lrutan utk pmbilasan n fiksasi ,, klebihan n kkurangan mjemuk n tunggl, dehidrasi apa prinsip, thapannya

BAB II
ISI

2.1. Fiksatif Tunggal Bahan Pembuatan Fiksatif Campuran

Bahan-bahan kimia dibawah ini pada awalnya digunakan sebagai fiksatif tunggal.
Tetapi pada perkembangan selanjutnya, bahan-bahan tersebut kecuali beberapa bahan
tertentu, sudah jarang digunakan secara sendirian tetapi dijadikan sebagai salah satu
komponen dari fiksatif komponen.
1. Asam Asetat (CH3COOH)
Asam asetat adalah bahan fiksatif paling tua yang pernah dikenal, sejak abad ke -18
asam cuka telah digunakan untuk mengawetkan hydra. Dalam teknik modern, bahan ini
jarang digunakan secara tunggal tetapi merupakan komponen pnting dari berbagai larutan
fiksatif berhubung karena aksinya yang sangat efektif dalam memfiksasi inti sel dan daya
penetrabilitasnya yang tinggi. Asam asetat memfiksasi nucleoprotein dengan baik tetapi tidak
memfiksasi protein sitoplasma. Tidak mengeraskan jaringan bahkan sebaliknya dapat
mencegah mengerasnya jaringan karena yang disebabkan alcohol.
Asam asetat murni sering disebut asam asetat glacial (asam asetat berasap) karena
konsentrat ini bersifat padat pada temperatur di bawah 170C.
2. Aseton (CH3COCH3)
Aseton biasanya digunakan untuk mempelajari enzim-enzim jaringan seperti fosfatase
dan lipase. Bahan ini memiliki daya penetrasi jaringan yang rendah sehingga hanya potongan
jaringan yang akan difiksasi haruss kecil ukurannya, digunakan dalam keadaan dingin.
3. Kromium trioksida (CrO3), asam kromat
Kristalin kromium trioksida (CrO3) disebut asam kromat jika dilarutkan dalam air,
biasanya dengan konsentrasi 0,5%. Sifat-sifat umumnya antara lain : menembus jaringan
dengan lambat, mengeraskan jaringan secara moderat, menimbulkan sedikit kerutan jaringan,
membentuk rongga dalam sitoplasma dan sedikit mengubah struktur (bentuk) inti. Bahan ini
merupakan koagulan nucleoprotein yang baik dan meningkatkan daya serap bahan inti
terhadap warna. Selain itu juga dapat mengoksidasi polisakarida menjadi bentuk aldehida,
suatu sifat yang dimanfaatkan dalam uji histokimia Bauer untuk melokalisasi glikogen dan
polisakarida yang lain.
4. Alkohol
Adalah fiksatif umum jaringan yang kurang baik karena tidak dapat memfiksasi bahan
inti (kromatin) secara memadai. Bahan ini merupakan koagulan sitoplasma yang baik tetapi
tidak dapat digunakan untuk memfiksasi lipida karena lipida larut dalam alkohol. Etil alkohol
(etanol, C2H6OH) akan mengeraskan jaringan tetapi kadang-kadang digunakan sebagai
fiksatif untuk enzim-enzim tertentu dan sangat baik untuk jaringan saraf terutama jika ingin
mempelajari badan Nissl.
Metil alkohol (metanol, CH3OH) biasanya digunakan sebagai fiksatif tunggal,
khususnya untuk jaringan hematologis.
5. Aldehida (HCHO)
 Formaldehida umumnya dijual dalam bentuk larutan (biasanya 40%) dalam air
dengan nama formalin. Kandungan actual formalin dalam suatu larutan biasanya ditentukan
berdasarkan produk komersial, contohnya: larutan formalin 10% berarti terdiri dari 10 bagian
formalin komersial (formalin 40%) dicampur dengan 90 bagian akuades, kecuali dinyatakan
lain.
Jika dibiarkan terlalu lama, formali akan mengalami polimerisasi membentuk
paraformaldehida atau mengalami oksidasi menjadi asam format. Formaldehida yang telah
mengalami polimerisasi ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna putih.
Formalin dapat mempenetrasi jaringan dengan kecepatan yang moderat, tetapi aksi
fiksasinya berjalan lambat. Walaupun formalin dapat mengawetkan sel-sel secara memadai,
tetapi sel-sel tersebut tidak dapat terlindungi secara penuh kecuali jika jaringan dikeraskan
dengan cara merendamnya dalam formalin untuk jangka waktu yang lama.
Formalin merupakan fiksatif yang baik untuk lemak tetapi tidak memfiksasi
karbohidrat yang larut, tidak melarutkan lipoid atau lemak tetapi melarutkan sebagian
glikogen dan urea.

6. Merkuri Klorida (HgCl2)

Biasanya digunakan dalam bentuk larutan jenuh dalm air (lebih kurang 70%), bersifat
asam berhubung terjadinya pelepasn ion H+ dan Cl- dalam air tersebut. Merkuri klorida
mempenetrasi jaringan cukup cepat tetapi kalah cepat dibandingkan asam asetat,
mengeraskan jaringan secara memadai. Merkuri klorida sangat baik untuk memfiksasi
mucin.
Kelemahan merkuri klorida antara lain adalah bahan ini mendepositkan endapan
bahan kimia tertentu dalam jaringan. Endapan ini dapat berupa kristalin (berbentuk jarum)
atau merkuri logam (endapan amorf atau ireguler). Kelemahan lain erkuri klorida adalah
kenyataan bahwa kristal merkuri klorida bersifat menghambat pembekuan jaringan sehingga
sangat sulit untuk membuat sayatan beku yang baik dengan bahan ini.
7. Osmium tetroksida (OsO4), asam osmat
Dalam larutan (biasanya 1% dalam akuades) osmium tetroksida akan bereaksi dengan
satu molekul air membentuk H2OsO5 yang secara salah sering disebut asam osmat. Catatan,
rumus molekul osmat seharusnya H2OsO4.
Asam osmat mengawetkan sitoplasma dan inti tetapi, walaupun dapat meningkatkan
pewarnaan kromatin oleh pewarna basa, bahan ini malah menurunkan pewarnaan sitoplasma.
Karena asam osmat akan tereduksi oleh cahaya dan panas, maka bahan ini disimpan pada
tempat yang gelap dan dingin
Asam osmat merupakan fiksatif yang baik untuk preparasi mikroskop electron,
jaringan umumnya dipostfiksasi dengan larutan ini sebelum diproses untuk keperluan
pengamatan dengan mikroskop elektron.
8. Asam pikrat [C6H2(NO2)3OH]
Digunakan dalam bentuk larutan jenuh dalam aquades (0,9 1,2%). Bahan ini
merupakan koagulan protein yang sangat baik dan akan membentuk protein pikrat yang
 memiliki afinitas yang sangat kuat terhadap pewarna asam, tidak melarutkan lipida dan
sangat direkomendasikan untuk fiksasi glikogen.
Asam pikrat merupakan konstituen fiksatif yang digemari karena tidak mengeraskan
jaringan, tetapi bahan ini tidak dapat digunakan sendirian sebagai fiksatif tunggal karena efek
pengkerutannya yang sangat besar.
9. Kalium dikromat (K2Cr7O7)
Kalium dikromat merupakan suatu non koagulan protein dan membuat protein
bersifat lebih basa tetapi dapat melarutkan nucleoprotein. Kalium dikromat biasanya
digunakan dalam pengamatan mitokondria.
Kalium dikromat dapat dikombinasikan dengan merkuri klorida, asam pikrat dan
asam osmat, tetapi akan bereaksi dengan formalin sehingga tidak boleh dicampur dengan
formalin sampai saat akan digunakan. Jika ditambahkan asam asetat, mitokondria akan hilang
tetapi kromosom menjadi lebih jelas. Setelah fiksasi sebaiknya jaringan dicuci terlebih dahulu
dengan air untuk mencegah terbentunya endapan Cr2O5jika jaringan langsung bersentuhan
dengan alkohol.
10. Asam trikloroasetat (CCl3COOH)
Bahan ini tidak pernah digunakan sebagai fiksatif secara tunggal, sifat aksinya sama
dengan asam asetat, dapat membengkakkan jaringan dengan memiliki aktivitas dekalsifikasi.
Setelah fiksasi sebaiknya jaringan dicuci dengan alkohol dan bukan dengan air.

11. Larutan Gilson

Merkuri klorida jenuh 20 bagian
Asam kromat 1% 20 bagian
Asam nitrat 2 bagian
Asam asetat glasial 2 bagian
Larutan jenuh merkuri klorida dibuat dengan melarutkan 10 g bahan ini dengan 100
mlakuades. Larutan Gilson mematikan dan menembus jaringan dengan cepat, serta tidak
menimbulkan kontraksi jaringan. Larutan ini sangat baik untuk invertebrata seperti annelida,
cacing pipih, cacing giligdan larva insekta.
12. Larutan Bensey AOB
Asam osmat 2% 2 ml
Kalium dikromat 2,5% 8 ml
 Asam asetat glasial 1 tetes
Fiksatif ini sangat disarankan untuk tujuan pengamatan mitokondria.
13. Larutan Regaud
Kalium dikromat 3% 80 ml
Formalin komersial 20 ml
Karena larutan ini merupakan larutan fiksatif umum sitoplasma, maka jika ingin
mengamati mitokondria ada baiknya jika formalin dinetralisasi terlebih dulu sampai pH 6,5
sebelum dicampur dengan kalium dikromat. Setelah fiksasi sebaiknya jaringan dicuci terlebih
dahulu.
14. Larutan Bianco
Asam kromat 1g
Asam asetat glasial 5 ml
Akuades 100 ml
Fiksatif ini khusus diadaptasi untuk digunakan pada invertebrata kecil. Larutan yang
digunakan harus segar (disiapkan beberapa saat sebelum digunakan), jaringan direndam
selama 30 menit (untuk larva invertebrata) atau satu malam (untuk polychaeta). Setelah
fiksasi jaringan harus dicuci dengan air ledeng mengalir sampai warna hilang.
15. Larutan Gate
Asam kromat 0,7 g
Asam asetat glasial 0,5 ml
Akuades 100 ml
Larutan ini sangat baik untuk fiksasi kromosom yang terdapat pada uujung akar
tumbuhan. Sampel jaringan harus direndam selama satu malam dan kemudian dicuci dengan
air ledeng mengalir.
16. Larutan Navashin
Asam kromat 0,8 g
Asam asetat glasial 20 ml
Formalin komersial 5 ml
Akuades 100 ml
Larutan ini harus dibuat selalu segar, atau dibuat dalam bentuk dua larutan dimana
asam kromat harus terpisah dari formalin.
17. Larutan Carnoy
Alkohol absolut 60 ml
Kloroform 30 ml
Asam asetat glasial 10 ml
Rendam potongan kecil jaringan selama 30 90 menit lalu pindahkan ke dalam
kloroform murni selama 30 menit dan kemudian langsung pindahkan ke parafin cair 93 kali
ganti). Tanam dalam parafin. Tidak dibutuhkan dehidrasi setelah fiksasi. Ini merupakan
metode cepat untuk sayatan parafin, dan memberi hasil yang cukup memadai untuk tujuan
pengamatan histologi umum. Tetapi jika waktu bukanlah faktor pembatas, sebaiknya larutan
ini tidak digunakan karena bisa mengeriputkan jaringan secara signifikan.
18. Larutan Alkohol-Formalin-Asetat (AFA)
 Etanol 70% 90 ml
Formalin komersial 10 ml
Asam asetat glasial 2 ml
Fiksatif ini sangat umum digunakan dalam teknik parasitologi untuk memfiksasi
cacing parasit dalam usus teristimewa jika ingin diproses in toto. Jika pewarnaan ingin
dilakukan in toto, sebaiknya jaringan langsung dipindah ke alkohol 35% setelah fiksasi.
19. larutan Kolmer
Kalium dikromat 1,8 g
Uranil asetat 0,75 g
Formalin komersial 3,6 ml
Asam asetat glasial 9,0 ml
Asam trikloroasetat 4,8 ml
Akuades 87 ml
Pada awalnya fiksatif ini dikembangkan untuk memfiksasi jaringan mata secara utuh,
tetapi larutan ini juga ternyata memberi hasil yang sangat memuaskan jika digunakan untuk
pengamatan struktur saraf. Karena itu garam uranium telah digunakan secara luas dalam
fiksatif yang ditujukan untuk mempelajari sistem saraf pusat secara khusus tetapi formula
khusus ini dapat pula digunakan untuk keperluan yang lebih umum. Fiksasi dengan
menggunakan bahanini harus dilakukan selama satu malam dan jaringan harus dicuci dengan
air ledeng mengalir setelah fiksasi.
20. Larutan Petrunkewitsch
Larutan A :
Asam nitrat 12 ml
Nitrat dari cuprum 8g
Akuades 100 ml
Larutan B :
Phenol 4g
Etil eter 6g
Etanol 80 % 100 ml
Pada saat akan digunakan campurkan satu bagian larutan A dengan 3 bagian larutan
Fiksatif ini memberi hasil yang sama baiknya dengan larutan Gilson. Fiksasi jaringan antara 2
3 hari, jangan lebih karena bisa merusak jaringan, setelah fiksasi cuci jaringan dengan
etanol 70%.
Proses fiksasi jaringan- Beberapa pertimbangan
Berbagai pertimbangan yang harus di perhatikan ketika harus melakukan fiksasi
jaringan:
Pertimbangan pertama dalam pemilihan fiksasi adalah tujuan pengamatan yang akan
dicapai dalam pembuatan preparat histologi. Apakah tujuan dicapai secara memadai hanya
dengan menggunakan fiksasi umum (all-purpose fixative) atau harus menggunakan fiksasi
khusus? Biasanya fiksasi yang dilarutkan didalam air akn melarutkan glikogen sementara
yang dilarutkan dalam alkohol akan menghilangkan lipida jaringan.
 Pertimbangan kedua adalah tentang efek pengerasan jaringan yang ditimbulkan oleh
fiksasi. Suatu fiksasi yang menimbulkan efek pengerasan berlebih akan menimbulkan
masalah dengan jaringan hati dan otot, dan sebaliknya, suatu fiksasi yang memiliki semua
sifat khusus yang diinginkan tetapi tidak bisa mengeraskan jaringan harus dihindarkan
pemakaiannya.Pertimbangan yang ketiga adalah menyangkut volume fiksatif.
Maserasi Perlakuan Khusus untuk Jaringan Padat
Kadang kadang, untuk jaringan tertentu yang benar benar padat, fiksasi tidak bisa
segera dilakukan jika jaringan masih segar, perlu perlakuan khusus terlebih dahulu.
Contohnya dari jarngan padat ini mungkin perlu dipoisahkan terlebih dahulu serabut otot atau
saraf atau jaringan lain. Perlakuan khusus ini disebut miserasi. Perlakuan ini biasanya
dilakukan dengan cara merendam jaringan dengan larutan tertentu dan larutan ini disebut
miserasi.
Beberapa larutan yang sering ddipakai untuk keperluan miserasi
1. Alkohol 30% : 24 jam atau lebih (sampai 4 hari)
2. Formalin (1 bagian) dalam larutan garam NaCl 10% (100 bagian) : 24 jam atau lebih
3. NaCl 1% : 24 jam atau lebih atau lebih
4. Asam kromat 0.2% (aqueous) : 24 jam
5. Asam nitrat 20% (aqueous), sangat disarankan untuk isolasi otot halus yang terdapat pada
kantung kemih
6. Asam borat (larutan jenuh dalam salin atau air laut untuk cacing laut) ditambah 2 tetes
larutan yodium Lugol untuk setiap 25 ml larutan : 2 3 hari
7. Kalium hidroksida 33% (aqueous), sangat baik untuk mengisolasi otot rangka dan otot halus.
Setelah direndam selama 1 1.5 jam, pisah pisah jaringan dengan jarum
8. Asam osmat 0,01% dapat mendisosiasi dan sekaligus memfiksasi serabut otot dalam
beberapa hari. Penambahan asam asetat 1% kedala l;arutan akan mempercepat disosiasi dan
fiksasi. Rendam hanya potongan jaringan kecil
9. Maserasi dengan enzim. Sangat baik untuk jaringan ikat, retikulum dan lain lain.
Masukkan sayatan beku jaringan ikat kedalam larutan berikut :
a. Pancreatin siccum 5,0 g
b. Natrium bikarbonat 10,0 g
c. Akuades 100,0 g
Langsung cuci dan diwarnai.

Fiksasi dengan Cara Perfusi

Fiksasi dengan cara perfusi yaitu dilakukan dengan cara memaksa masuk fiksatif
kedalam jaringan dengan alat tertentu. Perfusi dapat dilakukan dengan baik pada hewan yang
sudah mati maupun pada hewan masih hidup tetapi sudah berada dibawah pengaruh bahan
anestesi. Cara perfusi ini sangat bermanfaat pada jaringan atau organ tertentu yang
membutuhkan fiksasi sesegera mungkin tetapi tidak dapat dikoleksi dengan cepat, contoh
utamanya adalah sistem saraf pusat. Namu kebanyakan organ tidak dapat terfiksasi secara
memadai hanya dengan metode perfusi karena cairan perfusi biasanya mengalalir keluar dari
dalam sel selama proses pemompaan. Peralatan utama yang digunakan adalah kanula gelas
dengan ukuran sesuai dengan diameter aorta yang akan digunakan, dan beberapa selang karet
yang berfungsi untuk menghubungkan kanula dan botol perfusi.

Cara melakukan perfusi

Setelah hewan dibius, potong pembuluh darah disekitar leher. Dedahkan jantung
dengan cara memotong bagian kartilago rusuk yang diikuti dengan mengangkat sternum.
Setelah itu syat bagian perikardium dan lipat ke bagian belakang hingga arteri arteri besar
terlihat dengan jelas. Bersihkan aorta dari jaringan lain yang melekat dan buat ikatan
dibelakangnya. Buat satu celah kecil pada dinding aorta ( mengarah ke posterior ) dan dengan
hati hati selipkan sebuah kanula yang sebelumnya telah dibasahi. Buka atrium kanan
sehingga darah dan cairan lain dapat mengalir keluar.
Sebelum fiksatilf diperfusi ada baiknya diawali dengan injeksi larutan salin (50 100
ml) untuk mengeluarkan residu darah yang masih menenpel pada dinding pembuluh darah.
Jika fiksatif yang akan digunakan adalah formalin dikromat subtitusi kalium dikromat 2,5%
dengan salin normal. Isi botol perfusi dengan fiksatif (500 1000 ml, tergantung ukuran
tubuh hewan), yang telah dihangatkan setara dengan suhu tubuh. Letakkan botol perfusi
selevel dengan permukaan meja, buka keran yang terdapat pada selang karet kemudian botol
perfusi secara perlahan sampai mencapai ketinggian 4 5 kaki pada ketinggian mana akan
timbul tekanan yang memadai untuk memaksa darah keluar. Setelah 5 menit, buak abdomen
dan amati organ yang ingin diferfusi. Jika pembuluh darah pada permukaan organ masih
berisi darah dan organ belum berubah warna maka ada kemungkinan bahwa perfusi tidak
berhasil.

Pada garis besarnya berdasarkan komposisi bahannya suatu fiksatif dapat dikelompok kan
menjadi Fiksatif tunggal. Hanya menggunakan satu bahan kimia umum dalam bentuk larutan
Contoh: formalin ,alcohol ,asam asetat dan asam pikrat. Umumnya kurang memenuhi
persyaratan sebagai fiksatif yang baik, terutama bagi tujuan mikroteknik. Masih umum
digunakan untuk tujuan anatomi maupun histopatologi terutama fiksatif formalin.

Fiksatif majemuk
Umumnya berupa campuran dari beberapa fiksatif tunggal Disusun dengan formula agar
dapat diperoleh sesuai keinginan dan tujuan.biasanya fiksatif campuran ini dituliskan sesuai
dengan nama penemu formulanya Banyak sekali fiksatif campuran yang ada,

contoh : larutan Bouin,larutan FAA, larutan glison, dan lain sebagainya

Fiksatif berfungsi untuk menghentikan metabolisme secara cepat, mengawetkan

komponen sitologis dan histologis, memperkeras tekstur yang rapuh, dan mewarnai jaringan
sehingga bagian-bagiannya dapat diketahui. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi adalah
buffer (pH), suhu yang rendah, ketebalan irisan, perubahan volume,osmolalitas pada larutan
fiksatif, konsentrasi, dan waktu fiksasi.Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam
jaringan. Bahan yangdigunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air.
Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai
dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96%dan
alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali.Metode paraffin
merupakan cara dalam pembuatan sediaan denganmenggunakan paraffin sebagai
mediaembedding (penanaman).