ESCHERICIA COLI

ESCHERICIA COLI
Metode APM (Angka Paling Mungkin)
Prinsip :

Pertumbuhan E.Coli yang di tandai oleh terbentuknya gas didalam tabung Durham setelah di
inkubasikan dalam perbenihan yang cocok pada suhu 44oC selama 24-48 jam, yang di ikuti oleh uji
biokimia dan selanjutnya di rujuk pada tabel APM.

Landasan Teori :

E-Coli
E.Coli adalah baktri coliformyang sering ditemukan pada faces manusia dan hewan berdarah
panas. Organisme ini tersebar luas di alam biasanya lazim terdapat dalam sel pencernaan manusia dan hewan.
Dalam Merchant dan Parker (1961) disebutkan spesies E. coli tidak dapat mengurangi asam sitrat
dan garam asam sitrat sebagai sumber karbon tunggal dan tidak menghasilkan pigmen, tetapi kadangkadang menghasilkan pigmen berwarna kuning.
Klasifikasi Escherichia coli :
Divisio

Schizomycota

Kelas

Schizomycetec

Ordo

Eubacteriaceae

Genus

Escherichia

Species

Escherichia coli (Salle, 1961)

E. coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora
normal di usus. Meskipun demikian, beberapa jenis E. coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe yang
masuk dalam golongan E. coli Enteropatogenik, E.coli Enteroinvasif, E. coli Enterotoksigenik dan E.coli
Enterohemoragik . Jadi adanya E. coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum tersebut pernah
terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karenanya standar air
minum mensyaratkan E. coli harus absen dalam 100 ml.

Berbagai cara pengujian E. coli telah dikembangkan, tetapi analisis konvensional yang masih banyak
dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis yang memerlukan waktu 5-7 hari. Empat tahap analisis tersebut
adalah Uji Pendugaan dengan metode MPN ( most probable number ), Uji penguat pada medium selektif, Uji
lengkap dengan medium lactose broth, serta Uji Identifikasi dengan melakukan reaksi IMViC (indol, methyl
red, Vogues-Praskauer, dan citrate). Jadi untuk dapat menyimpulkan E. coli berada pada air atau makanan
diperlukan seluruh tahapan pengujian di atas. Apabila dikehendaki untuk mengetahui serotipe dari E. coli yang
diperoleh untuk memastikan apakah E.coli tersebut patogen atau bukan maka dapat dilakukan uji serologi.
Meskipun demikian, beberapa serotipe patogen tertentu seperti O157:H7 yang ganas tidak dapat diuji langsung
dengan pengujian 4 tahap ini dan memerlukan pendekatan analisis khusus sejak awal.

E. coli tersebar diseluruh dunia dan ditularkan bersama air atau makanan yang terkontaminasi oleh feses.
Escherichia coli berbentuk batang, tebal 0,5 m; panjang antara 1,0 - 3,0 m; bervariasi dari bentuk
koloid
sampai
berbentuk
seperti
filamen
yang
panjang;
tidak
berbentuk spora; motil dan filamen perithin beberapa galur tidak memiliki flagella; bersifat Gram negatif
(Merchant dan Parker, 1961).

E. coli bersifat aerob atau kualitatif anaerob, dapat tumbuh pada media buatan. Beberapa sifat E. coli
antara lain pertumbuhan optimum pada suhu 37C, dapat tumbuh pada suhu 15C 45C, tumbuh baik
pada pH 7,0 tapi tumbuh juga pada pH yang lebih tinggi (Merchant dan Parker,1961)

Koloni terlihat basah, mengkilat, tidak bening, bulat dan dengan tepi yang terlihat halus dan rata. Koloni
muda terlihat granuler halus dan makin tua menjadi granuler kasar. Escherichia coli menghasilkan
asam dan gas dari glukosa, laktosa, fruktosa, maltosa, arabinosa,
xylosa, rhamnosa
dan manitol; dapat
atau
tidak
memfermentasi
sukrosa,
rafinosa,
salisin,
eskulin,
dulsitol
dan
gliserol;
bervariasi
dalam
memfermentasi
sakrosa
dan
salisin,
pektin
dan
adonitol jarang difermentasikan; dekstrin, pati dan glikogen dan inositol tidak pernah difermentasikan
(Merchant dan Parker, 1961).

Escherichia coli menghasilkan katalase, tidak mencairkan gelatin, membentuk indol,mereduksi

nitrat,mengoksidasi dan mengasamkan air susu tanpa peptonisasi,mengoksidasi kentang sehingga berwarna
coklat gelap,tidak menghasilkan gas H2S (Merchant dan Parker, 1961).

Peralatan :
a. Penangas air
b. Waterbath Inkubator 44-45oC
c.

Pipet Volume 1 mL, 10 mL

d. Ose
e. Labu Erlenmeyer
f.

Tabung Reaksi

Perbenihan dan pereaksi

a. Eschericia Coli Broth (EC Broth)
b. BGLB Broth
c.

EMB Agar

d. MR-VP Medium
e. Nutrient Agar (NA)
f.

Larutan Methyl Red

g. Pereaksi Voges Proskauer

h. Pereaksi untuk Pewarnaan Gram
i.

Pereaksi Indol

j.

Larutan alfa-Naphtol

k.

Larutan KOH 40%

Cara Kerja :

a) Masukkan 1 sengkelit biakan yang positif gas pada LB dan pengujian APM bakteri Coliform kedalam
tabung berisi E.C Broth yang di dalamnya terdapat tabung durhamterbalik.
b) Inkubasikan dalam penangas air pada suhu 44-45oC selama 24-48 jam.
c) Catat tabung yang didalamnya terbentuk gas (E.Coli dianggap positif, jika di dalam tabung
terbentukgas).
d) Lanjutkan penetapan E.Coli dengan menginokulasikan biakan yang membentuk gas ke perbenihan
EMB atau VRBA dalam cawan petri.
e) Inkubasikan pada suhu 37oC selama 18-24 jam.
f)

Pilih koloni berwarna merah gelap (VRBA) yang berdiameter 0,5 mm atau lebih atau koloni
berwarna kilat logam hijau metalik (EMB Agar) dan di inokulasikan pada

g) Nutrien Agar miring dalam tabung, Inkubasikan pada suhu 35oC selama 18-24 jam.

Pada waktu yang sama lakukan pewarnaan gram sebagai berikut :

a. Buat sediaan diatas kaca alas. Keringkan di udara dan fiksasikan dengan panas. Wamal sediaan
dengan larutan cristal Violet ammonium Oxalate selama 1 menit. Cuci dengan air dan tiriskan.
Bubuhkan larutan Lugol (Gram iodium) selama 1 menit. Cuci dengan air kran dan tiriskan. Cuci
(Hilangkan warna) dengan alkohol 95% selama 30 detik. Cuci dengan air kran, tiriskan dan bubuhkan
larutan safranin selama 10-30 detik. Cuci dengan air kran, tiriskan, serap dengan kertas saring,
keringkan dan periksa dibawah mikroskop.

Pengujian IMVIC :

a) Uji Indol
Dari biakan murni nutrien agar miring, inkubasikan 1 sengkelit Biakan kedalam Trypton broth.
Inkubasikan pada suhu 35oC selama 18-24 jam. Tambahkan 0,2-0,3 ml pereaksi indol kedalam
masing-masing tabung dan kocok selama 10 menit. Warna merah tua pada permukaan menunjukkan
reaksi indol positif. Warna jingga menunjukkan reaksi indol negatif.

b) Uji merah Methyl

Dari biakan murni nutrien agar miring, inokulasikan 1 sengkelit biakan kedalam perbenihan MR-VP.
Inkubasikan pada suhu 35oC selam 48 jam. Dengan menggunakan pipet, pindahkan 5 ml ke dalam
tabung reaksi, tambahkan 5 tetes MM dan kocok. Warna kuning menunjukkan reaksi negatif dan
warna merah menunjukkan reaksi positif.

c) Uji VP
Dari biakan murni nutrien agar miring, inokulasikan 1 sengkelit biakan kedalam perbenihan MR-VP.
Inkubasikan pada suhu 36oC selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet, pindahkan 1 ml suspensi
kedalam tabung, jtambahkan 0,6 ml larutan alfa-naphtol dan 0,2 ml larutan KOH dan kocok. Diamkan
selama 2-4 jam. Warna merah muda hingga merah tua menunjukkan reaksi positif, warna tidak
berubah menunjukkan reaksi negatif.

Hasil dinyatakan sebagai berikut :

Diamati terbentuknya gas dalam tabung durham. Jika terbentuk gas, dengan menunjukkan ke tabel
Angka Paling mungkin, dapat dinyatakan APM E.Coli.

Ditegaskan hasil uji pewarnaan gram dan reaksi biokimia. Jika pewarnaan gram menunjukkan adanya
bakteri berbentuk batang dan warna merah muda (gram negatif) serta reaksi biokimia menunjukkan
uji indol dan merah metil positif, dan uji VP negatif, dapat dinyatakan penegasan adanya E.Coli

Hitung APM E.Coli per gram atau mililiter contoh dengan menggunakan tabel APM.