BAB IV

ANALISIS DENGAN SPEKTROFOTOMETER

I. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat membuat kurva kalibrasi.
2. Mahasiswa mampu menganalisis sampel dengan menggunakan alat
spektrofotometer.

II. Dasar Teori

Spektrofotometri adalah metode analisis kimia berdasarkan interaksi
antara energi dengan materi. Alat yang digunakan disebut spektrofotometer.
Spektrofotometer dapat digunakan untuk menganalisa suatu senyawa secara
kuantitatif maupun kualitatif. Metode analisis yang umum digunakan adalah
spektrofotometer UV-Vis (Suharmanto, E. 2013:1).
Spektrofotometer merupakan metode alternatif yang diharapkan lebih
simpel dan relatif akurat jika dibandingkan dengan metode manual
menggunakan mikroskop. Lebih simpel karena tidak memerlukan metode
preparasi yang kompleks, dan lebih akurat karena menyertakan proses
kalibrasi dan standardisasi hasil perhitungan sehingga mampu mengurangi
efek bias (Zamani, P. 2016:40).

Gambar 6.1 Spektrofotometri UV-Vis

Unsur-unsur terpenting dalam spektrofotometri, yaitu :
1. Sumber-sumber lampu; lampu deutrium digunakan untuk daerah UV
dengan panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen
kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (panjang
helombang 350-900 nm).
2. Monokromator, digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang
monokromatis. Alatnya berupa prisma atau grating, yang berfungsi untuk
mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil pengamatan.
3. Kuvet, digunakan pada pengukuran di daerah tampak, kuvet kaca atau
kuvet kaca corex dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah
UV, harus menggunakan sel kuarsa, karena gelas tidak tembus cahaya di
daerah ini.
4. Detector, digunakan untuk memberikan respon terhadap cahaya pada
berbagai panjang gelombang.
5. Amplifer (penguat) dan rangkaian yang berkaitan, yang membuat isyarat
listrik dapat diamati.
6. Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya isyarat listrik (Sirait,
Rina, A. 2009:xxvii).

Gambar 6.2 Bagan optis instrumentasi spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri dibedakan menjadi beberapa jenis, yaitu :
spektrofotometri Vis, spektrofotometri UV, spektrofotometri IR, dan
spektrofotometri UV-Vis.
Spektrofotometri UV (Ultraviolet) merupakan salah satu metode yang
sering digunakan dalam analisis farmasi. Radiasi dari sinar ultraviolet dan
sinar tampak diabsorbsi oleh molekul organik aromatik, yang mengandung
elektron terkonjugasi dan atau atom yang mengandung elektron-n, yang
menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi
elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya
serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang
mengabsorpsi, sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Sirait
Rina, A. 2009:xx).
Spektrofotometri IR (Infra Red) adalah metode analisis instrumentasi
pada senyawa kimia dengan menggunakan radiasi sinar infra merah.
Spektrofotometri infra merah terdiri dari sumber cahaya, cermin difraksi,
kuvet (sel) rangkap, pemenggal, kisi, dan detector serta perekam jenis
spektroskopi inframerah yang secara meluas telah banyak digunakan dalam
analisis struktur atau analisis gugus fungsi kimia, khususnya senyawa
organik. (Sari, Ni Ketut. 2010:19).
Spektrofotometri UV-Vis (Ultraviolet-Visible) adalah salah satu teknik
analisis fisiko-kimia yang mengamati interaksi atom atau molekul dari suatu
zat kimia dengan radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dan
sinar tampak (380-780 nm) dengan menggunakan spektrofotometer (Roosita,
A. 2007:11).
Analisis dengan spektrofotometri UV-Vis melibatkan pembacaan
serapan radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik
yang diteruskan. Keduanya dikenal dengan serapan (A) tanpa satuan dan
transmitten dengan satuan persen (%T). Transmitten (%T) adalah
perbandingan intensitas dari sinar yang diteruskan (It) terhadap sinar yang
dipancarkan (Io) dalam persen. Serapan radiasi elektromagnetik oleh suatu zat
penyerap pada panjang gelombang monokromatis digambarkan oleh dua
hukum :
1. Hukum Lambert, yaitu intensitas radiasi yang diteruskan (I) menurun
secara eksponensial dengan meningkatnya tebal larutan b.
2. Hukum Beer, yaitu intensitas radiasi yang diteruskan (I) menurun secara
eksponensial dengan meningkatnya konsentrasi larutan c (Roosita, A.,
2007:16-17).

Kombinasi kedua hukum tersebut menghasilkan Hukum Lambert Beer

yang dirumuskan :
Io
A = log I =kxbxc

Io = Intensitas radiasi yang terjadi

A = Serapan
b = Konsentrasi larutan b (M)
c = Konsentrasi larutan c (M)
k = Daya serap (L/g/cm)
Panjang gelombang () terjadinya serapan bergantung pada kekuatan
elektron terikat dalam molekul. Panjang gelombang yang digunakan dalam
pengukuran serapan adalah panjang gelombang serapan maksimum (maks),
karena perubahan serapan untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar
 pada maks, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum
(Roosita, A. 2007:17).

III. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Beaker glass 100 ml (2 buah)
b. Pipet ukur 1 ml (1 buah)
c. Pipet ukur 10 ml (1 buah)
d. Ball filler (1 buah)
e. Labu takar 25 ml (1 buah)
f. Spektrofotometer genesys 10 UV
g. Pipet tetes (1 buah)
h. Kuvet (6 buah)

2. Bahan
a. Sampel
b. Larutan KMnO4
c. Aquades

IV. Skema Kerja

1 Pengenceran larutan KMnO4 0,05 M

Larutan baku 0,5 ml KMnO4 0.05 M Aquades 24,5 ml

diencerkan

Larutan baku KMnO4 10-3 M

Larutan baku KMnO4 20 ml 10-3 M Aquades 5 ml

diencerkan

Larutan baku KMnO4 8.10-4 M

 Larutan baku 18 ml KMnO4 8.10-4 M Aquades 7 ml

diencerkan

Larutan baku KMnO4 5,76.10-4

M

Larutan baku 15 ml KMnO4 5,76.10-4 Aquades 10 ml

M

diencerkan

Larutan baku KMnO4 3,456.10-4

M

Larutan baku 9 ml KMnO4 3,456.10-4 Aquades 16 ml

M

diencerkan

2 maksimum
Larutan baku
Mengukur absorsi untuk mencari KMnO4 1,244.10-4
M
Gambar 6.3 Skema Kerja Pengenceran Larutan KMnO 4 0,05 M
Larutan baku KMnO4 0,05 M

Diukur absorbansinya pada 500-560 nm

Didapatkan hasil maks dari absorbansi tertinggi pada 525 nm

3 Pengukuran absorbansi larutan dan membuat kurva kalibrasi
Gambar 6.4 Skema Kerja Pengukuran Absorbansi Untuk Mencari Maksimum

Mengukur absorbansinya masing-masing larutan hasil pengenceran pada maksimum

(525 nm)

Diperoleh data absorbansinya masing-masing konsentrasi

Membuat kurva kalibrasi dari hasil pengukuran konsetrasi degan absorbansinya

Gambar 6.5 Skema Kerja Pengukuran Absorbansi Larutan

4 Pengukuran absorbansi larutan sample

Larutan sample

Diukur pada maksimum (525 nm)

Diperoleh nilai absorbansinya

Gambar 6.6 Skema Kerja Pengukuran Absorbansi Larutan Standar
V. Analisis Data dan Pembahasan
1. V1 M1 = V2 M2 86,4 x 104
2. 0,5 x 0,05 = 25 x M2 10. M2 = 25
25 x 103
3. M2 = 25 11. M2 = 3,456 x 10-4 M
5. V1 M1 =V2 M2
4. M2 = 10-3 M 12. 9 x 3,456 x 10-4 = 25 x
5. V1 M1 = V2 M2
M2
6. 20 x 10-3 = 25 x M2
3 13. M2 =
20 x 10
7. M2 = 25 4
31,104 x 10
-4
8. M2 = 8 x 10 M 25
4. V1 M1 =V2 M2
9. 15 x 5,76 x 10-4 = 25 x 14. M2 = 1,244 x 10-4 M
M2
3. V1 M1 =V2 M2
6. 18 x 8 x 10-4 = 25 x M2
4
144 x 10
7. M2 = 25
8. M2 = 5,76 x 10-4 M
 9. Keterangan :
10. Konsentrasi Kuvet 1 = 1 x 10-3 M
11. Konsentrasi Kuvet 2 = 8 x 10-4 M
12. Konsentrasi Kuvet 3 = 5,76 x 10-4 M
13. Konsentrasi Kuvet 4 = 3,456 x 10-4 M
14. Konsentrasi Kuvet 5 = 1,244 x 10-4 M
15. Kuvet 6 = Sample
16.
 17. Tabel 6.1 penentuan panjag gelombang maksimal
18. 19. (nm) 20. Absorbansi 21. Keterangan
No (A)
22. 35. 500 48. 0,456 61.
1 36. 505 49. 0,540 62.
23. 37. 510 50. 0,560 63.
2 38. 515 51. 0,568 64.
24. 39. 520 52. 0,642 65.
40. 525 53. 0,720 66. Maksimal
3
41. 530 54. 0,687
25.
42. 535 55. 0,621
4 43. 540 56. 0,655
26. 44. 545 57. 0,692
5 45. 550 58. 0,647
27. 46. 555 59. 0,506
6 47. 560 60. 0,420
28.
7
29.
8
30.
9
31.
10
32.
11
33.
12
34.
13
67. Keterangan : 525 nm = maksimal
68.
69. Tabel 6.2 Pengukuran Absorbansi Larutan dengan Maks = 0,720
nm
70. 71. Konsentras 72. Absorbansi
No i (M) (A)
73. 79. 0,001 85. 0,720
1 80. 0,0008 86. 0,573
74. 81. 0,000576 87. 0,415
2 82. 0,000345 88. 0,255
75. 83. 0,0001244 89. 0,089
84. Sample 90. 0,578
3
76.
 4
77.
5
78.
6
91.
92.
93. Kurva kalibrasi Larutan KMnO4 dapat dibuat berdasarkan data
konsentrasi dan absorbansi tersebut adalah :
94.

Kurva Kalibrasi
0.8

f(x) = 719.98x
0.6
R = 1

0.4
Absorbansi

0.2

0
0 0 0 0 0 0 0

Konsentrasi

95. Gambar 6.6 Kurva Kalibrasi

96. Dari kurva kalibrasi tersebut dapat diketahui hubungan
antara absorbansi dengan konsentrasi yaitu melalui persamaan :
97. Y = 719,9846x
98. R2 = 0,9998
99. Berdasarkan persamaan kalibrasi yang telah didapatkan,
maka dapat diketahui nilai absorbansi dari larutan sampel yang telah
disediakan. Pada maksimum yaitu 525 nm, didapatkan nilai absorbansi
sampel sebesar 0,578 A. sehingga konsentrasi larutan sampel adalah
100. y = 719,9846x
101. 0,578 = 719,9846x
102. 0,0008027 =x
103. 8,027 x 10-4 M = x
104. Jadi nilai konsentrasi larutan sampel tersebut adalah 8,021
x 10-4 M.
 105.
106.
107.
VI. Kesimpulan dan Saran
A. Kesimpulan
1. Persamaan kurva kalibrasi didapatkan berdasarkan hubungan antara
konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya.
2. Pengukuran konsentrasi sampel yang belum teridentifikasi dapat diketahui
dengan perhitungan menggunakan persamaan kurva kalibrasi.
108.
B. Saran
1 Dalam proses pengenceran larutan KMnO4 sebaiknya dilakukan dengan
teliti agar didapatkan konsentrasi larutan yang diharapkan sehingga
didapat kurva kalibrasi yang sesuai referensi.
2 Berhati-hati dalam menggunakan alat spektrofotometri karena merupakan
alat elektronik yang digunakan untuk semua mahasiswa dalam praktikum.
3 Jauhkan larutan yang telah dimasukkan kedalam kuvet dari jangkauan kita
agar tidak terjatuh dan agar kita tidak membuat lagi dari awal.
109.
 110. DAFTAR PUSTAKA
111.
112. Karinda, M. (2013). Perbandingan Hasil Penetapan Kadar Vitamin C
Mangga Dodol Dengan Menggunakan Metode Spektrofotometri UV-Vis
dan Iodoiodimetri, Vol.2(1):86-89.
113. Roosita, A. 2007. Validasi Metode Spektrofotometri Visibel untuk
Penetapan Kadar Ampisilin Menggunakan Pereaksi Asetilaseton dan
Formalin. Yogyakarta : Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
114. Sari, Ni Ketut. 2010. Analisa Instrumentasi. Klaten : Yayasan
Humaniora.
115. Sirait Rina, A. 2009. Penerapan Metode Spektrofotometri Ultraviolet
pada Penetapan Kadar Nifedipin dalam Sediaan Tablet. Medan :
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
116. Suharmanto, E. 2013. Adaptif Probe Serat Optik Untuk Spektrofotometer
Genesys 10S UV-Vis Generasi Kedua, Vol. 2.
117. Zamani, N. (2016). Penggunaan Spektrofotometer Sebagai Pendeteksi
Kepadatan Sel Mikroalga Laut, 8(1):39-48.