LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKULAR

Ekstraksi DNA, Reaksi Berantai Polimerase PCR

dan Electroforesis

Oleh :
Ayu Wulan Sari
(201138015)

PROGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PAPUA
MANOKWARI
2013
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan protein
histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari
DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA.
DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang
terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA
plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal.
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA terdapat
di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di antara ketiga lokasi
DNA ini, yaitu: DNA nukleus berbentuk linear dan berhubungan sangat erat
dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berhubungan dengan protein histon.
DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung komponen-
komponen gula pentosa, gugus fosfat, dan pasangan basa nitrogen. Satu sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada
keturunannya.
Langkah pertama untuk mendapatkan DNA baik untuk kepentingan rekayasa
genetika, forensik maupun molekular lainnya tahap awal yang akan dilakukan
yaitu ekstraksi DNA, Reaksi Berantai Polimerase dan Electroforesis yang akan di
praktekkan pada praktikum kali ini.

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan praktikum biomolekular kali ini yaitu :
1. Mempelajari bagaimana mengekstraksi DNA
2. Mempelajari bagaimana proses ekstraksi DNA
3. Mempelajari bagaimana mengampiifikasi fragmen DNA.
4. Mempelajari bagaimana kerja PCR.
5. Mempelajari bagaimana melakukan analisis dengan gel agarosa dan
poliakrilamida
6. Mempelajari bagaimana kerja elektorofresis gel agarosa dan bagaimana
menentukan ukuran fragmen DNA.
7. Mempelajari bagaimana Electroforesis gel poliakrilamida bekerja.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA adalah prosedur umum memisahkan dan mengumpulkan
DNA untuk analisis rekayasa genetika, forensik, bioinformatika, komputasi,
analisis asal-usul dan antropologi. Ada beberapa teknik ekstraksi yang umum
digunakan dalam DNA teknologi termasuk teknik Chelex. Teknik ini
dikembangkan tahun 1991 dan hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR.
Meskipun memiliki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan
efektif untuk ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA
karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan
menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks
PCR. Metode ini menjamin untuk menghasilkan sampel kecil sehingga disarankan
untuk semua sampel yang diuji dengan berbagai ukuran dan volume sampel.
Prinsip dasar Ekstraksi DNA adalah mengeluarkan DNA dari set. Teknik yang
biasa digunakan adalah teknik Chelex umumnya tekik ini mengeluarkan DNA
untai tunggal menggunakan prosedur penambahan suspensi "resin-chela" secara
langsung untuk spesimen (darah, noda darah, semen sebagai contoh) kemudian
melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen, magnesium. Dalam
tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya.

2.1.1 Tahap Ekstraksi DNA

Ada beberapa tahap dasar dalam ekstraksi DNA, yang rinciannya dapat
berbeda tergantung jenis sampel dan senyawa yang mempengaruhi ekstraksi dan
analisis lanjut. Berikut ini tahap-tahapnya yaitu:
- Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan
lipid membran dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan
vorteks dengan fenol (kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk
memecahkan protein dinding sel.
- Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui
penambahan protease dalam presipitasi dengan garam atau asetat
ammonium, atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-ktoroform.
 - Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di
dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam.
- Cuci pelet DNA dengan alkohol taq dan sentrifugasi untuk mendapatkan
kembali peletnya.
- Melarutkan DNA dalam buffer alkalin

Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memanaskan sejumlah

jaringan dalam larutan Chelex. Pemanasan tersebut membantu memecahkan sel
dan mendenaturasi protein. Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah
sampel dari kontaminan.

2.2 Reaksi Berantai Polimerase PCR

Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah teknik in vitro yang dapat
mengampiifikasi bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA
yang telah diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler
untuk isolasi dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran
DNA melalui replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti
E.coli atau ragi). Karena PCR merupakan teknik in vitro, teknik ini dapat
digunakan tanpa memotong DNA dan dapat dimodifikasi secara ekstensif untuk
mengikuti aturan luas manipulasi genetik.
PCR ditemukan oleh Kary Muilis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum
yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai
keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan, identifikasi
sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas), deteksi
dan diagnosis penyakit infeksi dan pembentukan organisme transgenik. PCR juga
digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi, ekologi,
biologi perkembangan, dan genetika.
Keuntungan menggunakan PCR adalah (1) deteksi dan identifikasi
mikroorganisme secara cepat pada frekuensi yang sangat rendah, mikroorganisme
simbiotik, dan individu ikan dan larva avertebrata; (2) analisis cepat genom
individu untuk mempelajari populasi; (3) deteksi dan analisis "kejadian langka"
yang terjadi pada fraksi sel kecil dalam sampel jaringan atau koleksi lapangan;
dan (4) menduga kualitas air melalui deteksi virus, bakteri, dan/atau parasit
pathogen. Keuntungan lain PCR adalah mengurangi keperluan kultur yang sering
ditemukan untuk spesies atau jenis mikroba yang tidak dapat dikultur untuk
kepentingan ekologi atau biogeokimia.

2.2.1 Prinsip Dasar PCR

PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen tunggal, bagian gen, atau
urutan non-kode DNA. PCR akan membuat sekitar 40 milyar salinan dan DNA
cetakan. Kebanyakan metode PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA sampai
10 kilo pasang basa (kb), meskipun beberapa teknik dapat mengamplifikasi
fragmen berukuran sampai 40 kb. PCR biasanya terdiri atas 20 sampai 35 siklus.
Kebanyakan PCR dilakukan dalam tiga tahap, yang didahului satu suhu tetap
untuk awal dan diikuti satu suhu lagi untuk akhir. Tahap-tahap tersebut yaittu:
1. Tahap Inisiasi. Sebelum tahap inisiasi reaksi PCR sering dipanaskan pada
suhu 94-96C (atau 98C jika menggunakan polimerase termostabil),
selama 1-9 menit. Ini berguna untuk menjamin banyak cetakan DNA dan
primer terdenaturasi yaitu putusnya ikatan hidrogen basa-basa komplemen
rantai DNA untuk menghasilkan rantai tunggal DNA. Beberapa
polimerase PCR juga membutukan kondisi tahap ini untuk aktivasi (PCR
awal-panas). Setelah itu, mulai siklus dengan tahap satu pada 94-98C
selama 20-30 detik (tahap denaturasi).
2. Tahap annealing. Dalam tahap ini suhu diturunkan sehingga primer
dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal. Gerakan Brownian
menyebabkan primer bergerak di ikatan hidrogen DNA - DNA yang
secara konstan dibentuk dan diputuskan antara dan cetakan. Ikatan stabil
hanya terbentuk bila urutan primer sangat dengan urutan cetakan. Bagian
pendek rantai ganda ini dikatalisis oleh polimerase untuk memulai sintesis
DNA. pada tahap ini bergantung pada suhu primer dan biasanya antara 50-
64 C selama 20-40 detik.
3. Tahap ekstensi/pemanjangan yaitu polimerase memperpanjang rantai
DNA yang komplemen dengan rantai cetakan. Suhu pada tahap ini
bergantung pada DNA polimerase yang digunakan. Polimerase Taq
mempunyai suhu optimum 70-74C. Umumnya reaksi ini menggunakan
 suhu 72C. DNA polimerase melakukan kondensasi 5'- fosfat dNTP
dengan gugus 5'- hidroksil ujung awal rantai DNA yang komplemen
dengan cetakan dalam arah 5' ke 3'. Pemanjangan bergantung pada
DNA polimerase dan panjang bagian DNA akan diamplifikasi. Tahap
elongasi akhir selama 5-15 menit (tergantung panjang cetakan DNA)
setelah siklus terakhir digunakan untuk menjamin DNA rantai tunggal
sisa diperpanjang seluruhnya. Akhimya jaga suhu 4-15C selama waktu
terbatas untuk penyimpanan singkat seiama reaksi misalnya jika reaksi
dikerjakan semalam.

2.3 Electroforesis

Electroforesis adalah teknik laboratorium untuk memisahkan molekul

bermuatan. "Gel" merujuk pada matriks yang digunakan untuk memisahkan
molekulnya. Gel Electroforesis digunakan dalam forensik, biologi molekuler,
genetika, mikrobiologi dan biokimia. Electroforesis gel memisahkan asam
deoksiribonukleat, asam ribonukleat, dan protein melalui muatan listrik. Metode
ini biasanya digunakan untuk tujuan analitik, tetapi dapat digunakan sebagai
teknik preparasi untuk memurnikan molekul sebelum menggunakan metode lain
untuk karakterisasi lanjut seperti spektrometri massa, PCR, kloning, pengurutan
DNA, atau imunobloting.
Prinsip Dasar Electroforesis berhubungan dengan gaya gerak Iistrik yang
digunakan untuk mendorong atau menarik molekul melalui matriks gel. Molekul
bermuatan yang ditempatkan di dalam "sumur" gel dan dialiri arus listrik akan
bergerak melalui matriks dengan kecepatan berbeda, menuju anoda jika
bermuatan negatif atau menuju katoda jika bermuatan positif (catatan bahwa
Electroforesis gel bekerja sebagai sel listrik; anoda bermuatan positif dan katoda
bermuatan negative).
 BAB III
METODE

3.1 Waktu dan Tempat

- Waktu : pukul 10.20- 12.30 WIT
- Tanggal : 3, 5 dan 6 Desember 2013.
- Tempat : Laboratorium Bioteknologi, Universitas Negeri Papua.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Ekstraksi DNA : Bahan :

1. Mikro tube & Box sampel 1. Alkohol 96%

2. Pinset 2. Sampel Udang Galah
3. Lampu Bunsen 3. Kertas label
4. Gelas piala 4. Lembar kerja Chelex
5. Cawan petri 5. Larutan Cheelex 10%
6. Freezer 6. ddH2O
7. Alat tulis & buku 7. Tisyu
8. Kamera 8. Sarung tangan
9. Vortex shaker
10. Block pemanas
11. Spiner

3.2.2 Alat PCR : Bahan :

1. Mesin PCR 1. ddH2O : 14.3 l

2. Mikropipet & tip berbagai 2. MgCl2 : 2.0 l
ukuran (0,5-10 l, 10-100l, 3. Primer 1 10mm : 1.25 l
100-1000 l) 4. Primer 2 10mm : 1.25 l
3. Mikro tube & Box sampel 5. Enzim Amplitag : 0.125 l
4. Alat tulis dan buku 6. Sampel DNA template
5. Kamera 7. Tisyu
8. Sarung tangan

3.2.3 Alat Electroforesis : Bahan :

1. Termo scienific 1. Agarose

2. Sisir agarose 2. Buffer
3. Mikropipet & tip 3. PCR Produk/ sampel DNA
4. Mesin electroforesis 4. Parafilm
5. Uv Transluminator 5. Leader (One KB)
 6. Timbangan analitik 6. Pewarna (loading die)
7. Kotak gel dan sisir 7. Tisyu
8. Labu erlenmeyer 8. Sarung tangan
9. Gelas ukur 9. Masker
10. Microwave
11. Kamera
12. Alat tulis dan buku

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Cara Kerja Ekstraksi DNA
1. Isilah lembar kerja chelex yang sudah disediakan sesuai petunjuk.
2. Ambillah tabung yang berisi 300 l chelex 10% dari lemari pendingin.
Setiap sampel menggunakan satu tabung chelex, ditambah satu tabung
untuk kontrol. Gunakan sarung tangan dan ambillah larutan chelex
sesuai kebutuhan.
3. Tandai setiap tabung yang berisi chelex menggunakan drawing pen
pada sisi atas dan samping, sesuai dengan ID daftar sampel dalam
lembar kerja chelex dan tanggal.
4. Tuangkan alkohol 96% kedalam gelas piala untuk merendam pinset
yang akan digunakan untuk mengambil sampel. Angkat dan panaskan
di atas lampu bunsen. Lakukan hal sama sebanyak 3-4 x.
5. Setelah itu ambil sampel udang galah sebesar titik (sekecil mungkin)
pada bagia dagingnya. Kemudian masukkkan kedalam tabung yang
berisi chelex.
6. Hidupkan heating block atur suhunya hingga 95C. Dan masukkan
sampel DNA kedalam heating block selama 30 menit.
7. Angkat sampel DNA kemudian masukkan kedalam mesin Vortex
selama 15 detik tujuannya untuk menghomogenkan zat yang belum
tercambur rata.
8. Setelah di vortex sampel kemudian di Spin selama 10 detik. Angkat
dan bandingkan dengan hasil awal. Maka akan terdapat supernatan dan
chelex yang terpisah pada mikrotube.
3.3.2 Cara Kerja PCR
1. Keluarkan reagen: Air, dNTP, buffer PCR, MgCl2, Primer 1, dan
Primer 2 dari freezer agar mencair.
2. Isi lembar kerja PCR dengan tanggal, jumlah sampel, tipe ekstraksi,
dan catatan lain.
3. Gandakan volume dari protokol baku dengan ID, Tanggal bekerja,
Primer (dimana ID (Identitas peneliti) + Tanggal bekerja + Primer +
kontrol positif PCR + kontrol negatif Chelex).
4. Tandai dan nomori tabung PCR dalam rack. Atur sampel sehingga
berada dalam pola yang berhubungan dengan tabung PCR yang
ditandai. Atur tabung ekstra untuk kontrol.
5. Setelah bahan cair, jentikkan setiap tabung dengan jari untuk
mencampur, kocok isi hingga dasar tabung. Bila reagen hampir habis,
sentriguasi tabung untuk mendapatkan cairan sisa.
6. Buat Campuran Master Mix (MM) 1 gunakan mikropipet DNA,
tambahkan bahan sesuai dengan volume yang telah dihitung dalam
daftar di lembar PCR di tabung 1.5 ml. Gunakan tip berbeda untuk
setiap penambahan reagen untuk menjaga agar tidak kontaminan. Pipet
naik dan turun untuk mencampur reagen sepenuhnya.
7. Gunakan mikropipet DNA, buat Campuran Master Mix (MM) 1 dalam
tabung 1.5 mL terpisah, tetapi jangan tambahkan Taq. Gunakan tip
berbeda untuk setiap penambahan reagen. Pipet naik turun untuk
mencampur reagen sepenuhnya.
8. Gunakan mikropipet DNA, bagi 14 l (MM) 2 ke dalam setiap tabung
PCR. Gunakan tip sama seluruhnya. Pipet ke dasar tabung dan untuk
menghindari gelembung pipet agak jauh dari dasar tabung.
9. Pindahkan DNA ekstrak Chelex dari ruang pendingin dan jika
sentrifugasi singkat untuk menghilangkan kondensasi dan/atau
konsentrat butiran chelex. Gunakan pipet DNA rendah, tambahkan 1
pipet DNA ekstrak untuk setiap tabung. Sampel-sampel ini termasuk
DNA ekstrak, kontrol positif PCR dan control negative Chelex. Ambil
dari atas setiap ekstrak Chelex karena tambahan butiran Chelex akan
menghambat Ganti tip untuk setiap sampel.
 10. Ambil enzim Taq dan dengan hati-hati tambahkan Taq ke MM 2. Pipet
naik turun untuk mencampur.
11. Pindahkan tabung-tabung PCR sebelum memulai merunning PCR
kemudian tambahkan MM 2 ke setiap tabung sampel dan gunakan tip
yang berbeda pada setiap sampel.
12. Pilih dan mulai program PCR, setelah mesin PCR mulai membaca
tinggalkan mesin dan tunggu hingga prosesnya selesai.
13. Setelah selesai, simpan sampel pada lemari pendingin.

3.3.3 Cara Kerja Electroforesis

- Cara pembuatan Gel agarose 2 %
1. Timbang agarose sebanyak 0,8 gram dan masukkan kedalam
erlenmeyer.
2. Ukur larutan buffer sebanyak 40 ml dan tambahkan kedalam
erlenmeyer.
3. Masukkan ke dalam microwave dan tunggu hingga larutan berubah
menjadi jernih.
4. Setelah larutan menjadi jernih tuang larutan tersebut kedalam tangki
Electroforesis dan masukkan cetakan sisirnya. Tunggu hingga agar
mengeras.
5. Setelah agar mengeras, pindahkan kedalam tangki Electroforesis
khusus media Buffer, biarkan agar terendam air.
- Cara electroforesis
1. Secara perlahan-lahan tuang pewarna biru (loading die) diatas
parafilm sebanyak jumlah sampel. Ambil sampel satu-persatu dan
mix sampel DNA yang telah di PCR dengan pewarna.
2. Masukkan kedalam sumur/lubang sisir secara bergantian hingga
selesai. Selalu gunakan tip yang baru.
3. Pada ujung bagian depan, tmbahkan leader One KB sebangai penanda.
4. Tunggu running electroforesis selama 30 menit dengan kekuatan 200
volt dan kecepatan 72 ampere.
5. Setelah sampel selesai di running, masukkan gel kedalam larutan EtBr
selama 15 menit. Hati-hatilah dan gunakan sarung tangan yang tebal
saat ingin mencelupkan gel kedalam EtBr karena larutan tersebut
merupakan zat beracun dan karsinogenik.
6. Bilas kedalam air dan tunggu selama 10 menit.
7. Ambil gel dari rendaman air dan letakkan gel di atas UV
Transluminator untuk melihat hasil electroforesis apakah ben dari
sampel DNAnya terlihat/ tidak.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.2 Hasil Ekstraksi DNA
Sampel
Hasil Ekstraksi DNA
Code UGMK (02, 03, 04 & 07)

Supernatan

Chelex

Udang Galah asal Merauke

4.1.3 Hasil PCR

Gambar Keterangan
Sampel yang telah diberi reagen MM1
kemudian dimasukkan kedalam mesin
PCR. Setelah itu ditambahkan reagen
MM2. Kemudian di running sesuai
prosedur.

Setelah keluar dari mesin PCR

4.1.4 Hasil Electroforesis

Gambar Hasil pengamatan

Setelah dibuat agarose dan
memasukkan sampel DNA
kedalam lubang-lubang yang telah
dbuat, ternyata sampel DNA yang
diinginkan belum terbaca. Dapat
dilihat pada gambar disamping
bahwa yang tapak hanyalah
ben/pita dari Leader One KB saja
sedangkan pada sampel DNA tidak
tampak pitanya. Dengan kata lain
hasil ekstraksi DNA pada
praktikum kali ini GAGAL.
 Dilihat menggunakan sinar UV
Perbandingan hasil electroforesis
yang telah dibuat sebelumnya
sangat berbeda dengan hasil
praktikum, dapat dilihat pada
700 pb gambar disamping bahwa ben/pita
terlihat sangat jelas pada agarose,
dan dapat dihitung bahwa pita
tersebut berada pada urutan ke 7
100 pb
yang berarti 700pb.
Dilihat menggunakan sinar UV

4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini tahap pertama yang dilakukan yaitu Ekstraksi
DNA, tahap ini dimulai dengan mengisi lembar kerja chelex, preparasi alat dan
bahan antara lain, dalam bekerja di Laboratorium Bioteknologi, semua praktikan
diwajibkan memakan sarung tangan, tujuannnya agar melindungi diri dari zat-zat
berbahaya dan juga sebagai syarat utama agar semua yang akan kita kerjakan
selalu aseptis, setelah memakai sarung tangan kita dapat menyiapkan chelex dan
ddH2O dan memasukkannya kedalam tabung mikrotube dan sedikit chelex
kemudian mencampurnya kedalam mikrotube. Sampel yang akan kita pakai untuk
ekstraksi DNA yaitu sampel Udang Galah asal Merauke, oleh karena itu kode
untuk tabung di tuliskan UGMK dan nomor dari sampel udang tersebut contoh
(UGMK 03). Sesudah memberi ID dan Tanggal praktikum, kita dapat merendam
pinset kedalam alkohol 96% yang akan digunaan untuk mengambil sampel udang,
tujuan perendaman yaitu untuk mensterilkan pinset agar saat bekerja tidak terjadi
kontaminan dan menyebabkan DNA tidak terbaca. Hal ini sangat penting karena
untuk ke tahap selanjutnya, langkah dasar yang paling utama adalah menjaga agar
setiap alat yang akan kita gunakan steril. Setelah memastikan pinset yang akan
kita gunakan telah terendam alkohol dan telah dipanaskan dibunsen, kita dapat
mengeluarkan sampel dari botolnya dan meletakkan diatas cawan petri, kemudian
mengambil sampel udang sebesar titik di bagian dagingnya, sampel dapat
langsung dimasukkan kedalam mikrotube begitu seterusnya hingga sampel Udang
habis. Sesudah mengambil daging udang, langkah selanjutnya yaitu memasukkan
sampel kedalam hot block suhu diatur 94C selama 30 menit, tujuan sampel
dipanaskan yaitu agar membantu memecahkan sel dan mendenaturasi protein serta
mengaktifkan beberapa enzim yang hanya akan aktif jika dengan suhu yang
panas. Dengan begitu DNA dapat memisah dengan reagen chelex. Setelah di
panaskan hingga 30 menit, sampel dapat di vortex selama 15 detik dan di shaker
selama 10 detik, tujuannya yaitu mencegah adannya gelembung pada sampel dan
mengembalikan pelet. Sampel yang telah diekstraksi dapat dilihat hasilnya terlihat
bahwa chelex berada dibawah dan supernatan/ DNA berada di atas. Mengapa
dapat terjadi 2 pemisahan? Karena chelex merupakan reagen yang membantu
DNA terdenaturasi sehingga dapat melisis dan terpisah dari substratnya. Hasilnya
yaitu supernatan/ DNA yang akan diambil untuk tahap selanjutnya yaitu
Polimerase Chain Reaction/ Reaksi Berantai Polimerase (PCR). Supernatan
berada diatas karena berat molekul DNA yang lebih ringan dibandingkan dengan
chelex.
Adapun prinsip dasar dari Ekstraksi DNA yaitu:
- Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan
lipid membran dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan
vorteks dengan fenol (kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk
memecahkan protein dinding sel.
- Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui
penambahan protease dalam presipitasi dengan garam atau asetat
ammonium, atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-ktoroform.
- Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di
dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam.
Memisahkan DNA dari set, biasannya menggunakan teknik chelex. Teknik ini
telah dikembangkan sejak tahun 1991 sebagai langkah awal untuk tahap PCR,
teknik chelex dikenal lebih cepat, efektif dan murah Metode chelex disarankan
untuk preparasi DNA karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer
dan Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah sampel dari
kontaminan.
Tahap kedua yaitu Reaksi Berantai Polimerase (PCR) Proses PCR merupakan
proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh
enzim DNA polimerase. Enzim ini tahan sampai temperature mendidih 100C,
dan aktifitas maksimal pada temperatur 70-72C. Dasar siklus PCR yang utama
merupakan siklus berulang 30-35 siklus meliputi:
a) Denaturation; suhu yang dibutuhkan adalah (95C) pada suhu ini akan
terjadi denaturasi yaitu terputusnya ikatan hidrogen basa-basa komplemen
rantai DNA pada dua untai DNA template menjadi untai DNA tunggal.
Dalam siklus ini dibutuhkan waktu 30 detik.
b) Annealing; pada tahap ini suhunya akan turun menjadi (5560C),
diharapkan primer dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal/
DNA template, suhu annealing ditentukan oleh susunan primer.
Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting
Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Waktu yang
dibutuhkan 30- 40 detik.
c) Extension/ pemanjangan; suhu yang dibutuhkan antara (72C), pada tahap
ini DNA polimerase melakukan kondensasi 5'- fosfat dNTP dengan gugus
5'- hidroksil ujung awal rantai DNA yang komplemen dengan cetakan
dalam arah 5' ke 3'. waktu yang dibutuhkan tergantung dari panjang atau
pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi.
Dibawah ini merupakan gambar siklus PCR
Keteragan :
A : tahap Denaturasi, suhunya akan naik 94-95C.
B : tahap Anneling, suhunya akan turun pada 50C
C : tahap Ekstensi, suhunya akan naik lagi menjadai 72C
D : siklusnya di ulang sebanyak 38 x

D
 Tahap terakhir yaitu Electroforesis, Electroforesis adalah teknik
laboratorium untuk memisahkan molekul bermuatan. "Gel" merujuk pada matriks
yang digunakan untuk memisahkan molekulnya. Electroforesis gel memisahkan
asam deoksiribonukleat, asam ribonukleat, dan protein melalui muatan listrik.
Pada tahap ini langkah pertama yang dilakukan yaitu membuat cetakan DNA
template dari Agarose. Komposisi cetakan yaitu Agarose/ agar sebanyak 0,8 gram
dan buffer/ larutan penyangga sebanyak 40 ml. Semua komponen dicampur jadi
satu kedalam erlenmeyer dan dipanaskan kedalam microwave hingga warnanya
yang putih berubah menjadi jernih. Setelah terjadi perubahan warna agarose dapat
dituang kedalam tangki electroforesis dan dipasang sisir cetakan DNA template.
Tunggu selama 15-30 menit hingga agar mengeras, angkat sisir cetakan dan DNA
template hasil running PCR dapat di masukkan kedalam sumur-sumur. Sebelum
dimasukkan kedalam tiap-tiap sumur, mix DNA template di atas kertas parafilm
dengan pewarna Loading die agar tampak jelas terbaca ketika di masukkan
kedalam mesin electroforesis, dalam mengerjakan hal ini perlu diperhatikan
kecermatan dalam mengemix pewarna dan DNA template, mengganti tip dan
dalam mengambil DNA template agar tidak salah. Setelah semua sampel DNA
dimasukkan kedalam sumur, langkah terakhir yaitu memasukkan Leader One KB
pada depan sumur sebagai penanda.
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
bermigrasinya molekul. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada
tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang dipakai dalam
elektroforesis kali ini yaitu gel. Gel ada yang bermacam-macam ada yang dapat
berupa pati, agarose ataupun poliakrilamid. Namun yang kita pakai dalam
electroforesis kali ini adalah agarose. Matriks agarose berfungsi untuk
memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer agar muatan
protein tidak berubah.
Setelah preparasi agarose selesai, Mesin electroforesis dapat dinyalakan
dengan tegangan 200 Volt dengan kecepatan 72 Ampere selama 30 menit. Pada
saat proses elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda
negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel agarose
tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka
semakin jauh pula protein bergerak dengan kata lain mobilitisnya tinggi.
Sebaliknya, protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak
yang lebih pendek dengan kata lain mobilitisnya rendah. Berbagai jenis
protein pada suatu sampel akan terseparasi (terpisah-pisah) pada gel agarose
tergantung pada mobilitasnya. Protein dengan mobilitas tinggi akan berhenti
bergerak pada bagian yang lebih bawah gel, sedangkan protein dengan mobilitas
rendah cenderung berhenti bergerak pada bagian atas gel. Dengan demikian, pada
jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band
atau pita protein) yang sudah terseparasi berdasarkan berat molekulnya.
Namun dalam praktikum kali ini, band tidak terlihat pada gel penyangga
agarose hal tersebut dikarenakan perbedaan nyata antara pita dipengaruhi oleh
persentase agarose, waktu electroforesis, konsentrasi Etidium bromide, derajat
superkoil dan ukuran serta kompleksitas DNA. Sedangkan pada sampel hasil
electrforesis yang sudah ada, tampak terlihat jelas bahwa band/pita terbaca pada
gel. Bisa di karenakan presentase agarosenya yang tepat, atau menggunakan gel
poliakrilamid yang khusus untuk membaca protein. Dalam praktikum Ekstraksi,
PCR dan Electroforesis memang harus dilakukan secara berulang-ulang agar
mendapatkan hasil yang maksimal, karena keterampilan dalam bekerja
dilaboratorium sangat dibutuhkan dalam mengerjakan sampel DNA.
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam
langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan,
akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara
signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk
ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis
sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam
bergantung pada jenis jaringan (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari
sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak
Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh
Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa
jam.
Electroforesis adalah teknik laboratorium untuk memisahkan molekul
bermuatan. "Gel" merujuk pada matriks yang digunakan untuk memisahkan
molekulnya. Prinsip Dasar Electroforesis berhubungan dengan gaya gerak Iistrik
yang digunakan untuk mendorong atau menarik molekul melalui matriks gel.
Dari hasil praktikum Ekstraksi DNA, PCR dan Electrofresis didapat hasil
yaitu pada gel agarose tidak terbaca band/pitanya, hal tersebut dapat dikarenakan
kurangnya keaseptisan saat bekerja, kurang cermat dalam memberi reagen/enzim
serta dikarenakan perbedaan nyata antara pita dipengaruhi oleh persentase
agarose, waktu electroforesis, konsentrasi Etidium bromide, derajat superkoil dan
ukuran serta kompleksitas DNA.

5.2 Saran
1. Dalam melakukan teknik PCR harus dilakukan dengan sangat hati-hati dan
aseptis agar sampel yang akan di running akan tampak pada saat
electroforesis.
2. Sebaiknya dalam melalukan suatu pekerjaan Ekstraksi, PCR dan
Electroforesis dilakukan dengan serius agar hasil yang didapat
memuaskan.
3. Perlu dilakukan latihan berulang-ulang agar didapat hasil (terbacanya pita
DNA) pada gel agarosa.
 DAFTAR PUSTAKA

Binur, Robbi. 2013. Penuntun Praktikum Biologi Molekular. Jurusan Biologi .

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Negeri
Papua. Manokwari.

Fatchiyah, dkk. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekular.

Jurusan Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Universitas Brawijaya. Malang.