Genistein Nanopartikel Lindungi Tikus Sistem hematopoietik dan

Mencegah proinflamasi Faktor setelah Iradiasi Gamma

Cam T. Ha, Xiang-Hong Li, Dadin Fu, Mang Xiao1,2 danMichael R.
Program Penanggulangan RadiasiLandauer1,Angkatan Bersenjata Radiobiologi Penelitian Institute, berseragam
Jasa University of Health Sciences, Bethesda, Maryland 20.889
Ha, CT, Li, XH., Fu, D., Xiao, M. dan Landauer, MR Genistein Nanopartikel Lindungi Tikus Sistem hematopoietik dan
Mencegah proinflamasi Faktor setelah Gamma Irradi- asi. Radiat. Res. 180, 316-325 (2013).
Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa genistein melindungi tikus dari kegagalan sumsum tulang akibat
radiasi. Untuk mengatasi genistein ini kelarutan air yang sangat rendah, suspensi nanopartikel dari genistein telah
dirumuskan selama lebih pembubaran cepat. Dalam studi saat ini, kami mengevaluasi efek tective radiopro- dari
formulasi nanopartikel dari genistein pada kelangsungan hidup dan pemulihan hematopoietik pada tikus terkena
radiasi tubuh gamma total-. Sebuah injeksi intramuskular tunggal dari genistein nanosuspension berbasis saline (150
mg / kg) admin- istered ke CD2F1 tikus 24 jam sebelum 9,25 Gy 60Co paparan radiasi menghasilkan tingkat
kelangsungan hidup 30 hari dari 95% dibandingkan dengan 25% di kendaraan-diperlakukan hewan. Pada tikus
diiradiasi pada 7 Gy, yang genistein nanosuspension meningkat tulang tikus sumsum cellularity dari sekitar 2,9%
(kendaraan diperlakukan) menjadi 28,3% pada hari ke 7 postirradiation. Arus cytometry analisis menunjukkan
penurunan radiasi hematopoietik stem dan sel progenitor (HSPC, Lineage- / ckit +) kematian dari 77,0%
(kendaraan) menjadi 43,9% (genistein nanosuspension) dengan pemulihan yang signifikan dari clonogenicity 7 hari
setelah iradiasi. The genistein nanosuspension juga dilemahkan radiation- diinduksi elevasi faktor proinflamasi
interleukin 1 beta (IL-1b), IL-6 dan cyclooxygenase-2 (COX-2) pada tikus sumsum tulang dan limpa, yang dapat
berkontribusi untuk melindungi HSPCs.
2013 oleh radiasi Research Society
PENDAHULUAN
telah didokumentasikan dengan baik bahwa paparan disengaja atau disengaja untuk radiasi pengion
dapat menyebabkan cedera jaringan dan kematian bagi individu terpapar (1). Misalnya, paparan disengaja
yang terjadi selama terapi radiasi untuk pengobatan kanker dapat mengakibatkan kerusakan jaringan
normal (2, 3). Terorisme radiologi yang melibatkan penyebaran radioaktif
bahandengan serangan terhadap fasilitas nuklir, penggunaan perangkat penyebaran radiasi, atau peledakan
senjata nuklir adalah contoh dari paparan disengaja yang meningkatkan risiko cedera radiasi.
Karena perputaran yang cepat sel hematopoietik ', sumsum tulang adalah salah satu yang paling radiasi-
sensitif jaringan (4). Paparan radiasi merusak sistem hematopoietik, kompromi integritas hematologi, dan
menyebabkan hilangnya sel darah fungsional, yang mengarah ke perdarahan, infeksi dan anemia (5, 6).
Toksisitas sumsum tulang dapat menjadi faktor dosis yang membatasi untuk radioterapi dan APY
radioimmunother- pada pasien kanker, maka melindungi sumsum tulang dari radiasi dapat memungkinkan
dosis radiasi yang lebih tinggi untuk tumor dan mengakibatkan peningkatan secara signifikan efektivitas
dan keamanan pengobatan. Pemeliharaan dan pemulihan stem hematopoietik dan sel-sel progenitor
(HSPCs) tepat adalah penting untuk pemulihan dan kelangsungan hidup organisme mamalia setelah
paparan radiasi. Namun, saat ini tidak ada obat yang disetujui FDA untuk perlindungan terhadap fase
hematopoietik dari sindrom radiasi akut dan mekanisme pengion kegagalan sumsum tulang akibat radiasi
tidak sepenuhnya dipahami.
Genistein (40, 5, 7-trihydroxyflavone), adalah a ditoleransi dengan baik dan alami isoflavon, yang
melindungi tikus dari kegagalan sumsum tulang akibat radiasi (7, 8). Pemberian genistein subkutan (SC)
24 jam sebelum paparan radiasi tikus dilindungi dari dosis mematikan total tubuh c radiasi (TBI) (7, 9).
Genistein memiliki sifat biologis multifungsi termasuk penghambatan protein tyrosine kinase dan MAPK,
regulasi topoisomerase II dan aktivasi reseptor estrogen, dan aktivitas antioksidan (10, 11). Pengobatan
dengan genistein menghambat proliferasi berbagai jenis sel kanker, dan dosis rendah genistein dilindungi
sel-sel normal dari cedera radiasi (12- 14). Efek biologis dan mekanisme radioprotection diinduksi
genistein- memerlukan penyelidikan lebih lanjut.
 Karena genistein ini kelarutan air yang sangat rendah, studi kami sebelumnya telah menggunakan 100% polietilen glikol 400
(PEG 400) sebagai eksipien dalam bukti eksperimen Prinsip 1 Kontribusi dari dua penulis senior setara. 2 Alamat untuk
korespondensi: Ilmiah Departemen Riset, Angkatan Bersenjata Radiobiologi Research Institute, 8901 Wisconsin Ave., Bethesda,
MD 20889-5603; e-mail:. mang.xiao@usuhs.edu
untuk menunjukkan sifat radioprotective genistein ketika subkutan. The Food and Drug Admin-
Administration, bagaimanapun, tidak menyetujui obat untuksistemik
316
administrasiyang melebihi 36% PEG 400 (15). Untuk mengatasi masalah kelarutan miskin, keputusan-
nanopartikel disuspensi telah dirumuskan lebih pembubaran cepat dan meningkatkan bioavailabilitas (16).
Genistein, oleh karena itu, merupakan kandidat yang sangat baik untuk mengembangkan formulasi
nanosuspension yang dapat digunakan untuk intramuskular (IM) injeksi. Karena vaskularisasi di jaringan
otot adalah lebih besar dari jaringan subkutan, obat-obatan yang disampaikan melalui rute IM
administrasi umum diserap lebih cepat dan seragam dibandingkan mereka SC diberikan (17).
Autoinjectors untuk injeksi IM telah dikembangkan untuk kedua sipil (18) dan aplikasi militer (19) dan
akan menjadi modus yang ideal untuk pengiriman sistemik genistein.
Dalam studi saat ini, kami mengevaluasi efek radiasi-pelindung dari formulasi nanopartikel dari
genistein pada kelangsungan hidup dan pada pemulihan hematopoietik pada tikus terkena TBI. Data kami
menunjukkan bahwa menggunakan formulasi nanopartikel dari genistein, injeksi IM tunggal diberikan 24
jam sebelum TBI, peningkatan kelangsungan hidup dan jaringan tikus hematopoietik dilindungi dengan
mempromosikan HSPC pemulihan. Selain itu, kami menemukan bahwa genistein nanosuspension
menghambat produksi faktor inflamasi di sumsum dan limpa sel iradiasi tulang tikus, yang dapat
berkontribusi untuk kelangsungan hidup sel-sel hematopoietik.
BAHAN DAN METODE
Hewan
dua belas sampai 14-minggu-tua tikus CD2F1 laki-laki ( Harlan Laboratories, Indianapolis, iN) yang digunakan dalam
penelitian ini. Semua hewan diaklimatisasi tiba dan hewan perwakilan disaring untuk bukti penyakit. Tikus ditempatkan di
sebuah fasilitas diakreditasi oleh Asosiasi Pengkajian dan Akreditasi Laboratorium Animal Care International. Kamar hewan
yang dipelihara di 21 6 28C dengan 50% 6 10% kelembaban pada 12 h cahaya / siklus gelap. Komersial hewan pengerat chow
(Harlan Teklad Rodent Diet 8604) adalah libitum tersedia iklan sebagai diasamkan air (pH = 2,5) untuk mengendalikan infeksi
oportunistik (20). Semua prosedur penanganan hewan dilakukan sesuai dengan pedoman dari Dewan Riset Nasional (21) dan
telah disetujui oleh Perawatan dan Penggunaan Komite Kelembagaan Animal Angkatan Bersenjata Radiobiologi Research
Institute (AFRRI, Bethesda, MD).
Genistein Persiapan
dosis tunggal a nanosuspension genistein atau kendaraan disuntikkan IM ke dalam otot paha tikus menggunakan 250 lL jarum
suntik (Hamilton, Reno, NV) dengan jarum 25 pengukur melekat, 24 jam sebelum 7 Gy atau 9,25 Gy TBI di fasilitas AFRRI
60Co. Genistein yang diberikan dalam nanosuspension basah-giling mengandung 50 nM fosfat buffered saline dengan 5% PVP-
K17 dan 0,2% Polysorbate 80 (Humanetics Corp, Minneapolis, MN). Ukuran partikel rata-rata nanosuspension itu 0,2 lm. Itu
disimpan dalam botol kaca 5 ml dengan 20 mm polytetrafluoroethylene (PTFE) -faced butil sumbat karet dan disterilkan
menggunakan radiasi gamma.
Iradiasi Prosedur
Mice menerima TBI dalam bidang radiasi gamma bilateral di fasilitas 60Co AFRRI ini. Jaringan garis tengah dosis untuk tikus
itu 9,25 Gy (LD
80/30
dosis untuk tikus yang tidak diobati) untuk studi kelangsungan hidup dan 7 Gy (a
PERLINDUNGAN RADIASI DENGAN genistein NANOPARTIKEL317
dosissubletal) untuk sitokin dan analisis sistem hematopoietik, pada dosis laju 0,6 Gy / menit. The alanin / resonansi spin elektron
(ESR) sistem dosimetri (American Society for Testing dan Material, Standard E 1607) digunakan untuk mengukur laju dosis (air)
di core dari hantu tikus akrilik. Kontrol hewan sham diiradiasi, diperlakukan dengan cara yang sama seperti binatang yang
diradiasi, kecuali sumber 60Co tidak dibangkitkan dari air kolam perisai. Setelah iradiasi, tikus kembali ke kandang rumah
mereka. Hari iradiasi dianggap hari 0
Studi Kelangsungan Hidup
Kami menunjukkan sebelumnya bahwa genistein-diinduksi radioprotection tergantung pada waktu pemberian relatif terhadap
iradiasi dan dosis genistein, dengan 24 jam sebelum iradiasi menjadi optimal (7). Oleh karena itu, waktu ini digunakan untuk
semua percobaan. Sebuah studi kelangsungan hidup 30 hari dilakukan untuk menentukan kemanjuran perumusan nanosuspension
genistein. Penelitian ini terdiri dari empat kelompok eksperimen: kendaraan, 37,5, 50 dan 150 mg / kg genistein nanosuspension
diberikan sebagai injeksi IM tunggal 24 jam sebelum 9,25 iradiasi Gy 60Co (N = 20 / group). Dosis radiasi 9,25 Gy
menggunakan dosimetri 60Co yang sama di Institut kami bertekad sebelumnya menghasilkan 20 survival% untuk tikus CD2F1
laki-laki yang tidak diobati. Sebuah kelompok yang terpisah dari tikus iradiasi tidak diobati, oleh karena itu, tidak dimasukkan
dalam penelitian kelangsungan hidup ini, berdasarkan rekomendasi IACUC.
Studi hematopoietik
Dalam eksperimen terpisah, hematologi dan sitokin analisis dilakukan menggunakan dosis radiasi sublethal (7 Gy 60Co) untuk
memastikan kelangsungan hidup tikus pada hari 1, 7 dan 14 postirradiation untuk panen dari limpa dan sumsum tulang. Dalam
penelitian ini ada enam kelompok perlakuan: diobati; kendaraan; genistein nanosuspension-diperlakukan tikus yang tidak
menerima iradiasi (palsu iradiasi) dan tidak diobati; kendaraan; dan genistein nanosuspension-diperlakukan tikus yang menerima
paparan tunggal dari 7 Gy TBI. Genistein nanosuspension (150 mg) atau kendaraan diberikan IM 24 jam sebelum iradiasi.
Kelompok terpisah tikus digunakan untuk masing-masing tiga titik waktu pada 1, 7, 14 hari setelah iradiasi palsu atau 7 iradiasi
Gy (N = 6 / titik waktu). Hari iradiasi untuk semua percobaan dianggap hari 0
Tikus Bone Marrow myeloid sel Viabilitas dan Lineage Perluasan
tulang sel-sel sumsum dikumpulkan dari femora mouse dan humeri pada hari 1, 7 dan 14 setelah 7 Gy 60Co TBI seperti yang
dijelaskan sebelumnya (22). Setelah eritrosit segaris dengan penyangga (Qiagen GmbH, Hilden, Jerman), jumlah sumsum tulang
viabilitas sel myeloid dari mouse masing-masing diukur dengan tripan pewarnaan biru. Frekuensi subpopulasi apoptosis dan
kematian total sel menggunakan Annexin-V dan 7-amino aktinomisin D (7AAD), masing-masing, ditentukan oleh aliran
cytometry. Tikus keturunan dan c-kit antibodi yang digunakan untuk penentuan fenotipe pada populasi 7AAD-negatif. Semua
antibodi dan pewarna yang dibeli dari BD Biosciences (San Jose, CA). Sampel dianalisis pada FACSCalibur aliran cytometer
(BD Biosciences) dilengkapi dengan 15 mW 488 nm laser yang ion argon berpendingin udara untuk eksitasi FITC, PE, dan
7AAD dan 635 nm dioda laser untuk eksitasi APC. Fenotip dan kelangsungan hidup dianalisis dengan menggunakan software
FlowJo.
Clonogenicity Assay Mouse Bone Marrow
Clonogenicity sel sumsum tulang mencit kuantitatif menilai dalam budaya semipadat standar dalam rangkap tiga dengan
menggunakan 1 ml MethoCulte GF + sistem sel tikus (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) menurut untuk instruksi
pabriknya, seperti yang dijelaskan sebelumnya (22). Secara singkat, sel-sel sumsum tulang yang dikumpulkan dari femora dan
humeri segaris dengan eritrosit lisis penyangga dan dicuci dua kali dengan media Iscove ini dimodifikasi Dulbecco (IMDM).
Sumsum tulang
suspensi sel tunggal dari satu mouse berlapis dalam rangkap tiga di 01-05 Maret 104 sel / hidangan di 35 cm piring kultur sel
(BD Biosciences). Piring mencetak total koloni setelah kultur selama 10 hari di 378C, 5% CO

2.
Histopatologi Mouse Tulang dada Marrow
Tikus Sterna yang tetap di Z-Fix (formaldehida, metanol, terionisasi seng penyangga, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) untuk
setidaknya 24 jam. Sampel didekalsifikasi (Cal-EX selama 3 jam) dan dipotong secara longitudinal diwarnai dengan hematoxylin
dan eosin (H & E). In situ sumsum cellularity tulang myeloid-to-eritroid rasio dan angka megakaryocyte yang diukur dengan
analisis subjektif dari 8-14 berdekatan berdaya rendah (200 4003) bidang mikroskopis untuk setiap sternum dipotong (6 sternebra
per kelompok diperiksa).
imunoblotting mouse bone Marrow dan Limpa Lysate
pada saat ditunjukkan, sel-sel sumsum tulang dari femora dan humeri dikumpulkan, dicuci dengan PBS dan segaris di RIPA
penyangga (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) sebelum menjadi sasaran sonication. Konsentrasi protein ditentukan dengan
menggunakan alat tes BCA kit (Pierce, Rockford, IL). Lisat yang didenaturasi dalam buffer Laemmli dilengkapi dengan DTT
(dithiothreitol) sebelum pemisahan protein SDS-PAGE; dan imunoblotting dilakukan setelah prosedur standar dengan
chemiluminescence kit ditingkatkan (Thermo Scientific, Rockford, IL). Gambar ditangkap oleh kamera CCD dan densitometri
yang dihasilkan dinilai menggunakan software ImageGauge. Protein densitometri adalah dinormalisasi untuk beta-aktin. Antibodi
untuk cyclooxygenase (COX-2) yang dibeli dari Abcam (Cambridge, MA) dan beta-aktin dari Sigma-Aldrich. Limpa individu
yang cincang, homogen, disonikasi di RIPA penyangga (Sigma- Aldrich) yang mengandung koktail proteinase inhibitor dan
disentrifugasi pada 12,000g selama 15 menit. Konsentrasi protein supernatan dikumpulkan ditentukan dengan bicinchoninic uji
protein asam (assay BCA, Pierce). Jumlah yang sama protein dari masing-masing sampel (50 lg) telah dimuat untuk SDS-PAGE
elektroforesis dan immunoblot- ting kemudian.
Pengukuran Limpa Berat
Pada hari 1, 7 dan 14 setelah TBI, para limpa yang dipotong, membebani keseimbangan dengan 0,1 mg diskriminasi, dan
dihapuskan pada handuk kertas. Enam limpa per kelompok ditimbang untuk setiap titik waktu yang ditetapkan.
Sitokin Kuantifikasi
Tikus IL-6 dan IL-1b ELISA kit yang dibeli dari R & D (Minneapolis, MN). Batas deteksi sitokin 3,6 pg / mL dan 1,8 pg / mL
untuk IL-6 dan IL-1b, masing-masing. Tingkat kuantitatif sitokin ini di sel sumsum tulang dan limpa homogenat ditentukan
dengan mengikuti petunjuk tes yang diberikan oleh pabrikan. Secara singkat, sel-sel sumsum tulang setelah pengangkatan
eritrosit, dan limpa dari mencit individu yang homogen dan disonikasi di PBS, diikuti oleh 15 menit dari 12,000g sentrifugasi.
Supernatan dikumpulkan dan sasaran penentuan protein (assay BCA). Supernatan dengan jumlah yang setara dengan protein (500
lg) dari masing-masing sampel dievaluasi dalam rangkap dua. Analisis statistik dilakukan dari sampel kelompok tiga tikus.
Imunofluoresensi Pewarnaan
dipotong Sterna tikus dikumpulkan dari nanosuspension- genistein diobati, kendaraan-diperlakukan dan tidak diobati tikus 24
jam setelah TBI diproses untuk immunostaining. Spesimen diinkubasi dalam memblokir penyangga (5% BSA dalam PBS) dan
diikuti oleh antibodi primer (anti COX-2) dan FITC-terkonjugasi anti-rabbit IgG antibodi kedua. Slide dibilas di tinggi garam
PBS (0,4 M NaCl dalam PBS),
318 HA ET AL.
Gambar. 1. Radioprotection oleh formulasi nanosuspension berbasis garam genistein. Tiga puluh hari kelangsungan hidup tikus
diberikan dengan injeksi IM tunggal kendaraan atau 37,5, 75 atau 150 mg / kg nanosuspension genistein 24 jam sebelum 9,25
iradiasi Gy 60Co (N = 20 / group). Ada peningkatan yang signifikan dalam kelangsungan hidup untuk semua kelompok genistein
diobati bila dibandingkan dengan kendaraan-diperlakukan kelompok kontrol (P, 0,01).
Counterstained untuk DNA dengan 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pemasangan menengah dan penutup tergelincir.
Gambar slide diperiksa dengan mikroskop fluoresensi Zeiss menggunakan MTB2004 konfig dalam perangkat lunak Zeiss
AxioVision.
AnalisisStatistik
Exact test Fisher digunakan untuk analisis data survival. Untuk hematologi dan sitokin data, perbedaan antara sarana
dibandingkan dengan ANOVA dan Student tes t. P, 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Hasil disajikan sebagai berarti 6
standar deviasi atau kesalahan standar dari mean seperti yang ditunjukkan.
HASIL
Kelangsungan Hidup
Tikus yang menerima suntikan IM tunggal 37,5, 75 atau 150 mg / kg formulasi nanosuspension
genistein 24 jam sebelum paparan 9,25 iradiasi Gy memiliki 30 tingkat kelangsungan hidup hari 70, 70
dan 95%, masing-masing (Gambar. 1). Ini dibandingkan dengan tingkat kelangsungan hidup 25% pada
hewan kendaraan-diobati (P, 0,01). Berdasarkan hasil ini, penelitian selanjutnya digunakan dosis 150 mg /
kg dari nanosuspension genistein.
Genistein Nanosuspension Protected Tikus Bone Marrow myeloid Sel dari Radiasi Gamma
Tikus sel sumsum tulang dari femora dan humeri dikumpulkan 1, 7 dan 14 hari setelah sublethal a dosis
7 Gy 60Co TBI. Penilaian viabilitas sel dilakukan dengan pengecualian tripan biru. Gambar 2
menunjukkan kelangsungan hidup diferensial total sel myeloid antara kelompok tikus yang diradiasi.
Kematian sel besar radiasi di sumsum tulang diamati sedini 1 hari dan paling parah di 7 hari setelah
iradiasi. Jumlah sel hidup per
tikus menurun dari 12,12 6 0,69 3 106 (0 Gy, kendaraan) menjadi 2,36 6 0,57 3 106 (7 Gy, kendaraan,
hari 1) dan 0,47 6 0,563106 (7 Gy, kendaraan, hari 7) . Sebuah pemulihan parsial sumsum tulang diamati
oleh hari 14 sebagai jumlah sel hidup mencapai 2,36 6 1,49 3 106 (7 Gy, kendaraan). Sebaliknya,
kelangsungan hidup sel-sel sumsum tulang dari tikus iradiasi diberikan dengan nanosuspension genistein
dipamerkan peningkatan yang signifikan, yang diamati pada semua titik waktu. Rata-rata, jumlah sel
sumsum tulang hidup di genistein tikus nanosuspension-diperlakukan meningkat dua kali lipat (hari 1),
lima kali lipat (hari 7) dan dua kali lipat (hari 14) dibandingkan dengan tikus yang diradiasi yang telah
menerima kendaraan.
 Kami selanjutnya mengevaluasi efek genistein nano suspensi pada perubahan patologis akibat radiasi di
sumsum tulang dari Sterna dipotong setelah 7 Gy 60Co TBI. Sumsum cellularity diperkirakan subyektif
di bidang mikroskopis untuk setiap sternum dipotong. Radiasi gamma secara signifikan mengurangi
sumsum tulang cellularity dari 100% (kelompok sham) untuk 25-35% hari 1 dengan perbedaan yang tidak
bermakna antara kelompok iradiasi (data tidak ditampilkan). Pada siang hari 7 postirradiation, tulang
kerusakan sumsum dari tikus kendaraan-dan diobati lebih jelas dengan kurang dari 5% cellularity diamati
di setiap sternum. Pada hari ke 14, yang cellularity dari sumsum tulang dalam dua kelompok iradiasi ini
sebagian dikembalikan ke rata-rata 15%. Sebaliknya, tikus pra-perawatan dengan nanosuspension
genistein menunjukkan pemulihan hematopoietik ditandai dengan peningkatan yang signifikan di
cellularity dari 28,3% dan 61,7%, pada hari ke 7 dan hari ke-14 postirradiation, masing-masing (Gambar.
3). Selain itu, yocytes megakar- diamati di sumsum tulang pada hari 7 dan 14 postirradiation di genistein
tikus nanosuspension-diobati, dan tidak pada tikus iradiasi kendaraan-diperlakukan (data tidak
ditampilkan).
PROTEKSI RADIASI DENGAN genistein NANOPARTIKEL 319
Gambar. 2. Genistein nanosuspension dilindungi sumsum tulang tikus setelah 7 iradiasi Gy 60Co. Pada 1, 7 dan 14 hari
postirradiation, sumsum tulang sel myeloid dari femora dan humeri dikumpulkan dari tikus individu (N = 6). Penilaian viabilitas
sel dilakukan oleh tripan pewarnaan biru. Sebuah 7 Gy sublethal dosis radiasi 60Co induksi kematian sel besar di sumsum tulang,
yang diamati pada awal 1 hari dan paling parah di 7 hari setelah iradiasi. Pengobatan dengan genistein nanosuspension
menghasilkan peningkatan yang signifikan dari jumlah sel sumsum tulang hidup dibandingkan dengan kelompok yang tidak
diobati dan kendaraan-diobati. (N = 6 / kelompok) (Error bar mewakili rata-rata 6 SEM, * P, 0,05, ** P, 0,01)
Genistein Nanosuspension Dipercepat HSPC Pemulihan di Tikus Bone Marrow setelah TBI
Untuk mengkonfirmasi efek radiasi-pelindung dari formulasi nano suspensi genistein dalam sel
hematopoietik mouse, yang clonogenicity sel sumsum tulang yang diisolasi dari tikus iradiasi menerima
perlakuan yang berbeda dievaluasi. Sel-sel sumsum tulang yang dipanen dari femora dan humeri pada
hari 1, 7 dan 14 setelah iradiasi dan jumlah sel-sel myeloid hidup untuk setiap tikus dikumpulkan.
Viabilitas sel dinilai oleh tripan tes eksklusi biru dan diikuti dengan uji pembentuk koloni menggunakan
budaya semipadat standar dalam rangkap tiga. Pembentuk koloni unit (CFUs) yang mencetak 10 hari
setelah penanaman dan dinyatakan sebagai jumlah total koloni per tikus (6 tikus per kelompok). Pada
tikus yang tidak disinari diberikan dengan suspensi genistein nano, tidak ada perubahan yang signifikan
dalam jumlah CFU (Gambar. 4A). Tikus yang menerima kendaraan dan diiradiasi dipamerkan penurunan
berat CFU dimulai pada hari 1 dan berlanjut sampai hari 14 postirradiation. Pada tikus iradiasi yang telah
diolah sebelumnya dengan suspensi genistein nano, bagaimanapun, CFUs terangkat secara signifikan,
terutama pada hari 7 postirradiation (P, 0,01; Fig.4B)tulang.
Selanjutnya, kelangsungan hidup sel-sel induk dan progenitor hematopoietik dari sumsum tikus iradiasi
pra-perawatan dengan kendaraan atau genistein nanosuspension ditentukan menggunakan sitometri.
Suspensi sel sumsum tulang adalah dari isolasi yang sama yang digunakan untuk CFU dan bernoda 7-
aminoactinomycin D (7-AAD), penanda untuk kematian sel. Pada tikus yang tidak disinari pra-perawatan
dengan genistein yang nanosuspen- sion, tidak ada efek pada kelangsungan hidup sel atau kematian yang
diamati (Gambar. 5A). Pada hari 7 postirradiation, genistein nanosuspension- diperlakukan tikus telah
secara signifikan mengurangi jumlah 7-AAD-
sel positif mati (19,9 6 0,8%) dibandingkan dengan tikus yang tidak diobati dan kendaraan-diperlakukan
(39,2 6 0,6%).
Kami dianalisa lebih lanjut frekuensi radiasi sumsum tulang kematian sel hematopoietik imbas dalam
tahap-negara berkembang yang berbeda menggunakan antibodi anti-garis keturunan dan 7-AAD co-
320 HA ET AL.
Gambar. 3. Genistein nanosuspension tikus dipromosikan sumsum tulang pemulihan hematopoietik setelah 7 Gy 60Co TBI.
Hematoxylin dan eosin pewarnaan mouse dipotong Sterna dilakukan 1, 7 dan 14 hari setelah 7 Gy 60Co TBI. Perwakilan gambar
diperoleh dari sham iradiasi dan kelompok iradiasi (7 Gy tidak diobati, 7 Gy kendaraan-diperlakukan dan 7 Gy genistein
nanosuspension-diperlakukan tikus). Administrasi genistein secara signifikan meningkatkan sumsum tulang myeloid cellularity
pada 7 dan 14 hari postirradiation. (N = 6 / kelompok) (Error bar mewakili rata-rata 6 SEM, * P, 0,05, ** P, 0,01)
 Gambar. 4. Genistein nanosuspension ditingkatkan kelangsungan hidup hematopoietik stem sel dan progenitor sumsum tulang
setelah 60Co TBI. Potensi Clonogenic sel sumsum tulang dinilai dengan alat tes CFU. Pada 1, 7 dan 14 hari postirradiation, sel-
sel sumsum tulang yang dikumpulkan dari femora dan humeri dikultur selama 10 hari dan CFU diberi skor dan dinyatakan
sebagai jumlah per tikus. Panel A: Jumlah koloni serupa antara kelompok yang tidak disinari. Panel B: Jumlah koloni meningkat
secara signifikan pada kelompok nanosuspension-diperlakukan genistein pada hari 1, 7 dan 14 postirradiation. (N = 6 /
kelompok) (Error bar mewakili rata-rata 6 SEM, * P, 0,05, ** P, 0,01)
pewarnaan. Silsilah-negatif (linier) dan populasi tion diwakili sel progenitor keturunan-redup, dan
kelompok sub keturunan-positif diwakili sel matang. Gambar 5B (panel kiri bawah) menggambarkan
bahwa 1 hari setelah 7 iradiasi Gy hidup sel-sel prekursor hematopoietik (Lin-negatif dan -dim) dari
PROTEKSI RADIASI DENGAN genistein NANOPARTIKEL 321
Gambar. 5. Genistein nanosuspension dipercepat sumsum tulang pemulihan hematopoietik tikus dari 7 Gy 60Co TBI. Arus
cytometry dilakukan untuk mengevaluasi efek dari nanosuspension genistein pada kelangsungan hidup dan pemulihan sel-sel
hematopoietik sumsum tulang yang dikumpulkan dari 7 Gy 60Co iradiasi tikus. Panel A: Frekuensi total 7-AAD sel sumsum
tulang yang positif menunjukkan bahwa pemberian genistein nanosuspension mengurangi rasio kematian sel dari 39,2 6 0,6%
(kendaraan) menjadi 19,9 6 0,8% (genistein) pada 7 hari setelah iradiasi. Panel B: Frekuensi sel hidup terjaga keamanannya pada
awal berkomitmen populasi prekursor (7-AAD-, linier / dim) (panel kiri bawah) diperoleh pada 1 dan 7 hari setelah iradiasi.
Grafik menunjukkan persentase penduduk ini relatif terhadap total sel sumsum tulang hidup. Genistein (nanosuspension)
administrasi meningkatkan (7- AAD-, linier / dim) penduduk dari 8,7% (hari 1) menjadi 21,3% (hari 7) sementara penipisan tetap
hampir tidak berubah pada kelompok kendaraan yang diobati (dari 6,4% di hari 1-7,1% pada hari ke 7). Panel C: Analisis HSPC
viabilitas (rasio 7-AAD +/-) gating dari linier / ckit + subkelompok dilakukan pada 7 hari setelah iradiasi. Pada siang hari 7, rasio
kematian sel (7-AAD + / linier, ckit +) berkurang dari 77,0 6 0,8% (kendaraan) menjadi 43,9 6 4,0% (genistein). Administrasi
genistein nanosuspension secara signifikan meningkatkan persentase hidup HSPC (7-AAD-, ckit +, linier) relatif terhadap jumlah
sel sumsum tulang hidup (7-AAD-) 7 hari setelah 7 Gy TBI. (N = 6 / kelompok) (Error bar mewakili rata-rata 6 SEM, * P, 0,05,
** P, 0,01)
semua kelompok iradiasi menurun empat kali lipat dibandingkan dengan kelompok sham-diobati. Tujuh
hari setelah iradiasi, linier negatif dan -dim (linier / dim) sel-sel dari tikus diberikan pada genistein
nanosuspension yang kembali memenuhi ke tingkat dekat dengan yang diamati pada tikus nonirradiated.
Populasi keturunan-negatif lebih lanjut bernoda dengan ckit stem cell marker. Populasi yang dihasilkan
dari linier / ckit + sel diidentifikasi sebagai tahap awal dari HSPCs di kompartemen sumsum tikus. Oleh
gating pada populasi HSPC (linier /
322 HA ET AL.
Gambar. 7. Genistein nanosuspension menghambat radiasi sintesis peningkatan IL-6 dan IL-1b dalam limpa mouse dan
sumsum tulang. Tingkat IL-6 dan IL -1b dievaluasi dari homogenat dihasilkan dari sumsum tulang individual dan limpa pada hari
1 dan hari 7 postirradiation dengan ELISA. A dosis radiasi dari 7 Gy 60Co TBI disebabkan IL-6 dan elevasi IL-1b dalam jaringan
ini pada tikus yang tidak diobati dan kendaraan-diperlakukan , pada hari 1 postirradiation. Administrasi genistein nanosuspension
secara signifikan mengurangi IL-6 dan elevasi IL-1b pada hari 1 postirradiation baik di sumsum tulang dan limpa. (N = 3 /
kelompok) (error bar mewakili rata-rata 6 SEM, ** P 0.01)
.,Gambar 6. Genistein nanosuspension terbalik tikus atrofi limpa disebabkan oleh 60Co TBI Panel A:. tikus limpa ditimbang 1,
7 dan 14 hari setelah 7 iradiasi Gy Semua kelompok iradiasi mengalami kerugian yang signifikan dalam berat limpa
dibandingkan dengan masing-masing. tidak disinari (0 Gy) kelompok kontrol. pada hari ke 14 postirradiation, berat limpa tikus
genistein nanosuspension-diperlakukan telah kembali ke tingkat dasar dan meningkat secara signifikan bila dibandingkan dengan
yang tidak diobati dan kendaraan-diperlakukan tikus iradiasi (N = 8 / kelompok) Kesalahan bar mewakili berarti 6 SEM). #, +
Dan ZP, 0,05 dari kelompok kontrol yang tidak disinari masing, ** P, 0,01 dari kelompok iradiasi (tidak diobati dan kendaraan
diperlakukan) pada hari ke 14 postirradiation. Panel A: Foto-foto limpa perwakilan dari sham- (tidak diobati, tidak disinari), dan
kendaraan-diperlakukan dan genistein nanosuspension-diperlakukan tikus 14 hari setelah 7 Gy iradiasiradiasi.
ckit +), kami mendeteksi bahwa genistein nanosuspension dilindungi linier / ckit + HSPCs dari kematian
imbas (kematian sel 77,0 6 0,8% dalam kendaraan yang diobati dibandingkan dengan kematian 43,9 6
4,0% di genistein-diperlakukan;. Gambar 5C). Kelangsungan hidup dari HSPC (linier / ckit + / 7-AAD
negatif) di seluruh sumsum tulang meningkat dari 1,4 6 0,1% (kendaraan) menjadi 3,4 6 0,3% (genistein
nanosuspension) (P, 0,01), ditunjukkan pada Gambar. 5C.
Genistein Nanosuspension Dilindungi Mouse dari Radiasi-induced limpa Atrofi
Kami selanjutnya memeriksa apakah genistein nanosuspension memiliki efek perlindungan pada atrofi
radiasi dari limpa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6A, paparan 7 Gy 60Co TBI tanpa pengobatan
atau dengan pengobatan kendaraan mengakibatkan penurunan berat badan tikus limpa sekitar 50% pada
hari 1 postirradiation, dengan peningkatan yang tidak signifikan dalam berat pada hari 14 postirradiation.
Sebaliknya, limpa dari tikus yang telah menerima nanosuspension genistein mencapai ukuran normal hari
14 postirradiation. Gambar 6B menunjukkan foto-foto limpa perwakilan dari kelompok sham- (0 Gy),
kendaraan-dan genistein nanosuspension- diperlakukan tikus 14 hari setelah7 Gy TBI.
SintesisGenistein Nanosuspension Menghambat Radiasi-induced IL-1b dan IL-6 di Tikus Tulang sumsum
dan limpa
ketinggian sitokin proinflamasi radiasi seperti IL-1b dan IL-6 adalah disebabkan perubahan dari sistem
hematopoietik setelah paparan radiasi. Dalam studi saat ini, homogenat dari sumsum tulang dan limpa
siap untuk evaluasi IL-1b dan IL-6 produksi disebabkan oleh TBI pada tikus. Jumlah yang sama dari total
protein dari limpa dan sumsum tulang tikus individu digunakan untuk normalisasi prosedur ELISA
standar. Dosis radiasi dari 7 Gy mengakibatkan ketinggian tingkat IL-1b pada tikus yang tidak diobati dan
kendaraan-diperlakukan baik sumsum tulang dan limpa, 1 hari setelah iradiasi. Tikus diberikan pada
nanosuspension genistein 24 jam sebelum iradiasi dipamerkan secara signifikan mengurangi tingkat IL-1b
(P
PROTEKSI RADIASI DENGAN genistein NANOPARTIKEL 323
Gambar. 8. Genistein nanosuspension berkurang COX-2 elevasi di sumsum tulang tikus dan limpa setelah 7 Gy 60Co TBI.
Panel A : lysates Tissue yang dihasilkan dari sumsum tulang dan limpa tikus individu dikumpulkan hari 1 postirradiation
Immunobloiting menggunakan anti-COX-2 dan antibodi anti b-aktin digunakan untuk menunjukkan, masing-masing, ekspresi
dan normalisasi COX-2.. radiasi gamma memicu peningkatan regulasi yang signifikan dari COX-2 di jaringan-jaringan
hematopoietik, sedangkan genistein (nanosuspension) sampel -treated dipamerkan penurunan yang signifikan dalam produksi
COX-2 (N = 3, berarti 6 SEM) Panel B:. Imunofluoresensi pewarnaan dipotong sternum sumsum tulang dengan anti-COX-2
antibodi dan DAPI (40, 6-diamidino-2-phenylindole) menunjukkan penurunan yang signifikan dari sitosol ekspresi COX-2 pada
tikus diobati dengan genistein nanosuspension dibandingkan dengan tikus kendaraan-diobati, pada hari 1 postirradiation
.,0,01; Ara. 7A-B). Tingkat radiasi dari IL-6 dalam limpa juga berkurang di genistein nanosuspension-

diperlakukan tikus bila dibandingkan dengan yang tidak diobati dan kendaraan-tikus pada hari 1

postirradiation diperlakukan (P, 0,01;. Gambar 7C). Kadar IL-6 di homogenat tikus sumsum tulang yang

tidak terdeteksi (data tidak ditampilkan