LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Nama : Irawati
NIM : H0714069
Kelompok : 13
Co-Ass : Muhammad Indra W

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2017
 PENGESAHAN

Laporan Praktikum Bioteknologi Pertanian ini disusun guna melengkapi

tugas mata kuliah Bioteknologi Pertanian diketahui serta disahkan oleh dosen dan
asisten Bioteknologi Pertanian pada Mei 2017.

Disusun oleh :
Nama : Irawati
NIM : H0714069
Kelompok : 13

Mengetahui,
Dosen Koordinator Praktikum Co-Assisten
Bioteknologi Pertanian

Prof. Dr. Ir. Nandariyah, MS Muhammad Indra W

NIP. 195408051981032002 NIM. H0713126

2
 KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah
melimpahkan berkah, rahmat serta hidayah-Nya sehingga saya dapat
menyelesaikan laporan praktikum Bioteknologi Pertanian ini. Penulisan laporan
ini penulis banyak mengalami hambatan dan kesulitan. Namun berkat bantuan dan
bimbingan dari semua pihak maka laporan ini dapat terselesaikan. Maka dengan
kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1 Dekan Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret.
2 Dosen pembimbing mata kuliah Bioteknologi Pertanian.
3 Co Ass yang telah banyak memberikan bimbingan dan pengarahan hingga
laporan ini dapat terselesaikan.
4 Teman-teman yang telah membantu dan melaksanakan praktikum dengan
lancar.
Akhirnya penulis dapat menyelesaikan laporan ini dan berharap semoga
laporan ini bermanfaat khususnya bagi penulis dan umumnya bagi pembaca.
Penulis menyadari dalam penulisan laporan ini masih jauh dari sempurna. Oleh
karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun untuk
kemajuan penulisan laporan ini.

Surakarta, Mei 2017

Penulis

3
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL....................................................................................... i
HALAMAN PENGESAHAN........................................................................ ii
KATA PENGANTAR...................................................................................... iii
DAFTAR ISI.................................................................................................... iv
DAFTAR TABEL............................................................................................ vi
DAFTAR GAMBAR....................................................................................... vii
A. PENDAHULUAN........................................................................................... 1
B. WAKTU DAN TEMPAT PRAKTIKUM...................................................... 2
C. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 1........................ 3
1. Hasil Pengamatan............................................................................... 3
2. Pembahasan........................................................................................ 7
D. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 2........................ 12
1. Hasil Pengamatan............................................................................... 12
2. Pembahasan........................................................................................ 13
E. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 3........................ 16
1. Hasil Pengamatan............................................................................... 16
2. Pembahasan........................................................................................ 20
F. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 4........................ 23
1. Hasil Pengamatan............................................................................... 23
2. Pembahasan........................................................................................ 23
G. KESIMPULAN............................................................................................... 27
DAFTAR PUSTAKA

4
 DAFTAR TABEL

Tabel 1.1 Pengenalan Alat Bioteknologi.......................................................... 3

Tabel 1.2 Pengenalan Bahan Bioteknologi....................................................... 7
Tabel 3.1 Data rekapan Uji Kuantitas Isolasi DNA......................................... 17
Tabel 3.2 Data rekapan Uji Kualitas Isolasi DNA........................................... 18

5
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Bagan Alur Isolasi DNA................................................................. 12

Gambar 3.1 Bagan Kerja Uji Elektroforesis...................................................... 16
Gambar 4.1 Amplifikasi DNA yang Berhasil ................................................... 23
Gambar 4.2 Amplifikasi DNA yang Gagal ..........................................23

6
 1

A. PENDAHULUAN
Bioteknologi merupakan teknik dengan menggunakan makhluk hidup
untuk memecahkan suatu masalah sehingga menghasilkan suatu produk yang
bermanfaat. Menurut Riadi (2008), bioteknologi merupakan cabang ilmu yang
relatif baru dibanding disiplin ilmu lainnya yang sudah lama berkembang.
Meskipun demikian, penelitian bioteknologi berkembang pesat terutama
setelah ditemukannya teknik dan peralatan modern seperti polymerase chain
reaction, sequencer, dan microarray. Pemanfaatan bioteknologi berkembang
pada berbagai bidang, seperti pertanian, perikanan, kelautan, peternakan,
farmasi, kedokteran, dan bidang lain yang berhubungan atau memanfaatkan
agens hayati. Meskipun tidak sepesat negara maju, penelitian bioteknologi di
Indonesia juga berkembang, baik yang berkaitan dengan ilmu dasar maupun
terapan yang berpotensi komersial.
Bioteknologi pertanian merupakan salah satu cabang yang penting dalam
pengembangan bioteknologi yang diarahkan untuk pemenuhan kebutuhan
manusia akan pangan. Bidang ini telah berkembang sangat pesat dan
menghasilkan temuan dan aplikasi-aplikasi baru dalam produksi pertanian.
Ilmu bioteknologi pertanian tidak dapat dipisahkan keterkaitannya dengan ilmu
terapan lain seperti teknologi DNA rekombinan, rekayasa genetika, kultur
jaringan, dan lain-lain.
Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan
data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai
kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan
dana. Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu
kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam
pencandraan sidik jari DNA (Ardiana 2009). DNA adalah asam nukleat yang
mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan
biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Untuk mendapatkan DNA
murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk hidup dapat dilakukan
suatu teknik isolasi DNA. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara,
akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan
masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida
 2

dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga
mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi,
atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak
dapat digunakan untuk aplikasi penelitian.
Isolasi DNA ini sangat penting dalam bidang bioteknologi maupun
bidang biologi molekuler. Pengenalan isolasi DNA sangat penting mengingat
bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi
molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman
seperti padi kapas dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan
keanekaragaman hayati di masa mendatang memerlukan keterampilan dan
pemikiran. Salah satunya adalah dengan mengetahui cara pengumpulan DNA
dan prinsip dasarnya sebagai pijakan untuk mempelajari biologi molekuler
pada khususnya
B. WAKTU DAN TEMPAT PRAKTIKUM
Praktikum Bioteknologi Pertanian dilakukan setiap hari Rabu, mulai
tanggal 22 Maret 2017 sampai tanggal 26 April 2017 pukul 07.00 - 09.00 WIB
di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret
Surakarta.
 3

C. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 1

1. Hasil Pengamatan
Tabel 1.1 Pengenalan Alat Bioteknologi
No Jenis Alat Spesifikasi Fungsi Gambar Alat
Merk
Memanaskan
Memmert
air, larutan /
Temperatur
bahan
1 Waterbath dari 10C-90C
Material sehingga suhu
ASTM, tahan konstan
korosi
Terdapat
pengaturan suhu Mengisolasi
4C-10C DNA dan
Terdapat
perbanyakan
2 PCR lubang sangat kecil
implikasi DNA
untuk tempat DNA
Disebut secara
easmotik
juga Thermal
Cycler
Terdiri dari
lampu UV, kamera,
Melihat dan
Gel dan komputer
Biosens SC mendokumenta
3 Documentati
gel sikan hasil
on Terdapat elektroforesis
tombol power, TW,
RW, dan kamera

Menimbang
Memiliki
bahan yang
Timbangan tingkat ketelitian
4 bersifat halus
Analitik hingga 0,0001
dalam ukuran
gram
kecil
 4

Menumbuk
Mortar dan Terbuat dari dan
5
Alu keramik menghaluskan
bahan

Terdiri dari Menguji

Elektro- buffer gel sisir, kualitas DNA

6
foresis kutub positif dan yang dijadikan
negatif sampel

Memiliki
Mengukur
bagian cuvet untuk
kualitas
Spektro- menampung DNA
7 kemurnian dan
fotometer Terdapat
konsentrasi
pengaturan UV 260
DNA
dan 280
Memutar
Terdapat sampel dengan

pengatur kecepatan kecepatan

putaran tinggi sehingga

8 Centrifuge Terdapat terjadi
motor, speed, pemisahan
control, timer dan partikel
break system berdasar
massanya
Penghubun
Mengambil
g mikropipet
larutan pada
dengan
mikropipet.
9 Cip sampel/bahan
Terdapat 3
Berwarna
warna berdasar
putih, biru dan
ukuran
kuning
 5

Memiliki
Mengambil
ketelitian tinggi
10 Mikropipet larutan dalam
dalam mengambil
ukuran ml
larutan

mengukur dan
Tabung
mencampur
11 Beaker glass silinder dengan
bahan yang
dasar yang rata
akan dianalisa

Mengukur
Terbuat dari
volume cairan
polyprone
yang tidak
12 Gelas ukur Ringan,
memerlukan
lebih rapuh dari
ketelitian
kaca
tinggi

Terbuat dari Menampung

kaca borosilikat titran hasil dari
13 Erlenmeyer sehingga dapat titrasi/filtran
dipanaskan di atas dari
api penyaringan

Memindahkan
Berbentuk volume cairan
14 Pipet ukur silinder kecil dan dari suatu
panjang tempat ke
tempat lain
 6

Mensterilkan
peralatan dan
Uap perlengkapan
tekanan tinggi dengan
15 Autoclave
jenuh pada 21C menundukkan
selama 15-20 menit material untuk
uap tekanan
tinggi jenuh
Mengeringkan
peralatan serta
digunakan
Terdapat
untuk
16 Oven pengaturan suhu
sterilisasi
dan waktu
dengan
ketelitian
rendah
Menjepit
Terbuat dari
bahan yang
17 Pinset besi dengan ujung
akan
lancip
digunakan
Mencampur
bahan yang
Berkecepat sudah
18 Vortex an sampai 2500 dihancurkan
rpm dengan
mortar /
larutan buffer
 7

Menginkubasi
Dilengkapi
bahan dengan
19 Inkubator pengatur suhu dan
lingkungan
waktu
yang terkontrol

Mampu Memanaskan
menghomogenkan dan
larutan sampai 10 menghomogen
20 Hot Plate
L dengan kan suatu
kecepatan sangat larutan dengan
lambat penyadangan
Sumber : Laporan Sementara

Tabel 1.2 Pengenalan Bahan Bioteknologi

N
Jenis Bahan Fungsi
o
Sebagai buffer / penyangga agar pH tetap stabil
1 TAE / TBE
selama isolasi
Akuabides berupa air dengan 2 kali penyulingan dan
2 Akuabides
digunakan sebagai pelarut
Mengendapkan polisakarida yang merupakan hasil
3 CIA / CIAA
metabolit sekunder dan sebagai buffer ekstraksi
4 Isopropanol Mengendapkan DNA (presipitasi)
Sebagai pemberat DNA saat elektroforesis dan
5 Loading dye memudahkan sampel masuk dalam sumur-sumur
sampel
6 CTAB Merusak / lisis membran sel, karena membran sel
tersusun atas protein dan lemak. CTAB akan
 8

berikatan dengan lemak/lipid

7 Sodium asetat Mengandapkan DNA
Mercaptoetano
8 Mengendapkan polifenol
l
Etidium
9 Pewarna gel agarose dan asam nukleat
bromida
10 Tris EDTA Pelarut DNA
Sumber : Laporan Sementara
2. Pembahasan
Bioteknologi merupakan pemanfaatan prinsip-prinsip ilmiah dalam
menggunakan organisme untuk menghasilkan produk dan jasa untuk
memenuhi kebutuhan manusia. Prinsip dasar dari bioteknologi adalah
menggunakan makhluk hidup sebagai subjek. Makhluk hidup yang
digunakan adalah sebagian besar dari golongan mikroorganisme.
Mikroorganisme yang dimaksud antara lain jamur ragi, bakteri, dan
sebagainya. Diwyanto (2008) menyatakan bahwa bioteknologi merupakan
suatu integritas berbagai cabang ilmu, antara lain biologi, kimia, genetika,
pemuliaan, reproduksi, imunologi, dan komputasi. Bidang ini sangat
kompleks, rumit, mahal, dan perlu waktu yang cukup lama untuk
menguasainya. Peralatan dan sumber daya manusia yang menggeluti
bidang ini sangat khusus.
Bioteknologi dapat dikelompokkan menjadi bioteknologi
konvensional dan modern. Rekayasa yang masih dalam tingkat terbatas
dan mudah diaplikaskan dalam masyarakat umum (misalnya di bidang
pangan: tempe, tape, roti, bir) merupakan bioteknologi konvensional.
Sedangkan bioteknologi modern telah menggunakan teknik rekayasa
tingkat tinggi dan memiliki pengaruh besar terhadap kehidupan manusia.
Karena sifatnya yang multidisipliner, lebih banyak bersifat aplikatif dan
abstrak sehingga bioteknologi modern membutuhkan penguasaan konsep
dasar yang benar (Riani 2015).
Bioteknologi baik di bidang pertanian maupun bidanglain
berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini
ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal
rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan, pengembangbiakan
 9

sel induk, kloning, dan lain-lain. Keanekaragaman hayati merupakan

modal utama sumber gen untuk keperluan rekayasa genetik dalam
perkembangan dan perkembangan industri bioteknologi. Baik donor
maupun penerima (resipien) gen dapat terdiri atas virus, bakteri, jamur,
lumut, tumbuhan, hewan juga manusia. Pemilihan donor/resipien gen
bergantung pada jenis produk yang dikehendaki dan nilai ekonomis suatu
produk yang dapat dikembangkan menjadi komoditis bisnis. Oleh karena
itu, kegiatan bioteknologi dengan menggunakan rekayasa genetik menjadi
tidak terbatas dan membutuhkan suatu kajian sains baru yang mendasar
dan sistematik yang berhubungan dengan kepentingan dan kebutuhan
manusia.
Peralatan yang digunakan dalam praktikum Bioteknologi Pertanian
acara Prinsip Dasar dan Pengenalan Alat serta Bahan Bioteknologi
diantaranya adalah waterbath, PCR, Gel documentation, timbangan
analitik, mortar dan alu, elektroforesis, spektrofotometer, centrifuge, cip,
mikropipet, beaker glass, gelas ukur, erlenmeyer, pipet ukur, autoclave,
oven, pinset, vortex, inkubator, dan hot plate. Masing-masing alat
memiliki fungsi yang berbeda-beda. Waterbath merupakan wadah yang
berisi air yang bisa mempertahkan suhu air pada kondisi tertentu selama
selang waktu yang ditentukan. Waterbath berfungsi untuk memanaskan
air, larutan/bahan hingga suhu konstan. PCR atau disebut juga Thermal
Cycler berfungsi untuk mengisolasi DNA dan perbanyakan implikasi
DNA secara easmotik. Terdapat pengaturan suhu 4C-10C serta terdapat
lubang sangat kecil untuk tempat DNA pada alat tersebut. Gel
documentation berfungsi untuk melihat dan mendokumentasikan hasil
elektroforesis. Komponen utama dari gel documentation ini diantaranya
lampu UV, kamera, dan komputer.
Pengujian kualitas DNA menggunakan alat yang bernama
elektroforesis. Alat ini terdiri dari buffer gel sisir, kutub positif serta
negatif. Pengujian kualitas kemurnian dan konsentrasi DNA
menggunakan alat spektrofotometer yang memiliki bagian cuvet untuk
menampung DNA serta terdapat pengaturan UV 260 dan 280. Centrifuge
 10

merupakan alat untuk memutar sampel dengan kecepatan tinggi sehingga

terjadi pemisahan partikel berdasar massanya. Terdapat pengatur
kecepatan putaran pada alat ini, selain itu juga terdapat motor, speed
control, timer dan break system. Menurut Triarjo (2016), centrifuge
merupakan alat yang digunakan untuk memisahkan organel berdasarkan
massa jenisnya melalui proses pengendapan. Dalam prosesnya, centrifuge
menggunakan prinsip rotasi atau perputaran tabung yang berisi larutan
agar dapat dipisahkan berdasarkan massa jenisnya. Larutan akan terbagi
menjadi dua fase yaitu supernatant yang berupa cairan dan padatan atau
organel yang mengendap. Cip berfungsi untuk mengambil larutan pada
mikropipet. Terdapat 3 warna berdasar ukuran, yaitu putih, kuning dan
biru. Mikropipet berfungsi untuk mengambil larutan dalam ukuran ml.
Mikropipet memiliki ketelitian yang sangat tinggi. Autoclave dan oven
berperan dalam sterilisasi, namun autoclave lebih memiliki ketelitian
yang tinggi dengan uap bertekanan tinggi. Menurut Wulandari dan
Hadisaputri (2016), autoklaf digunakan ketika melakukan proses, bahan,
dan peralatan dalam keadaan steril. Dalam menggunakannya,
pemeriksaan rutin pada autoklaf harus dilakukan. Pemeriksaan rutin ini
berfungsi untuk memastikan bahwa autoklaf beroperasi pada suhu dan
tekanan yang sesuai. Vortex memiliki kecepatan yang dapat mencapai
2500 rpm, untuk mencampur bahan yang sudah dihancurkan dengan
mortar/larutan buffer. Inkubator berfungsi dalam menginkubasi bahan
dengan lingkungan yang terkontrol. Hot plate berfungsi untuk
memanaskan dan menghomogenkan suatu larutan.
Alat-alat yang sudah umum digunakan diantaranya timbangan
analitik, mortar dan alu, beaker glass, gelas ukur, erlenmeyer, pipet ukur,
dan pinset. Timbangan analitik memiliki ketelitian tinggi untuk
menimbang bahan yang bersifat halus dalam ukuran kecil. Mortar dan alu
merupakan sepasang alat yang digunakan untuk menumbuk dan
menghaluskan bahan. Beaker glass, gelas ukur dan erlenmeyer meupakan
peralatan dari kaca yang berfungsi untuk mengukur volume cairan yang
 11

akan digunakan. Pipet ukur digunakan untuk mengambil larutan,

sedangkan pinset digunakan untuk mengambil/menjepit bahan yang akan
digunakan.
Bahan-bahan yang digunakan juga memiliki fungsi yang berbeda-
beda diantaranya TAE/TBE, akuabides, CIA/CIAA, isopropanol, loading
dye, CTAB, sodium asetat, mercaptoetanol, etidium bromida, dan tris
EDTA. TAE/TBE berfungsi sebagai buffer/penyangga agar pH tetap stabil
selama dilakukan isolasi DNA. Akuabides digunakan sebagai pelarut
secara umum, sedangkan tris EDTA digunakan sebagai pelarut DNA.
CIA/CIAA berfungsi untuk mengendapkan polisakarida yang merupakan
hasil metabolit sekunder dan juga sebagai buffer ekstraksi. Isopropanol
dan sodium asetat berfungsi untuk mengendapkan DNA, sedangkan
mercaptoetanol mengendapkan polifenol. Loading dye sebagai pemberat
DNA saat elektroforesis dan memudahkan sampel masuk ke dalam
sumuran. CTAB berfungsi untuk merusak membran sel. Carsono et al
(2014) menyatakan bahwa CTAB berfungsi sebagai buffer pengekstrak
yang dapat merusak membran menjadi suatu larutan kompleks yang
mengandung DNA. Etidium bromida berfungsi sebagai pewarna gel
agarose dan asam nukleat.
 12

D. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 2

1. Hasil Pengamatan

Memanaskan buffer Mengambil sampel Menimbang sampel

ekstraksi pada suhu daun dan daun sebanyak 0,2
65C selama 15-30 memisahkan dari gram
menit tulang daun

Melumatkan daun
Meletakkan tabung Memasukkan yang telah
steril ke dalam gabus sampel daun ke ditambahkan buffer
dalam tube ekstraksi (BE)

Menambahkan 500
Tube dan sampel l CIA ke dalam
diinkubasi pada suhu Sampel disentrifugasi
sampel dan dicampur
65C selama 60 pada kecepatan 12000
hingga homogen
menit rpm selama 10 menit

Memindahkan
Mengambil cairan Memindahkan
supernatant ke tabung
lapisan atas lalu supernatant ke tabung
baru, lalu ditambahkan
dipindah ke tabung baru dan
500 l CIA lalu
baru menambahkan 500 l
disentrifuge 12000 rpm
CIA
selama 5 menit

Membuang
Menambahkan 650 l
Sentrifugasi dengan supernatant, dan
isopropanol dingin
kecepatan 13000 mencuci pellet dengan
dan 2,5 M sodium
rpm selama 5 menit ethanol 70%
asetat lalu dicampur
kemudian
hingga homogen
dikeringanginkan

Menyimpan DNA Menghitung

dalam suhu -20C konsentrasi DNA Melarutkan DNA 50
guna tahap dengan l TE dengan
amplifikasi spektrofotometer aquadest

Gambar 2.1 Bagan Alur Isolasi DNA

 13

2. Pembahasan
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung
informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya.
Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi
bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA
genom meliputi gen dan intergen. Menurut Lucianus (2013) keberadaan DNA di
dalam sel adalah berupa dua untaian panjang nukleotida yang berpasangan sambil
berputar sehingga mem-bentuk struktur double helix. Pada salah satu ujung
untaian DNA itu mengikat gula yang memiliki fosfat pada 5-hydro-xyl,
sedangkan pada ujung yang lainnya gulanya memiliki hy-droxyl bebas pada posisi
3 (re-plikasi DNA berlangsung de-ngan menambahkan nukleosida trifosfat baru
pada ujung 3-hydroxyl bebas).
Isolasi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis
molekuler. Dibutuhkan DNA dengan kualitas yang baik untuk berbagai kegiatan
seperti pemanfaatan marka molekuler, pembuatan pustaka genom, hingga
sekuensing. Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses isolasi DNA
tanaman adalah kehadiran senyawa kontaminan padasampel yang diisolasi seperti
senyawa polisakarida, polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder
yang terdapat pada tumbuhan obat Kehadiran senyawa kontaminan tersebut dapat
menghambat berbagai proses mulai dari pemotongan DNA, amplifikasi, hingga
cloning (Nugroho 2015).
Praktikum Bioteknologi Pertanian acara Isolasi DNA Tanaman dilakukan
dengan metode Nandariyah 2007. Perbedaan metode ini dengan metode lain yaitu
menggunakan bahan CIA pada tahap purifikasi, dan pada saat presipitasi
ditambahkan isopropanol. Alat yang digunakan diantaranya timbangan analitik,
waterbath, centrifuge, vortex, freezer, gloves, masker, flakon, gabus untuk
pengambang, timer, mortar dan alu, spatula, mikropipet, blue tip (100-1000 l),
yellow tip (10-100 l), aluminium foil, kertas label, bolpoin waterproof, tube 1,5
ml, dan tissue. Bahan yang digunakan diantaranya sampel daun salak, buffer
ekstraksi, PVP, CIA/CIAA, isopropanol dingin, sodium asetat, etanol 70%, TE 1x,
dan alkohol 70%.
 14

Isolasi DNA tanaman dimulai dengan memanaskan buffer ekstrasi pada

suhu 65C selama 15-30 menit dan memotong daun salak untuk dijadikan sampel,
helai daun dipisahkan dari tulang daun. Sampel daun ditimbang sebanyak 0,2
gram dan selanjutnya dilumatkan serta ditambahkan dengan buffer ekstraksi (BE)
yang telah dipanaskan tadi. Sampel selanjutnya dimasukkan ke dalam tube steril.
Tube steril dimasukkan ke dalam gabus, lalu diinkubasi pada suhu 65C selama
60 menit. Setelah dikeluarkan, sampel dalam tube ditambah dengan 500 l CIA
dan dicampur hingga homogen. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm
selama 10 menit. Supernatant dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 500
l CIA lagi. Supernatant dipindahkan ke tabung baru, lalu ditambahkan 500 l
CIA lagi dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Setelah
itu, cairan lapisan bagian atas diambil dan dipindahkan ke tabung baru. Pada
tabung baru ditambahkan 650 l isopropanol dingin, dan 2,5 M sodium asetat lalu
dicampur hingga homogen. Berikutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000
rpm selama 5 menit. Setelah selesai, supernatant dibuang dan pellet dicuci dengan
ethanol 70% kemudian dikeringanginkan. DNA dilarutkan dalam 50 l TE dengan
aquadest. Selanjutnya konsentrasi DNA dihitung dengan menggunakan
spektrofotometer. DNA disimpan dalam suhu -20C guna tahap amplifikasi.
Fitra (2012) menyebutkan bahwa tinggi rendahnya konsentrasi isolat DNA
dapat disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya adalah suhu inkubasi saat
proses pemecahan sel dan jaringan, serta lama inkubasi. Jika, suhu terlalu tinggi
suhu dan terlalu lama dapat menyebabkan degradasi DNA, jika terlalu rendah
buffer lysis tidak dapat bekerja secara optimal. Suhu dan lama inkubasi harus
dikombinasikan secara tepat agar konsentrasi yang didapatkan sesuai dengan
harapan. Konsentrasi maupun kemurnian DNA yang dihasilkan sangat
dipengaruhi oleh faktor teknis selama pengerjaan isolasi DNA, diantaranya adalah
faktor pemindahan supernatan yang mengandung DNA setelah diinkubasi ke
dalam tabung eppendorf yang baru dan pengeringan isolat. Pemindahan harus
dilakukan secara teliti agar jaringan-jaringan yang telah hancur dan berada
dibagian bawah tabung tidak ikut terambil, sedangkan pengeringan DNA yang
berupa pelet pada tahap akhir isolasiharus benar-benar kering dari larutan
 15

sebelumnya yang dipakai untuk purifikasi. Jika pengeringan kurang sempurna,

maka larutan purifikasi seperti alkohol atau etanol dapat menurunkan nilai
kemurnian DNA pada saat pengukuran pada spektrofotometer.
 16

E. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 3

1. Hasil Pengamatan

Memindahkan agarose
Menyiapkan alat dan
dalam gel doc yg sudah
bahan
terhubung dengan PC

Menimbang agarose 1 mg
Memasukkan agarose ke
dalam alat elektroforesis
(tegangan 100V)
Mengukur TBE 100ml

Memindahkan larutan
tadi dalam agarose yang
Mencampurkan agarose, sudah memadat pada
TBE, dan magnetic bagian sumuran yang
stirrer pada erlenmeyer terbentuk

Campur DNA dengan

Memanaskan enlemeyer loading dye hingga
yang berisi bahan bahan homogen (ungu)
tersebut diatas magnetic
stirrer hingga mendidih

Mengambil DNA
sebanyak 5l
Mematikan magnetic
stirrer dan setelah
dinging ditambahkan 5l
ethidium bromide Meletakkan loading dye
pada plester plastik

Menuangkan agarose dan

TBE 1x pada cetakan lalu Mengambil loading dye
tunggu hingga mengeras sebanyak 1l

Gambar 3.1 Bagan Kerja Uji Elektroforesis

 17

Tabel 3.1 Data Rekapan Uji Kuantitas Isolasi DNA

No
Kelompok Kemurnian DNA Konsentrasi DNA
.
1 1 - -
2 2 0,2 99,9
3 3 0,125 99,9
4 4 0,875 87412,5
5 5 0,004 795
6 6 1,5 299,7
7 7 25 2497,5
8 8 3 599,4
9 9 0,72 1298,7
10 10 1,09 1198,8
11 11 0,95 1798,2
12 12 2,0 399,6
13 13 0,4 599,4
14 14 0,638 2997
15 15 0,57 799,2
16 16 -1,1 -109,89
17 17 1,77 8491,5
18 18 0,5 499,5
19 19 0,004 795
20 20 0,03 498,75
21 21 0,001 199,5
22 22 0,0005 99,75
23 23 0,001 199,8
24 24 0,004 899,1
25 25 0,002 399,6
26 26 0,0005 99,9
Sumber : Hasil pengamatan
 18

Tabel 3.2 Data Rekapan Uji Kualitas Isolasi DNA

No. Shift Gambar Gel doc Ket.

1 1

2 2 Tampak jelas

Tidak tampak
3 3
jelas

4 4 Tampak jelas

5 5 Tampak jelas

6 6
 19

Tidak tampak
7 7
jelas

Tidak tampak
8
8 jelas

Tidak tampak
9 9
jelas

10
10 Tampak jelas

11 Kontrol

Sumber : Hasil pengamatan

 20

2. Pembahasan

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan molekul DNA dari

molekul-molekul lain seperti protein dan enzim untuk mendapatkan DNA
yang murni. Isolasi DNA merupakan langkah awal yang harus dilakukan
dalam proses rekayasa genetika sehingga perlu adanya uji hasil untuk
menunjang keberhasilan tahap selanjutnya. Uji hasil isolasi DNA tersebut
meliputi uji kuantitatif dan kualitatif. Uji kuantitatif DNA merupakan uji
untuk menentukan tingkat konsentrasi DNA. Uji kualitatif DNA merupakan
uji untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA serta keutuhan DNA.
Menurut Syafaruddin (2011), DNA yang sudah diukur konsentrasinya
diencerkan dan selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas DNA dengan
elektroforesis gel untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA dari
kontaminan RNA dan keutuhan DNA hasil isolasi.
Uji kuantitatif DNA dilakukan dengan menggunakan alat yang disebut
spektrofotometer dan uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan alat
elektroforesis. Spektrofotometer merupakan suatu alat untuk melakukan
analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis
(absorbansi) oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang
spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi
dengan detector fototube. Pengukuran absorbansi pada spektrofotometer
dilakukan dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang
tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Nilai
absorbansi dari cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi larutan
di dalam kuvet.
Elektroforesis adalah suatu proses yang dapat memisahkan atau
memigrasikan fragmen DNA pada matriks berpori di bawah pengaruh
medan listrik. Elektroforesis dilakukan untuk menentukan keutuhan DNA
total. Elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan bobot molekul dan
muatanya dengan menggunakan media pemisah. Kecepatan pergerakan ini
tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui
DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA
 21

(Novitasari et al. 2014). Media yang digunakan untuk pemisahan DNA

adalah gel agarose dan pewarnaan gel hasil elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan etidium bromide.
Uji kuantitatif dilaksanakan dengan menggunakan spektrofotometer.
Alat dan bahan lain yang digunakan yaitu alkohol, aquades, mikropipet, tip
blue dan yellow, kuvet serta DNA yang akan diuji. Spektrofotometer diatur
panjang gelombangnya, yaitu 260 nm dan 280 nm. Spektrofotometer
sebelum digunakan, dilakukan kalibrasi terhadap air yang digunakan untuk
membuktikan bahwa pengencer benar-benar air. Tahap selanjutnya adalah
mengisi kuvet dengan 1998 l aquades dan 2 l DNA. Kuvet selanjutnya
dimasukkan ke dalam spektrofotometer dengan sisi bening menempel pada
pada alat sensor baca spektofometer.
Hasil pengamatan dari semua sampel menujukkan kemurnian DNA
yang diuji mayoritas memiliki kuantitas DNA yang rendah. Hanya isolate
dari kelompok 6, 12 dan 17 yang kemurnian DNAnya memiliki nilai antara
1,8-2,0. Sedangkan konsentrasi DNA terbesar dimiliki oleh sampel
kelompok 4 yaitu 87412,5. Rendahnya kemurnian DNA hasil sampel
dimungkinkan terjadi karena ketidaktepatan dan ketidaktelitian dalam
melaksanakan langkah-langkah isolasi sehingga berpengaruh terhadap
kualitas DNA yang dihasilkan. Konsentrasi DNA yang rendah dapat
dipengaruhi oleh beberapa faktor, yakni; disosiasi jaringan dan presipitasi
DNA dari jaringan sel yang kurang maksimal sehingga menyebabkan
ekstraksi DNA dari dalam sel hanya sedikit. Selain itu juga dapat
disebabkan oleh pengikatan DNA yang kurang maksimal saat tahap binding
DNA. Secara teoritis, sampel DNA yang dianggap cukup murni mempunyai
perbandingan A260/A280 = 1,80-2,0 (Restu et al. 2012).
Uji elektroforesis diawali dengan pembuatan gel agarose pada cetakan
gel dan diamkan hingga mengeras. Tahap selanjutnya adalah menuangkan
buffer TBE ke dalam tangki elektroforesis. Gel selanjutnya diletakkan di
dalam tangki dengan posisi sumuran pada kutub negatif tangki dan pastikan
gel agarose tenggelam dalam larutan buffer TBE. Mengambil loading dye 1
l dan mencampurkan dengan 5 l DNA. Memasukkan caampuran tersebut
 22

ke dalam sumuran sampel dan kemudian menutup tangki elektroforesis.

Menyambungkan alat ke listrik, mangatur voltase yang diinginkan dan
mengalirkan arus listrik. Loading dye akan bergerak mendekati ujung bawah
gel.
 23

F. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 4

1. Hasil Pengamatan

Gambar 4.1 Amplifikasi DNA yang

Gambar 4.2 Amplifikasi DNA yang gagal
berhasil
Sumber: Hasil Pengamatan
2. Pembahasan

Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR)

adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro
(Yusuf 2010). PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA
dengan menggunakan dua oligonukleotida primer yang komplementer
dengan ujung 5 dari kedua untaian sekuensi target. Teknik PCR dapat
digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali
hanya dalam beberapa jam. Penggandaan urutan basa nukleotida
berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang
secara berantai selama beberapa siklus. Komponen-komponen yang
dibutuhkan dalam reaksi polimerase antara lain untai DNA yang akan
digunakan sebagai cetakan (template), primer, sumber basa nukleotida
berupa empat macam dNTP dan enzim DNA polimerase.
Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan
untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. DNA template ini dapat
berupa, DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA. DNA yang
akan digunakan sebaiknya dimurnikan terlebih dahulu dan bebas dari
nukleus, endo maupun ektoprotease dan DNA binding-protein. DNA
template untuk proses PCR dapat diperoleh dengan menggunakan beberapa
metode, yaitu metode lisis sel dan dengan cara melakukan isolasi DNA
 24

kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang

ada.
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang
mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan
diperbanyak. Primer berfungsi untuk mengawali replikasi DNA dan
umumnya panjang primer berkisar antara 18 -30 basa. Kandungan (G+C))
(% jumlah G dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C)
DNA target, karena primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan
mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang
dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR. Urutan
nukleotitda pada ujung 3 sebaiknya G atau C agar menurunkan spesifisitas
primer. dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP
(deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP
(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). dNTPs
bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses
ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk
reaksi polimerisasi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk
proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena
itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC.
PCR melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada
setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Proses PCR
terdiri dari 3 tahapan yaitu denaturasi, anneling dan extention. Denaturasi
DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai
tunggal. Denaturasi DNA template umumnya dilakukan selama 30-90 detik,
tergantung pada DNA template yang digunakan. Tahap selanjutnya adalah
anneling (penempelan primer). Tahap ini merupakan tahap hibridisasi
primer PCR pada sekuens target. Primer sebaiknya berukuran 18-25 basa,
mengandung 50 60 % G+C dan kedua primer tersebut sebaiknya sama.
Kisaran temperatur anneling yang digunakan adalah antara 36 oC-72oC,
namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50-60oC (Yusuf 2010).
Tahap terakhir dari PCR adalah extension atau pemanjangan. Selama
tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA
 25

primer dari ujung 3. Suhu yang dibutuhkan dalam proses extention rata-rata
adalah 72oC. Pada tahap ini, biasanya waktu yang digunakan untuk tahap ini
diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan
terbentuk DNA untai ganda. Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari
25 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-
molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi
dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA
cetakan yang digunakan (Yusuf 2010).
Keberhasilan amplifikasi DNA menggunakan PCR dipengaruhi oleh
beberapa faktor diantaranya adalah jenis polimerase DNA, suhu serta
konsentrasi dari berbagai komponen yang digunakan. Penggunaan jenis
DNA polimerase tergantung pada panjang DNA target yang akan
diamplifikasi. Konsentrasi bahan meliputi konsentrasi dNTPs dan DNA
polimerase. Suhu dari setiap tahap dalam PCR juga akan mempengaruhi
keberhasilan dari teknik ini. Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara
93-95oC, suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37-60oC dan suhu
yang digunakan dalam tahap extention umumnya sebesar 72oC.
Panjang primer juga merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi
proses PCR. Menurut Sasmito (2014), primer dengan panjang lebih dari 30
basa tidak disarankan, karena tidak menunjukkan spesifisitas yang lebih
tinggi. Primer yang panjang juga dapat berakibat terhibridasi dengan primer
lain sehingga tidak membentuk polimerisasi DNA. PCR hanya mampu
menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp
saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang
untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi
dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
Konsentrasi komponen-komponen PCR yang tidak tepat dapat
menyebabkan primer yang digunakan tidak menempel pada DNA cetakan
secara sempurna, hal ini dapat dikarenakan kualitas DNA cetakan juga
berpengaruh. Adanya kandungan polifenol dan metabolit sekunder lain
seperti tannin, terpen dapat menurunkan kemurnian DNA dan menghambat
menempelnya primer. Keberhasilan amplifikasi DNA menggunakan juga
 26

ditentukan oleh banyaknya enzim Taq polimerase. Menurut Latief (2014),

konsentrasi enzim Taq polymerase yang tinggi memberikan intensitas pita
DNA yang lebih tajam dibandingkan hasil amplifikasi dengan konsentrasi
enzim Taq polymerase DNA yang lebih rendah.
Menurut Langga (2012), hasil amplifikasi primer dan DNA template
berupa pita-pita DNA, dan semakin banyak sekuens yang dapat dikenali
oleh primer pada sebuah DNA template akan menghasilkan pita yang lebih
banyak. Intensitas pita DNA hasil amplifikasi oleh setiap primer sangat
dipengaruhi oleh kemurnian dan konsentrasi DNA cetakan. Hasil
amplifikasi berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat
tebal dan bersih serta pita DNA yang menyala seperti yang terlihat pada
gambar 4.1. Tidak munculnya pita DNA dengan penggunaan primer acak
menunjukkan bahwa amplifikasi yang dilakukan tidak berhasil
(gambar 4.2). Restu et al. (2012) menjelaskan tidak teramplifikasinya DNA
tersebut disebabkan karena kemungkinan masih terdapat senyawa sekunder
dan polisakarida sehingga menghambat kerja enzim dalam proses PCR.
 27

E. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum, didapat kesimpulan sebagai berikut :
1. Alat yang digunakan dalam praktikum bioteknologi yaitu: PCR,
centrifuge, Gel documenter, elektroforesis, spektrofotometer, waterbath,
mikropipet, tabung reaksi, beaker glass, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur,
hot plate, timbangan analitik, petridish, mortar dan pestel, vortex.
2. Bahan yang digunakan dalam praktikum bioteknologi yaitu: Tris-EDTA,
CTAB (Cethyl trimetyl ammonium bromide), Mercaptoetanol, CIAA,
Isopropanol, aquades, sodium asetat, loading dye, Floresafe/etidium
bromide, TAE/TBE, etanol.
3. Isolasi DNA terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi, purifikasi dan presipitasi
DNA.
4. Uji kuantitatif DNA merupakan uji untuk menentukan tingkat konsentrasi
DNA, menggunakan alat spektrofotometer. Uji kualitatif DNA merupakan
uji untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA serta keutuhan DNA
menggunakan alat eletroforesis.
5. Tahap penggandaan DNA dengan alat PCR yaitu denaturasi, annealing dan
extention.
 DAFTAR PUSTAKA

Ardiana D W. 2009. Teknik isolasi dna genom tanaman pepaya dan jeruk dengan
menggunakan modifikasi bufer ctab. Buletin Teknik Pertanian 14(1) : 12-16
Carsono N, Lukman P N, Damayanti F, Susanto U, Sari S. 2014. Identifikasi
polimorfis marka-marka molekuler yang diduga berkaitan dengan karakter
daya hasil tinggi pada 30 genotip padi. Chimica et Natura Acta 2(1) : 91-95
Diwyanto K. 2008. Pemanfaatan sumber daya lokal dan inovasi teknologi dalam
mendukung pengembangan sapi potong di indonesia. J Pengembangan
Inovasi Pertanian 1(3) : 173-188
Fitra A D N. 2012. Identifikasi pola haplotipe dna mitokondria udang jari
(Metapenaeus elegans) segara anakan kabupaten cilacap jawa tengah
menggunakan enzim restriksi hindIII. Thesis. UIN Malang
Langga IF, M Restu dan T Kuswinanti. 2012. Optimalisasi suhu dan lama
inkubasi dalam ekstraksi DNA tanaman bitti (Vitex cofassus Reinw) serta
analisis keragaman genetik dengan teknik RAPD-PCR. J Sains &
Teknologi 12(3): 265-276.
Latief Y dan Amien S. 2014. Studi awal pemanfaatan marka molekuler RAPD
untuk penentuan kebenaran tiga kultivar nilam. Bionatura 16(2): 109-113
Lucianus J. 2013. Introduksi genetika molekular virus. J Kedokteran Maranatha
3(1) : 1-6
Novitasari DA, R Elvyra dan DI Roslim. 2014. Teknik isolasi dan elektroforesis
DNA total pada Kryptopterus apogon (Bleeker 1851) dari Sungai Kampar
Kiri dan Tapung HilirKabupaten Kampar Provinsi Riau. JOM FMIPA 1(2):
258-261
Nugroho K, Terryana R T, Lestari P. 2015. Optimasi metode isolasi dna pada
Jatropha spp. J Agroteknologi 5(2) : 15-22
Restu M, Mukrimin, Gusmiaty. 2012. Optimalisasi teknik ekstraksi dan isolasi
DNA tanaman suren (Toona sureni Merr.) untuk analisis keragaman
genetik berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). J
Natur Indonesia 14(2): 138-142.
Riani S, Hindum I, Budiyanto M A K. 2015. Pengembangan media pembelajaran
berbasis multimedia interaktif untuk meningkatkan pemahaman materi
bioteknologi modern siswa kelas xii sma. J Pendidikan Biologi Indonesia
1(1) : 9-16
Riyadi I. 2008. Potensi pengelolaan bioprospeksi terhadap pertumbuhan ekonomi
indonesia. J Litbang Pertanian 27(2) : 69-73
Sasmito DEK, R Kurniawan dan I Muhimmah. 2014. Karakteristik primer pada
Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA: Mini
Review. Seminar Nasional Informatika Medis (SNIMed) V 2014, 6
 Desember 2014, Magister Teknik Informatika, Fakultas Teknologi
Industri, Universitas Islam Indonesia.
Syafaruddin, Tri JS. 2011. Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang
efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy
Shaw). J Littri 17(1): 11-17.
Triarjo, Rianto S, Muchsin A, Muljono E. 2016. Analisis kerusakan centrifuge
(xd-301) pada proses pemisahan uranil nitrat seksi 300 instalasi pcp. J
Pengelolaan Instalasi Nuklir 9(16) : 13-20
Wulandari M I, Hadisaputri Y E. 2016. Review : studi pustaka peralatan yang
digunakan untuk kultur sel. J Farmaka 4(4) : 209-222
Yusuf ZK. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek 5(6): 1-6.