HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi

elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknih ini digunakan oleh para
kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan atau
senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun material biologis. Pada
kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa campuran
dari bahan-bahan terlarut.
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada
HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya
terpisah.
Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography,
HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai
dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan
merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat
berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan
bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram
memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi isokratis
dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau
campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi isokratik.
Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu
sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari
kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan
program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan
secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali meningkatkan
efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC
modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan sehingga dapat memasukkan
cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara
terus menerus.
(Skoog, 2004: 973-977)
Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven
yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai,
yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua persyaratan
di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC yang
menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila
detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan
akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh
tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga
sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh :kolom
berikatan dengan NH2).

(Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)

 Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:
Reservoir (wadah pelarut / cairan)
Pompa
Sistem injeksi sampel
Kolom, terdiri dari
1. Kolom Analitik / Kolom Utama
2. Kolom Guard
3. Termostat
Detektor
Komputer (Pengolah data)

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan digunakan

dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-masing reservoir
dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur
cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.

Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa.

Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa
yang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang reproducible
2) Harus menghasilkan aliran yang pulse-free (bebas pulsa, tidak menghasilkan
gelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil
 (R.P. Budhiraja, 2004: 172)

Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel dapat
diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel
dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat diganti dan tersedia pada volume
0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa gerak
dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari loop
sampling digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.

Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel
dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30
mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel
silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai
tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan
performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material
partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari
itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalah-
masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam
yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5
mm dan harganya satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard
digunakan sebagai tumbal dan diganti secara berkala.

Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektor-
detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:
Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)
Detektor elektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index
refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-
komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.
(Harvey David, 2000: 578-585)

Keuntungan KCKT/HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang
sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau
tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis
laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat
digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik,
antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu
analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat.
Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven
dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat zat
yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi
untuk menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal
sekali untuk mengalissis zat zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena
itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati
detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi
penukarion memerlukan prosedur khusus.
(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)

Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi.
Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah
yang tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
Kolom dapat digunakan kembali.
Waktu analisa cukup singkat.
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.
Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.