk mngambil suatu mikroorganisme yang ada di
lingkungan dan menumbuhkanya di suatu medium.prtumbuhan mikroorganisme tergantung dari
kadar air. Factor yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi mikroorganisme : Medium
pertumbuhan; sifat dan jenis mikroorganisme;Haibtat mikroorganisme; Cara menginkubasi dan
menginokulasi;Cara mengidntifikasi: Cara pemeliharaanya. Isolasi dilakuka dngan 3 cara yaitu
dngan metode cawan tuang,cawan gores,dan cawan sebar.
Pada praktikum ini digunakkan media PDA dan NA , metode yang digunakkan untuk
isolasi mikroorganisme lingkungan adalah dengan cawan gores dan menggunakan media PDA
dan NA , sedangkan untuk isolasi kuah sayur digunakkan 2 metode yaitu cawan tuang dengan
media NA dan metode cawan sebar dengan media PDA.
Pada media PDA yang tumbuh adalah khamir , hal ini dikarenakan dalam PDA
mengandung sumber karbohidrat yang cukup yaitu terdiri dari 20% kentang dan 2% glukosa
shingga baik untuk prtumbuhan kapang dan khamir tapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri.
KAPANG DAN KHAMIR
Kapang (Mold) : fungi multiseluler,punya filamen , pertumbuhan kapang mudah dilihat
penampakannya seperti serabut pada kapas . kapang mampu memproduksi enzim hidrolitik
maka dari itu kapang mampu tumbuh pada bahan yang mengandung pati,pectin,protein atau
lipid.beberapa kapang bersifat psikotrofik dan beberapa nersifat termofilik.
Khamir (Yeast) : Khamir merupakan sel eukariot , ukurannya lebih besar daripada ratarata ukuran sel bakteri dan mekanisme perkembangbiakannya berbeda.khamir merupakan sel
yang sederhana dibandingkan fungi tapi struktur selnya lebih kompleks. Khamir dapat
dibedakan jadi 2 kelompok berdasarkan sifat metabolismenya yaitu bersifat Fermentatif , jenis
fermentative dapat mlakukan fermentasi alcohol yaitu memecah gula menjadi alcohol dan gas
(Pada roti) dan Oksidatif , Oksidatif (respirasi) maka akan menghasilkan CO2 dan H2O.
keduanya bagi khamir dipergunakkan untuk nergi,walaupun energy yang dihasilkan melalui
respirasi lebih tinggi dari yang melalui fermentasi.

Pengamatan Makroskopik Kapang : Menggunakan biakan murni Penicillium

citrinum , yang diamati adalah warna,tekstur, zonasi,exudate drop , reverse colony,growing
zone,dan umur biakan. Sedangkan pengamatan mikroskopik pada kapang dilakukan dengan
menginokulasi biakan ke cover glass lalu diberi larutan lacthopenol cotton blue , pemberian
larutan tsb bertujuan agar memudahkan dalam mngamati morfologinya.biakan yang dibri larutan
akan berwarna hijau kbiruan , hal ini karena spora secara sederhana bisa dilihat sebagai badan
intraseluler pada suspensi. Dinding spora relative impermeable tetapi zat pewarna dapat dibuat
menembusnya dngan pmanasan preparat. Sifat impermeable juga dapat menghambat pross
dekolorisasi pada tahap pemberian alcohol yang biasanya cukup untuk dekolorisasi sel
vegetative. Hasil yang tramati pada Penicillium citrinum adalah : memiliki konidiofor,konidiofor
berbentuk penicilate,diuung fialin ada konodia,konodi berbentuk globase atau avoid.
Pengamatan Makroskopik Khamir : Menggunakan biakan murni Sacaharomycess
cerevisae , pada khamir yang diamati adalah warna,tekstur ,permukaan , tepi koloni,profil dan
umur biakan . sedangkan pengamatan mikroskopik diamati dngan menginokulasi biakan murni
yang diletakkan di kaca objek dan diberi larutan methylene blue . yang teramati pada khamir
adalah Pseudomiselium yang berbentuk bulat lonjong .
Pengamatan Henricis Slide : digunakkan dengan membuat media biakan . digunakkan
cawan petri yang diisi dengn kapas lalu diletakkan kaca objek yang disanggah dengan tusuk
gigi , tujuanny agar kaca objek tidak langsung menyentuh kapas. Setelah itu kapas dibasahi agar
didapat suhu yang baik untuk lingkungan hidup kapang. Kapang Fussarium diinookulasi dan
diletakkan di kaca objek. Yangs sebelumnya sudah diletakkan media ,setelah itu ditutup . yang
berhasil kami amati hanya hifa yang berbentuk seperti ranting.menurut literatur sturkur dari
fussarium memiliki tubuh berupa miselium bercabang,hialin dan juga bersekat, memiliki
makrokonidia dan mikrokonidia .makrokonidia terdiri dari 2 atau lebih sel. Sedangkan
mikrokonidia terdiri dari 1-3 sel berbentuk bulat atau silinder trsusun jadi rantai atau gumpalan .
makrokonidum berbentuk sabit,bertangkai kcecil.
DESINFEKSI DAN DESINFEKTAN
Bahan antiimikroba sebagai bahan yang dapat mengganggu pertumbuhan dan
metabolisme mikroba . zat-zat antimikroba dapat bersifat bakteriostatik
(menghambat),Bakterisidal ( membunuh) , Fungisidal ( membunih kapang) atau Germisidal
(Menghambat germinasi spora bakteri).
Antimikroba dapat dikelompokan menjadi antiseptic dan desinfektan. Antiseptic
pembunuhan mikroba dengan daya rendah dan biasa digunakkan pada jaringan hidup,sedangkan
desinfektan adalah senyawa kimia yang dapat membunuh mikroba, biasa digunakkan pada
meja,lantai dll. Zat antimikroba dalam melakukan efeknya thdp mikroorganisme : merusak
dinding sel; mengubah permabilitas mmebran sel ; menghambat kerja enzim; menghambat
sintesis asam nukleat dan protein
Dsinfktan dapat membunub mikroorganisme pathogen pada enda mati maupun benda
hidup.desinfktan tingkat tinggi dapat membunuh jenis-jnis virus terentu untuk mendesinfksi

permukan dapat dipakai salah satu dari 3 desinfktan seperti iodophor,derivat fenol atau sodium
hipokrit.
Cara kerja praktikum ini ialah dengan membagi cawan petri menjadi 4 bagian . lalu
biakan baktri diinokulasi dgn mikropipet kemudian ditambahkan medium cair setelah itu
dihomogenkan,bila sudah padat diberi papper disc pada masing2 bagian petri. Papper disc yang
sudah diclupkan ke larutan wipol,sabun cuci muka,ekstrak kencur dan amoxcyilin . lalu
diinkubasi untuk mengetahui terjadi zona bening atau tidak. Bakteri yang digunakkan adalah
S.aureus dan Vibrio cholera . hasilnya hanya ada 1 yg tidak terbentuk zona bening,yaitu pappaer
disc ekstrak kencur .
Pembersih lantai mengandung fnol,senyawa fenol sbg antibakteri adalah dengan
mendentaurasi ikatan protein pada membrane sel sehingga membrane sel lisis dan
memungkinkan fenol menembus kdalam sitoplasma yang menyebabkan bakteri tdk berkembang.
Sabun cuci muka merupakan ikatan antara natrium atau kalium dengan as. lemak tinggi
dan bersifat germisida walaupun tdk begitu kuat missal pada pneumococcus dan streptococcus .
sabun juga menyebabkan mnurunya teganggan permukaan ,sehingga mikroba mudah terlepas
dari kulit atau pakaian.
Antibiotic tersebar dialam dan memegang peranan penting dlm mengatur populasi
mikroba dalam tanah,air dan limbah,kompos. Antibiotic berbeda dalam sususnan kimia dan cara
kerjannya .
Bakteri idealnya hidup dalam kondisi larutan yang isotonis apabila dalam larutan
hipertonis maka cairan dalam sel akan terdesak keluar dan pecah sehinggga terjadi
plasmolysis.Jenis antimikroba juga mempengaruhi kerja desifektan S.aurus merupakan bakteri
gram positif ,bakteri gram positif cenderung mmbentuk zona bening yang lebih luas,karna
bakteri gram positif umumnya mmiliki kesensitifan yang tinggi thdp snyawa antimikroba . hal ini
krna perbedaan struktur dinding sel pada kedua gol.bakteri tsb.

PEWARNAAN BAKTERI DAN ENDOSPORA

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnyya berwarna.
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi 2 golongan yaitu asam dan basa. Zat warna asam umumnya
punya sifat yang dapat bersenyawa lebih mudah dengan bagian sitoplasma sel ,sedangkan zat
warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel . Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh
factor-faktor spt : Substrat;Intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
Endospora merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim.
Karena kandungan air endospore sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya
.Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa , karna bakteri pngasil spora biasanya

tahan terhadap pewarnaan.digunakkan metode Schaeffer-fulton yang banyak dipakai pada

pengecatan endospore.
Pewarnaan Negatif : Dilakukan dengan menaruh suspense biakan Streptococcus
pneumonia dengan jarum ose,lalu ditetsi larutan tinta cina diatasnya ,diamati . tujuan pewarnaan
negative adalah agar bagian yang terwarnai latarblakangnya menjadi hitam gelap dan bakteri
terlihat transparan.pada metod ini tdk terjadi pemanasan sehinggaa terjadi penyusutan dan salah
satu bentuk agar kurang,sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan hasil yang tepat.bentuk
bakteri yang terlihat ialah coccus dan terlihat berkoloni.pewarna tinta cina tdk menembus atau
berikatan dengan dinding sel bakteri . tinta cina merupakan zat pewarna asam yang akan
menghasilkan pewarnaan pada latarbelakangnya saja .
Pewarnaan Sederhana : Dilakukan dengan menetesi larutan methylene blue diatas
object glass baru lah di taruh suspense bakteri diatasnya dan diratakan .kemudian tunggu hingga
kering setelah itu difiksasi agar bakteri yang digunakkan mati namun organ dan strukturnya tidak
rusak.diamkan 1-2 menit lalu dicuci dengan air mengalir ,dikeringkan dan diamati.tujuan
dilakukannya pewarnaan ini adalah untuk melihat bentuk sel bakteri serta mngetahui morfologi
dan susunan selnya . pada suspense bakteri yang diamati terlihat selnya berwarna biru,hal ini
terjadi karena dinding sel bakteri yang memiliki muatan negative bersatu dengan ion yang
bermuatan positif dari methylene blue dan menyebabkan sel bakteri tsb terwarnai.stlh diamati
bentuk bakterinya adalah coccus dan bagian tepi berwarna biru..
Pewarnaan Gram : Dilakukan dengan menaruh suspense bakteri diatas object glass lalu
diratakan,kemudia diberi lart.kristal violet diamkan selama 1 menit dicuci dengan air mengalir
dan dikeringakn.selanjutnya ditetesi dengan lart.iodine didiamkan selama 1 menit lalu dibilas
dan dikeringkan.kemudian ditetesi dngan aceton ,diamkan 30 detik lalu bilas dan
keringkan.terakhir tetesi dengan safranin diamkna 2 menit lalu dibilas dan keringkan,preparat
siap diamati.
Untuk bakteri gram positif akan membentuk kompleks Kristal iodine berwarna biru , setelah
ditambhkan safranin bakteri akan berwanr ungu sedangkan bila gram negative maka akan
berwarna merah. Lart. Kristal violet merupakan pewarnaan dasar dan termasuk zat warna basa
,pewarna ini dapat mewarnai bagian bakteri dengan jelas ; lart iodine berfungsi untuk
dekolorisasi : lart. Aceton sbg peluntur ,artinya tercuci atau tidaknya warna dasar sangat
bergantung pada komposisi dinding sel, apabila kompone dinding selnya tdk kuat maka akan
tercuci.; lart pewarna safranin sbg pembanding ,apabila warna pembanding tdk tercuci maka
warna pembanding akan terlihat.
Hasilnya bakteri Strptococcus pneumonia adalah bakteri gram positif karena saat warna
dasar Kristal violet dicuci dengan alcohol warnannya tdk luntur dan tdk meyerap warna
pembanding . bakteri gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol , hal ini
akan mengecilkan pori-pori sehingga menghasilkan kompleks Kristal iodium . bakteri gram
positif adalah jenis bakteri yang memiliki dinding peptidoglikan yang tebal sehingga mengikat
warna dengan snagat kuat. . streptococcus pneumonia memiliki kapsul polisakarida yang

memudahkan untuk pengelompkan antisera spesifik dan juga mudah dilisis dengan agen aktif
pada permukaan.
Pewarnaan Endospora : Suspensi bakteri diambil dan diletakkan diata object glass
kemudian difiksasi secukupnya hingga kering. Agar bakteri yg digunakkan mati ,selanjutnya
apusan bakteri diberi malasit green ,masuknya pewarna dalam endospore dibantu dengan object
glass yang diletakkan di ram kawat diatas air mendidih selama 7 menit agar endospore yang
berkembang berwarna hijau dan endospore tetap lembab. Lalu dinginkan sebentar kemudian
dicuci di air mengalir,keringkan lalu tetesi dngan lart.safranin ditunggu 5 menit lalu dicuci
dengan air mengalir ditiriskan diamati , endospore akan berwarna hijau dan sel vegetative akan
tampak berwarna merah.
Bakteri yang tidak berspora cenderung tdk tahan pengecatan karena hanya memiliki sel
vegetative . saat diwarnai oleh malachite green , sel vegetative dapat megikat warna tapi dpt
luntur karna ikatanya tdk kuat , setelah pewarnaan selanjutnya dgn safranin , sel vegetative
mudah mengikat warna kembali . oleh Karena itu hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari
safranin.
Spora dari Bacillus thuringiensis merupakan suatu usaha utk melindungi diri dari
pengaruh lingkungan yang buruk , hal ini terjadi karena dinding sel bakteri bersifat
impermeable . hasil yang diamati bakteri berbentuk bulat dgn tepi tebal , struktur spora dari
dalam keluar scr berurutan yaitu : inti,protoplasma ,dinding sel germinal dan korteks .

DETERMINASI BAKTERI
Menurut Jutono dkk. (1980), berikut ini merupakan klasifikasi mikroorganisme
berdasarkan kebutuhannya terhadap oksigen, yaitu:
1. Golongan aerobik : Dapat menggunakan oksigen bebas sebagai aseptor tunggal
hidrogen terakhir dalam proses respirasi.
2. Golongan anaerobik : Tidak dapat menggunakan oksigen bebas sebagai aseptor
hidrogen terakhir dalam proses respirasi.
3. Golongan mikroaerofilik : Membutuhkan oksigen dalam jumlah yang sangat sedikit.
4. Golongan fakultatif anaerobik dan fakultatif aerobik : Hidup secara terbatas dalam
keadaan aerobik atau anaerobik.
5. Golongan kaprofilik : Memerlukan oksigen dengan kadar yang rendah, tetapi kadar
CO2-nya tinggi
Cara kerja
1. Morfologi koloni bakteri pada medium agar miring
Biakan murni Bacillus thuringiensis masing-masing diambil dengan ose berujung
bulat kemudian digoreskan zig-zag pada tabung reaksi yang berisi medium agar miring.

Tabung reaksi diberi label dan ditutup dengan kapas. Tabung reaksi diinkubasi pada.
Koloni bakteri yang terbentuk diamati pertumbuhan, bentuk pertumbuhan pada bekas
goresan, elevasi, kilat, warna, bau kemudian hasilnya dicatat.
2. Morfologi koloni bakteri pada medium agar tegak
Biakan murni Bacillus thuringiensis masing-masing diambil dengan jarum enten
kemudian ditusukkan pada tabung reaksi yang berisi medium agar tegak. Tabung reaksi
diberi label dan ditutup dengan kapas Tabung reaksi diinkubasi pada. Koloni bakteri yang
terbentuk diamati pertumbuhan dan bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan kemudian
hasilnya dicatat.
3. Morfologi koloni bakteri pada medium cair
Biakan murni Bacillus thringiensis masing-masing diambil dengan ose berujung
bulat kemudian diaduk-aduk pada tabung reaksi yang berisi medium cair. Tabung reaksi
diberi label dan ditutup dengan kapas. Tabung reaksi diinkubasi. Koloni bakteri yang
terbentuk diamati kekeruhan, bau, endapan, pertumbuhan pada permukaan kemudian
hasilnya dicatat.
4. Morfologi koloni bakteri pada medium padat petridish
Biakan murni Bacillus thuringiensis diambil dengan ose berujung bulat kemudian
digoreskan dengan metode spread plate (10-4) Petridish berisi medium ditutup rapat dan
diberi label Petridish yang diinkubasi. Koloni bakteri yang terbentuk diamati
pertumbuhan, bentuk koloni, permukaan, elevasi, bentuk tepi dan hasilnya dicatat.
Hasil
Na tegak : penggunaan medium Na tegak bertujuan untuk ,melihat motilitas dari
bakteri yang diinokulasi dengan melihat prtumbuhannya pada bekas tusukan dan
untuk mengetahui kebutuhan bakteri akan oksigen.setelah diinkubasi hasil
pertumbuhannya merata dan bentuk permukaanya filiform . bakteri tumbuh
dipermukaan atas agar , sampai dasar tabung yang diberi tusukan . menurut teori
Bacillus thuringiensis merupakan bakteri yang bersifat fakultatif aerob,cendrung
pertumbuhannya pada bagian permukaan medium. Bakteri tsb tumbuh optimum pada
kondisi aerob,tapi dpt tumbuh juga pada kondisi anaerob
Na miring : untuk melihat kebutuhan oksigennya juga.Bacillus memiliki pertumuhan
yang lebat pada permukaanya dengan bentuk pertumbuhan pada bekas gorsan
filiform,tip levasi flat,mengkilat,topografinya tdk beraturan ,warnanya
kuning,opalescent,konsistensinya slimy dan pada medium tdk trjd perubahan warna.

NB Cair : Penggunaan Nb cair bertujuan untuk melihat proses metabolic

pertumbuhan mikroba dan mngetahui kbutuhan bakteri akan oksigen . hasilnya adalah
pelicel dengan kekeruhan yang sdang dan endapan yang berbentuk butiran.
Kekeruhan merupakan indicator adanya pertumbuhan bakteri ,makin keruh makin
banyak tumbuh.Endapan yang terbentuk merupakan massa bakteri yang sudah
mati ,makin cepat pertumbuhannya maka semakin tinggi fase kematiannya karna
nutrient yang trsedia makin lama makin menipis karna digunakkan utk aktivitas
kehidupan bakteri tsb . makin cepat pertumbuhannya maka semakin banyak
endapanya karena daya regenerasi sekaligus reproduksi semakin besar.
Na Lempeng : bertujuan untuk melihat morfologi pertummbuhan koloni bakteri serta
meliahat kebutuhan bakteri akan oksigen . Pada metode ini digunakkan cara spread
plate yang bertujuan agar mendapat koloni tunggal. Hasilnya pertumbuhan bakterinya
merata dan bakteri tsb diketahui bersifat arob karna baktri akan tumbuh brupa sprader
diatas permukan medium.
PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA (MPN)