DIAGNOSA LABORATORIUM PENYAKIT VIRUS

1. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

a. Pengertian ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia
yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran
antibodi atau antigen dalam suatu sampel.ELISA telah digunakan sebagai alat
diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang
industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal
ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada
permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat
dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat
diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi,
saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel,
kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel
dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk
antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi
pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik
yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui
penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut
sandwich ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan,
membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga
dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang
berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci
dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi
yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan
substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang
menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama
menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif .
b. Beberapa keuntungan khususnya:
 1. Tes ELISA memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi
2. Hasil kuantitatif ELISA dapat dibaca secara visual
3. Sejumlah tes dapat dilakukan sekaligus : ELISA telah didesain secara spesifik
untuk men-screen (baca cepat, read) sejumlah besar spesimen sekali waktu,
menjadikannya cocok untuk digunakan dalam pengawasan dan sentralisasi
pelayanan transfusi darah
4. Reagen yang digunakan untuk ELISA stabil dan dapat didistribusikan ke
laboratorium distrik lain atau daerah lain
c. Kelemahan ELISA
1. Sebagian besar bahan baku untuk komponenELISA masih harus diimpor dari luar
negeri. Beberapa perusahaan komersial yang menjual perangkat dan komponen
ELISA di antaranya adalahAgdia Inc., Elkhart, Indiana, USA, dan Neurogen Inc.
(htttp://www.neogeneurope.com), Scotland.
2. Teknik dan sebagian komponen perangkat ELISAuntuk setiap patogen berbeda,
terutama Ab dankonjugat Ab-enzimnya, sehingga perlu dilakukanpenelitian
berkelanjutan secara bertahap gunamengembangkan teknik dan membuat
komponenELISA untuk masing-masing patogen.
d. Jenis-jenis ELISA
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim,
dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan
sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan
dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA
nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis
teknik.Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik
ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah
beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain : ELISA
Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich, dll.
a. Teknik ELISA nonkompetitif / ELISA Sandwich
 Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi (primer
dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan
dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA
nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct,
hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu
dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat
berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut
enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada
antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau
antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein.Pada ELISA
sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,
sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada
suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA
sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan
akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.
Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung
antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat menempel pada
bagian dinding lubang microtiter.Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang
antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang
microtiter.Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara
antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan.Selanjutnya, microtiter
kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi
penangkap.Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi
antibodi detektor, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara
antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor.Selanjutnya microtiter dibilas
lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi
spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang
 dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi detektor
yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat
sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi penangkap
yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter dan Afinitas dari antibodi
penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen Sebenarnya, teknik ELISA
sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA
direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi
detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan,
yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat
multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi
antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).
b. ELISA Direct
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini
seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada
sampel. ELISA direct menggunakan suatu antibody
spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan
pada sampel yang diuji.
Prinsip kerja Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel
yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat
menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter
dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang
microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke
dalam lubang- lubang microtiter sehingga antibodi dapat berinteraksi dengan
antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk
membuang antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen.
Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
 bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang
telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara
antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan
menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
1. Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan
enzim.
2. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
3. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi
pada percobaan yang berbeda.
4. Amplifikasi signal hanya sedikit.
5. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum
digunakan untuk uji ELISA direct
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
1. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi
2. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan
antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi

c. ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang
paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan
diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu
antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal
untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Prinsip Kerja ELISA indirect, pertama microtiter diisi dengan larutan yang
mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel
pada bagian dinding lubang microtiter.Selanjutnya microtiter dibilas untuk
membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter.Kemudian
larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam
lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan
 antibodi yang diinginkan.Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang
antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.Lalu, ke dalam lubang
microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim
signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibodi
yang diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal.
Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut
enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada
tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan
enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah
berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct
karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat
terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara
antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal, sedangkan
pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat
terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut
enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:
1. Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual bebas.
2. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh
penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada
wadah berbeda.
3. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki
beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder.
e. Prinsip ELISA
Sebagian besar metode ELISA dikembangkan untuk deteksi antigen atau antibodi
terdiri dari antibodi atau antigen yang cocok dengan yang dicari, yang kemudian
dibentuk dalam fase solid, seperti permukaan plastik dari plat polivinil atau tube
polistirene, di dalamnya sumuran yang dalam dari microdilution (cairan sejumlah
 mikro) atau di bagian luar dari plastik sferis atau bead (mirip seperti kelereng kecil)
yang terbuat dari logam. Sistem tersebut dinamakan Solid Phase Immonusrbent
Assay.
f. Prosedur Kerja ELISA
Secara langsung (baku) (Double Antibody Sandwich) (DAS ELISA). Dalam uji ini

digunakan konjugat gamma globulin murni dari antibody virus yang telah dilabel

dengan enzim.Konjugat ini hanya dapat digunakan untuk virus tertentu saja.

Prosedurnya sebagai berikut:

i. Gamma globulin (pengenceran yang telah disiapkan) dimasukkan ke dalam sumur-

sumur cawan elisa, masing-masing sebanyak 100-200 ul.
ii. Selanjutnya diinkubasikan selama 1 2 jam pada suhu 37oC, lalu buang larutannya
dan cawan ELISA dibilas dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing 3 menit.
iii. Contoh antigen (dilarutkan dalam PBST + PVP atau ekstrak buffer) dimasukkan ke
dalam sumur-sumur cawan ELISA, masing-masing 100 200 ul.
iv. Inkubasikan selama 1 2 jam pada suhu 37oC. Lalu buang larutannya dan cawan
Elisa dibilas kembali dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3
menit.
v. Enzim konjugat yang telah dlarutkan dengan konjugat buffer dengan perbandingan
tertantu dimasukkan dalam lubang-lubang cawan masing-masing sebanyak 100
200 ul.
vi. Inkubasikan selama 1 2 jam pada suhu 37oC. Lalu buang larutannya dan cawan
Elisa dibilas kembali dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3
menit.
vii. Siapkan substrat buffer kemudian larutkan PNPP ke dalamnya dengan
perbandingan 1:1 (ul/ml), masukkan larutan tadi kedalam lubang-lubang cawan
Elisa sebanyak 150 200 ul. Inkubasikan cawan Elisa pada suhu kamar. Lihat
perubahan warnanya setelah 30 60 menit. Pembacaan dapat dilakukan secara
langsung (visual) atau dengan Elisa Reader.
g. Komponen ELISA
 Antibodi. Ab adalah immunoglobulin (Ig) dari hewan yang diimunisasi Ag
patogen sasaran (AgP). Berdasarkan teknik produksi dan spesifisitas reaksinya, Ab
dibedakan menjadi Ab poliklonal (PAb) dan Ab monoklonal (MAb), sedangkan
menurut bentuk molekulnya dibedakan menjadi Ab dan F(ab)2. Ab juga dibedakan
menjadi Ab primer (AbP) dan Ab sekunder (AbS). AbP adalah Ab yang homolog
atau bereaksi dengan AgP, diproduksi dengan mengimunisasi hewan, seperti mencit
dan kelinci, dengan AgP. AbS atau anti-AbP adalah Ab yang diproduksi dengan
mengimunisasi hewan lain seperti kambing (goat) dengan AbP. Teknik produksi Ab
dan modifikasinya diuraikan secara rincioleh Ball et al. dan Jordan (Hampton et al.
1990).
Antigen.Ag yang digunakan sebagai AgP pada teknik ELISA adalah partikel
virus, sel bakteri, propagul jamur, atau senyawa protein dan polisakarida pathogen
yang antigenik, dapat merangsang timbulnya Ab pada hewan yang diimunisasi.AgP
digunakan sebagai kontrol positif pada uji ELISA. Cara pembuatan Ag virus dan Ag
bakteri dibahas masing-masing secara rinci oleh Brakke serta deBoer dan Schaad
(Hampton et al.1990).
Imunoprob (Immunoprobe). Imunoprob untuk ELISA dibuat dengan
mengkonjugasikan Ab dengan suatu enzim menjadi konjugat Ab-enzim.Konjugat
ini dapat dibuat dengan mengkonjugasikan AbP atau AbS dengan enzim tertentu.
Enzim yang digunakan untuk membuat konjugat beragam, yang paling umum adalah
Alkaline Phosphatase (AP) dan Horse-radishPeroxidase (HRP) (Converse dan
Martin 1990). Cara pembuatan imunoprob diuraikan secara rinci olehMacKenzie
(1990).
h. Reagen ELISA
Reagen lain yang diperlukan dalam ELISA adalahbufer, blocking reagent, dan
pelarut substrat. Bufer dasar yang paling sering digunakan dalam ELISA
adalahbufer fosfat (Phosphate-Buffered Saline, PBS) dan bufer karbonat. Bufer lain,
seperti bufer ekstraksi, buffer pencuci, bufer Ab, bufer konjugat, dan bufer
substratdibuat dengan menambahkan senyawa kimia tertentuseperti Tween-20,
polyvinylpirrolidone (PVP), dan2-mercaptoethanol pada bufer dasar. Senyawa
yangsering digunakan untuk blocking reagents adalahbovine serum albumin (BSA),
ovalbumin (OA), gelatin,susu skim, NaOH, dan asam sulfat (H2SO4)
(Lazarovits,1990).