Manfaat Terapi Stem Sel Induk Pluripoten pada Hipertensi Arteri Pulmonal

yang Diinduksi Monocrotaline

Abstrak
Hipertensi arteri pulmonal atau Pulmonary arterial hypertension (PAH) ditandai dengan
peningkatan progresif resistensi vaskuler dan remodeling arteri pulmonal. Akumulasi sel-sel
inflamasi di paru-paru dan peningkatan kadar sitokin inflamasi dalam aliran darah menunjukkan
bahwa inflamasi mungkin memainkan peran dalam PAH. Dalam penelitian ini, manfaat stem sel
induk pluripoten atau induced pluripotent stem cells (iPSCs) dan iPSC kondisi menengah atau
iPSC-conditioned medium (iPSC CM) diselidiki pada tikus PAH yang diinduksi monocrotaline
(MCT). Kami menunjukkan bahwa iPSCs dan iPSC CM secara signifikan mengurangi tekanan
sistolik ventrikel kanan dan memperbaiki hipertrofi ventrikel kanan pada tikus PAH yang
diinduksi MCT pada kedua model ini dapat mencegah dan menghambat progresivitas penyakit.
Pada pencegahan PAH yang dinduksi MCT, terapi berbasis IPSC menyebabkan penurunan
akumulasi inflamasi sel dan menyebaban down regulasi ekspresi IL-1, IL-6, IL-12, IL-12, IL-
23 dan gen IFN pada spesimen paru-paru, yang menyiratkan bahwa terapi berbasis iPSC
mungkin terlibat dalam regulasi inflamasi. Sinyal NF-kB berperan penting dalam kaskade
inflamasi, yang diaktifkan melalui fosforilasi molekul NF-kB. Dengan menggunakan inhibitor
kimia secara khusus menghalangi fosforilasi NF-kB, dan pada uji in vitro makrofag M1 manusia
menyiratkan bahwa efek anti-inflamasi dari terapi berbasis iPSC mungkin berkontribusi pada
gangguan aktivasi NF-kB. Di sini, kami menunjukkan bahwa terapi berdasar iPSC dapat
mengembalikan fungsi hemodinamik ventrikel kanan dengan manfaat untuk mencegah
peradangan yang sedang berlangsung di paru-paru tikus PAH yang diinduksi MCT dengan
mengatur fosforilasi NF-kB.

Pengantar
Pulmonary arterial hypertension (PAH) didefinisikan sebagai peningkatan progresif
resistensi pembuluh darah pulmonal yang menyebabkan kegagalan ventrikel kanan dan kematian
dini. Kerusakan endotel berhubungan dengan PAH, dimana tidak semestinya disekresikan
vasodilator atau vasokonstriktor dan produksi sitokin atau faktor pertumbuhan yang
mengakibatkan rekrutmen monosit yang berdiferensiasi menjadi makrofag ditempat terjadinya
lesi. Inflamasi perivaskular yang hebat disertai hipertrofi arteri media dan remodeling pembuluh
darah pulmonal telah diamati pada paru-paru tikus PAH yang diinduksi MCT. Peningkatan
sirkulasi sitokin dan level kemokin telah dilaporkan pada PAH. Terkait dengan pengobatan
inflamasi yang mendasar telah terbukti mengurangi gejala yang berhubungan dengan PAH.
Dengan demikian, hasil ini menunjukkan peran peradangan pada patogenesis PAH.
Makrofag yang dihasilkan dari sirkulasi monosit, selanjutnya berdiferensiasi secara klasik
menjadi makrofag M1 teraktivasi atau secara alternatif menjadi makrofag M2 terativasi
tergantung pada lingkungan peradangan. Polarisasi makrofag M1 secara in vitro menghasilkan
sitokin inflamasi (IL-1, IL-6, IL-12/23, dan TNF-) dan bertindak sebagai sel efektor yang
berpartisipasi dalam polarisasi respon imun Th1, sehingga menghancurkan matriks ekstraselular,
merangsang apoptosis, dan mempromosikan imunitas seluler terhadap parasit intraseluler dan
tumor.
Tidak ada obat untuk PAH. Terapi medis yang canggih secara substansial meningkatkan
tingkat kelangsungan hidup dan kualitas hidup pasien dengan PAH. Namun, banyak kasus yang
gagal bertahan. Remodeling pembuluh darah pulmonal dan penurunan mikrovaskuler dipandang
sebagai keunggulan dari PAH. Terapi sel regeneratif telah diusulkan sebagai pengobatan baru.
Dalam model PAH yang diinduksi MCT, sel-sel rogenitor endotel atau endothelial rogenitor
cells (EPCs) mencegah peningkatan tekanan sistolik ventrikel kanan, sedangkan hewan yang
diberi transduksi EPCs dengan endothelial nitric oxide synthase (eNOS) manusia
memperlihatkan kerugian yang signifikan dari PAH. Lebih lanjut, pemberian EPC awal telah
terbukti secara efektif mencegah timbulnya PAH pada tikus aritmia melalui mekanisme
pertahanan sistem imun yang berpotensi melibatkan stimulasi sel NK. Injeksi vena sublingual
dengan stem sel mesenchymal dari sumsum tulang atau bone marrow-derived mesenchymal
stem cells (BM-MSC) pada hewan coba tikus selama 2 minggu secara signifikan memperbaiki
kerusakan paru-paru dan jantung yang disebabkan oleh aliran dari kiri ke kanan akibat PAH,
mengakibatkan peningkatan angiogenesis dan penurunan tingkat remodeling pembuluh darah
paru dan inflamasi. Jenis stem sel tambahan telah diusulkan untuk pengobatan infark miokard
dan PAH, termasuk stem sel jantung intrinsik, stem sel embrionik (ESCs), dan stem sel
hematopoietik anak.
 Induced pluripotent stem cells (iPSCs) diprogram kembali dari sel somatik dewasa
melalui transduksi faktor transkripsi tertentu, Bukti menunjukkan bahwa iPSCs hampir tidak
dapat dibedakan dari ESCs. Penelitian telah menunjukkan efek perbaikan dari iPSCs melalui
mekanisme parakrin sesuai dengan fungsi jantung setelah infark miokard dan kerusakan oksidatif
retina. Menariknya, penelitian yang dilakukan oleh Chiou et al. menyimpulkan bahwa iPSCs
mengurangi keparahan kerusakan paru-paru akut akibat endotoksin atau kerusakan paru-paru
akibat ventilator melalui penekanan sinyal NF-kB (faktor inti kappa-light-chain-enhancer dari
sel B teraktivasi) dan akumulasi neutrofil.
Dalam penelitian ini, iPSCs digunakan sebagai terapi baru untuk pengobatan tikus PAH
akibat induksi MCT. Kami adalah yang pertama menyelidiki apakah terapi berbasis iPSC
bermanfaat pada fungsi hemodinamik ventrikel kanan dan peradangan pada PAH akibat induksi
MCT.

Bahan dan metode

Pernyataan etik
Percobaan hewan selama penelitian ini telah disetujui oleh Kelembagaan Komite
perawatan dan Penggunaan hewan, Rumah Sakit Umum Kaohsiung Veterans, Kaohsiung,
Taiwan; Prinsip-prinsip Perlindungan Perlakuan Hewan (Dewan Pertanian, Executive Yuan).
Persetujuan IACUC No. is vghks-2013-A010.
Komite Penelitian Manusia Rumah Sakit Umum Veteran Kaohsiung menyetujui protokol
penelitian. Dan, informed consent tertulis dari masing-masing individu telah diperoleh.

Kultur murine yang diinduksi stem sel pluripoten

iPSCs murine yang baik diberikan oleh Dr. Shih-Hwa Chiou. Mouse embrionic
fibroblasts (MEFs), digunakan sebagai sel feeder, dikultur untuk berkonfluens dan kemudian
diobati dengan 10 ug / mL mitomycin C selama 3 jam untuk menghambat proliferasi. Sel-sel
dibilas dengan 1X fosfat buffer. iPSCs ditanamkan ke lapisan feeder di medium DMEM [20%
serum bovine sapi (FBS), 100 U / mL penisilin, 100 ug / mL streptomycin, 2 mM GlutaMAX,
1X non-esensial asam amino (NEAA), 12 mM 4-(2-hidroksietil) asam -1-
piperazineethanesulfonic (HEPES), 1.2 mM natrium piruvat dan 0,0004% -mercaptoethanol]
dan diinkubasi pada 100% kelembaban dan 5% CO2. Medium kultur diganti setiap hari. Untuk
mendapatkan media IPSC-AC (IPSC CM) untuk pengobatan tikus PAH yang diinduksi MCT,
medium kultur diganti dengan serum bebas medium basal yang mengandung glukosa DMEM
tinggi ditambah dengan 10 mM NEAA dan 0,3% leukemia inhibitory factor (LIF); sel-sel
dikultur selama 48 jam.

Aktivitas Alkali Fosfatase

Aktivitas alkali fosfatase dari iPSCs terdeteksi dengan kit Alkaline Phosphatase (Sigma-
Aldrich, St Louis, MO USA). Sesuai instruksi dari sumbernya, iPSCs tumbuh di kaca penutup
yang difiksasi dengan larutan sitrat-aseton-formaldehida selama 30 detik pada suhu kamar. Sel-
sel dibilas dengan 1X PBS dan diinkubasi di larutan FRV-Alkaline selama 15 menit pada suhu
kamar. iPSCs terpapar dengan hematoxylin selama 2 menit. Slide penutup dibilas dengan air
kran dan dipasang di media pemasangan air.

Desain eksperimen
Tikus jantan dari strain SD seberat 200-250 gram yang dibeli dari BioLASCO Taiwan
Co, Ltd (Taipei, Taiwan R.O.C.). Model PAH hewan dicapai melalui injeksi subkutan MCT (60
mg / kg), sedangkan hewan kontrol hanya menerima PBS (1 mL). Untuk terapi berbasis IPSC,
tikus PAH yang diinduksi MCT diperlakukan baik dengan iPSCs atau IPSC CM. Tikus-tikus
yang menerima transplantasi iPSCs dibius melalui injeksi intramuskular Zoletil (40 mg / kg)
melalui vena ekor sekali per minggu dengan 2 x 106 iPSCs ditangguhkan di PBS (1 mL). Tikus-
tikus yang diobati dengan IPSC CM menerima suntikan intraperitoneal harian IPSC CM (1 mL)
sampai akhir penelitian.
Terapi berbasis IPSC bisa dibagi lagi menjadi protokol pencegahan atau protokol
reversal. Untuk protokol pencegahan, tikus diberi terapi berbasis IPSC pada hari yang sama
dengan injeksi MCT, berikut iPSCs yang ditransplantasikan sekali per minggu atau IPSC CM
setiap hari sampai akhir penelitian. Untuk protokol reversal, tikus mulai menerima iPSCs atau
IPSC CM setelah 14 hari dari MCT, dan administrasi iPSCs atau IPSC CM adalah sama seperti
di atas. Tikus PAH yang diinduksi MCT dibagi secara acak ke dalam pencegahan atau
pengobatan reversal.
Pengukuran Hemodinamik
Tekanan sistolik ventrikel kanan atau right ventricular systolic pressure (RVSP) dari
tikus diukur menggunakan instrumen PowerLab / 8SP (ADInstruments Ltd Dunedin, Selandia
Baru). Secara singkat, tikus dibius dengan Zoletil dan daerah dada dicukur dan disterilkan
dengan 75% etanol. Intubasi endotrakeal pada tikus dilakukan untuk mempertahankan fungsi
kardiopulmoner dari pembiusan selama operasi dan rekaman RVSP. Ventrikel kanan terekspos
dan kateterisasi dengan tabung polietilen yang diisi dengan heparinized PBS, yang terhubung ke
instrumen PowerLab / 8SP. RVSP ini direkam selama minimal 6 detik dengan gelombang
tekanan darah stabil untuk setiap tikus.

Imunohistkimia
Sel-sel tumbuh pada slide penutup yang dibilas dengan 1X PBS dan difiksasi dengan 4%
formaldehid (di 1X PBS) selama 15 menit. Sel-sel kemudian dibilas 3x (masing-masing 5 menit)
dengan 1X PBS. Sel-sel menjadi permeabel dengan larutan Triton X-100 (di 1X PBS) 0,05%
selama 10 menit dan dibilas 3x dengan 1X PBS (masing-masing 5 menit). Sel-sel diblok dengan
10% serum kambing normal (di 1X PBS) selama 1 jam. antibodi primer diencerkan pada media
blocking, dan sel-sel diinkubasi semalaman pada suhu 4C. Informasi mengenai antibodi yang
digunakan dijelaskan di tabel S1. Sel-sel dibilas 3x (masing-masing 5 menit) dengan 1X PBS
dan diinkubasi di antibodi sekunder fluorochromeconjugated selama 2 jam pada suhu kamar. Inti
kemudian terpapar dengan 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) selama 10 menit. Slide
penutup direndam dalam media pemasangan anti luntur dan dicitrakan menggunakan mikroskop
laser confocal.

Western blotting
Sampel protein (masing-masing 20mg) yang dimuat ke gel SDS-poliakrilamida dan
dihapuskan ke membran PVDF. Membran diblokir di BlockPRO blocking buffer (Visual
Protein Bioteknologi Corp, Taiwan) pada suhu kamar selama 30 menit. antibodi primer dan
sekunder diencerkan dalam blocking buffer sesuai dengan instruksi produsen '. Informasi
mengenai antibodi yang digunakan dijelaskan di tabel S1. Protein yang ditarget diinkubasi
semalam di antibodi primer pada suhu 4C. Membran dibilas sebentar di 1X PBS dan diinkubasi
di antibodi sekunder HRP-terkonjugasi pada suhu kamar selama 2 jam. Untuk deteksi sinyal,
membran dibilas 3x dalam 1X PBS (masing-masing 5 menit) dan kemudian diinkubasi dengan
Clarity Westren ECL Substrat (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA USA). Gambar-gambar
tersebut dikembangkan pada FUJIFILM super RX film medis (Fujifilm Holdings Corp, Jepang).

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Tingkat IL-1 (atau TNF) diukur menggunakan Human IL-1 beta (atau TNF alpha)
ELISA Siap SET--Go1 kit (eBioscience, INC., San Diego, CA USA) sesuai dengan instruksi
produsen. Penangkapan antibodi pra-pelapisan di desain seperti sumur pada 96-well plate pada
suhu 4 C semalaman. Antibodiyang didesain dicuci 5x (1 menit masing-masing) dengan 0,05%
Tween 20 di PBS dan diblok dengan pengencer 1X Assay pada suhu kamar selama 1 jam.
Sampel supernatan (100 mL) ditambahkan, dan antibodi yan didesain sumur diinkubasi pada
suhu kamar selama 2 jam. antibodi itu kemudian dicuci dan diinkubasi dengan antibodi deteksi
selama 1 jam. Sinyal dikembangkan dengan Avidin-HRP, dan reaksi dihentikan dengan larutan
2N H2SO4 (50 uL). intensitas sinyal terdeteksi menggunakan Fluoroskan Ascent FL
microplate Fluorometer (Thermo Scientific , MA USA).

Imunohistokimia
Bagian jaringan paru-paru dengan ketebalan 5 um yang dideparaffinisasi melalui xylene
rendam (2x 7 menit). Sampel direhidrasi dalam larutan etanol serial (100% sampai 50%, masing-
masing 2 menit). Untuk pengambilan antigen, sampel direndam dalam sitrat bufer mendidih yang
dipanaskan (10 mM asam sitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) selama 20 menit. Sampel didinginkan,
dibilas dengan 1X PBS, diblok dengan 10% serum kambing normal selama 30 menit, dan
diinkubasi dalam antibodi primer yang diencerkan dalam blocking buffer pada suhu 4 C
semalaman. Informasi mengenai antibodi yang digunakan dijelaskan di tabel S1. Sampel dibilas
sebentar dengan 1X PBS dan diinkubasi di horseradish peroxidase (HRP) -terkonjugasi antibodi
sekunder selama 2 jam. Sinyal terdeteksi melalui larutan 3,3'-diaminobenzidin (DAB). Inti
terpapar dengan larutan hematoxylin selama 5 menit. Bagian jaringan dibilas dengan 1X PBS
dan dipasang di Aquatex1 untuk pencitraan.