Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin/10 Maret 2014

Struktur dan Fungsi Subseluler Waktu : 07.00-11.00 WIB

PJP : Syaefudin, Ssi, Msi
Asisten : Puji Rahmadani
Syahrul Mustofa
Mustika Weni
Eva Selenia Desi

PENENTUAN PROTEIN METODE BRADFORD

Kelompok 12

Muhammad Fakhri Ramadhan G84120044

Aida Juniarti G84120014
Roazah Grammy Lestari G84120074

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
 PENDAHULUAN
Protein adalah polimer biologi berbentuk rantai molekul panjang yang
tersusun atas molekul-molekul kecil asam amino yang saling berikatan dengan
ikatan peptida. Asam amino sendiri merupakan molekul dengan gugus karboksil
(-COOH) dan amino (-NH2) terikat dengan gugus acak (-R). Perbedaan gugus
acak menentukan jenis asam amino serta menentukan protein yang terbentuk.
Gugus pada asam amino tersebut dapat berupa senyawa aromatik, rantai panjang
karbon, sulfida, amina, dan sebagainya (Underwood 2001). Protein sendiri
berfungsi banyak dikarenakan keragamannya. Antara lain sebagai enzim, senyawa
transport, protein kontraktil, protein regulator, katalisator, dan protein struktural.
Sifat fisika dan kimia dari protein hampir sama dengan asam amino,
monomernya. Protein memiliki bobot molekul besar, sehingga ketika dilarutkan
akan membentuk senyawa koloid, juga protein tidak dapat melalui membrane
semipermeabel dikarenakan sifatnya itu. Protein dapat menggumpal jika ditambah
alkohol atau diberi panas karena protein akan menarik mantel air yang
melingkupinya. Protein juga bisa mengalami denaturasi dan renaturasi yaitu
pemutusan ikatan-ikatan molekul pada protein dan penggabungan kembali ikatan
tersebut. Hal tersebut bisa diakibatkan pengaruh suhu, pH, dan logam berat.
Protein juga bersifat amfoter serta memiliki titik isolistrik dikarenakan memiliki
gugus karboksil sekaligus amina (Harold 2001).
Protein murni ataupun yang terdapat di dalam campuran dapat ditentukan
kadarnya dengan metode analisis kualitatif maupun kuantitatif. Metode kualitatif
meliputi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitropsida, dan
reaksi Sakaguchi. Sedangkan secara kuantitatif meliputi metode Kjaldehl, metode
kromatografi (cara fraksionasi), metode titrasi formol, metode Lowry, metode
spektrofotometri visible (biuret), metode spektrofotometri UV, dan metode
Bradford (Ambarsari et al. 2006).
Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel
dengan metode Bradford, yaitu dengan metode spektrofotometri menggunakan
kurva standar.
 METODE PRAKTIKUM
Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Biokimia. Waktu praktikum
yaitu hari Senin, tanggal 10 Maret 2014 pukul 07.00 11.00 WIB.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spektrofotometer,
gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet tetes, autopipet, labu
Erlenmeyer, alumunium foil, bulb, dan gelas pengaduk. Bahan-bahan yang
digunakan pada praktikum ini antara lain larutan standar Bovine Serum Albumin
(BSA), reagen Bradford, dan larutan NaCl.

Prosedur Percobaan
Pembuatan kurva standar. Enam tabung reaksi dibersihkan dan
dikeringkan, kemudian diberi label masing-masing tabung ke-1, 2, 3, 4, 5, 6.
Tabung ke-1 diisi 100 L larutan NaCl. Tabung ke-2 diisi campuran BSA 10 L
dan NaCl 90 L. Tabung ke-3 diisi campuran BSA 20 L dan NaCl 80 L.
Tabung ke-4 diisi campuran BSA 30 L dan NaCl 70 L. Tabung ke-5 diisi
campuran masing-masing BSA dan NaCl 50 L. Tabung ke-6 diisi 100 L larutan
BSA saja. Sebanyak 5 mL reagen Bradford ditambahkan ke dalam masing-masing
tabung reaksi. Semua tabung kemudian dikocok hingga homogen dan dibiarkan
kurang lebih 15 menit dengan penutup alumunium foil agar larutan tidak
menguap. Tabung ke-1 digunakan sebagai blanko. Kemudian semua tabung
diukur nilai absorbannya dengan memasukkan larutan ke dalam kuvet dan diukur
pada panjang gelombang 595 nm di spektrofotometer. Setelah itu dibuat kurva
hubungan antara absorban dan konsentrasi protein sebagai kurva standar.
Penentuan konsentrasi protein sampel. Larutan sampel protein
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diukur nilai absorbannya. Pengukuran
dilakukan dua kali. Nilai absorban yang diperoleh digunakan untuk menentukan
konsentrasi sampel. Konsentrasi sampel ditentukan dengan memasukkan nilai
absorban ke persamaan garis yang sudah diperoleh pada percobaan pertama.
 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konsentrasi serta nilai absorban untuk penentuan kurva standar dapat
dilihat pada tabel 1, kurva standar BSA dapat dilihat pada gambar 1, sedangkan
nilai konsentrasi protein sampel bisa dilihat pada tabel 2.

Tabel 1. Kurva Standar BSA

Tabung Konsentrasi mg/mL A
1 0 0
2 0,1 0,133
3 0,2 0,660
4 0,3 0,335
5 0,4 0,474
6 1 0,983

1.2

1 y = 0,138 + 0,8791x
0.8 R = 0,8721
absorbansi

0.6
Series1
0.4
Linear (Series1)
0.2

0
1 2 3 4 5 6
-0.2
konsentrasi (mg/mL)

Gambar 1. Kurva Standar BSA

Contoh perhitungan
a. Tabung 2
1 . 1 () = 2() . 2
 0,01 . 1 / = 0,1 . 2

2 = 0,1 /

Tabel 2. Konsentrasi Protein Sampel

Sampel Konsentrasi (mg/mL) A
1 0,8920 0,922
2 0,6771 0,733

Contoh perhitungan
= +
0,922 = 0,1378 + 0,8791
= 0,8920 mg/mL

Metode Bradford adalah salah satu metode dalam penentuan kadar protein
suatu bahan. Prinsip kerjanya didasarkan pada peningkatan secara langsung zat
warna Coomasie Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung
residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosin, triptofan, dan
fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Reagen CBBG bebas
berwarna merah kecoklatan (Imaks 465 nm), sedangkan dalam suasana basa reagen
CBBG akan berbentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru
(Imaks 595 nm). Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan
muatan positif yang ditemukan pada protein (Stoscheck 1990).
Metode Bradford banyak digunakan karena cara pewarnaannya yang
praktis dan memiliki nilai sensitivitas tinggi. Nilai sensitivitasnya empat kali dari
metode Lowry. Metode ini dapat mendeteksi sampel yang mengandung protein
kurang dari 0,01 mg/mL. Selain itu metode Bradford lebih cepat dan akurat,
melibatkan langkah-langkah pencampuran yang lebih sedikit, tidak memerlukan
pemanasan, dan memberikan respon kolorimetri lebih stabil dibandingkan dengan
metode lain (John 2009). Namun, respon reagen Bradford rentan terhadap
pengaruh nonprotein, khususnya detergen, dan menjadi semakin nonlinier pada
tinggi akhir konsentrasi berbagai protein yang berguna. Respon Bradford juga
bervariasi tergantung dari komposisi protein, sehingga dibutuhkan protein solusi
standar (Neide et al. 2003).
Reagen Bradford dibuat dengan melarutkan 0,025 g Coomasie Brilliant
Blue ke dalam 12,5 mL etanol 95%, kemudian ditambahkan 25 mL asam fosfat
85%. Larutan diencerkan dengan akuades hingga mencapai volume 250 mL dan
dihomogenkan. Selanjutnya disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam
botol gelap dan suhu rendah (Khopkar 2007).
Berdasarkan percobaan pembuatan kurva standar menggunakan blanko
untuk menghitung nilai dari transmitan atau absorban dasar didapatkan nilai
absorban yaitu 0; 0,133; 0,660; 0,335; 0,474; 0,983. Kenaikan nilai absorban
seharusnya semakin meningkat seiring dengan kenaikan konsentrasi dari BSA,
namun ternyata pada praktikum ini tidak demikian. Hal ini dapat disebabkan
tercemarnya BSA, NaCl, atau reagen Bradford. Selain itu dapat disebabkan
ketidaksesuaian takaran dalam pencampuran larutan yang akan diukur nilai
absorbannya. Sedangkan pada percobaan penentuan konsentrasi protein sampel
menggunakan kurva standar pada percobaan sebelumnya. Digunakan konsentrasi
protein sampel yang sama, kemudian setelah dimasukkan ke persamaan kurva
standar didapatkan dua nilai absorban yang tidak terlalu berbeda jauh, yaitu 0,922
dan 0,733.
SIMPULAN
Kadar protein dari suatu sampel bisa ditentukan dengan beberapa metode,
salah satunya metode Bradford. Metode Bradford menggunakan prinsip
spektrofotometri untuk melihat nilai absorban dan hubungannya dengan protein
yang diikat zat warna CBBG. Konsentrasi sampel bisa ditentukan setelah
membuat kurva standar dari percobaan.

DAFTAR PUSTAKA
Ambarsari L, Madayanti F, Moels MR, Akhmaloka. 2006 Pengaruh mutasi
D802N pada aktivitas polimerase DNA Pol I ITB-1. Sains & Teknologi
38A(2): 89-98.
Harold H, Craine LE, Hart DJ. 2001. Kimia Organik Edisi ke-11. Michigan (US):
Michigan State University.
John EC. Bradford for checking protein assay on mixed biological samples
(techniques and instrumentation in analytical chemistry). Elsevier Science.
19(8): 83-92.
Khopkar S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Press.
Neide KKK, Gonalves MM, Zaia CTBV, Zaia DAM. 2003. Determination of total
proteins in cow milk powder samples: a comparative study between the
Kjeldahl method and Spectrophotometric method. Journal of Food
Composition and Analysis 16(8): 507-516.
Stoschechk CM. 1990. Increased uniformity in the response of the coomasie blue
protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry 18(4) 111-116.
Underwood AL. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta (ID): Erlangga.