Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
ABSTRAK
Telah dilakukan kajian efek sitotoksik hasil fraksinasi ekstrak etanol kulit buah asam
kandis (Garcinia cowa Roxb.) terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro, dengan
metode MTT. Prinsip kerja metoda MTT adalah kolorimetri dengan mengukur aktivitas
dehidrogenase mitokondria pada sel-sel hidup yang memiliki kemampuan untuk
mengkonversi MTT menjadi formazan. Pengujian fraksinasi heksan, etil asetat dan air
dilakukan dari konsentrasi 0,1 g/ml, 1 g/ml,10 g/ml, dan 100 g/ml. Dari hasil pengujian,
diperoleh nilai IC50 fraksi heksan, etil asetat dan air kulit buah asam kandis terhadap sel
kanker payudara T47D berturut-turut sebesar 3,53 g/ml, 0,59 g/ml, dan 3457,39 g/ml .
Hasil analisa statistik menunjukkan bahwa fraksi heksan dan fraksi etil asetat kulit buah asam
kandis (Garcinia cowa Roxb.) mampu menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D
secara signifikan pada konsentrasi 10 g/ml dan 100 g/ml.
Kata kunci: Garcinia cowa Roxb., sel kanker payudara T47D, Metode Microtetrazolium
(MTT)
PENDAHULUAN
METODE PENELITIAN
Alat yang digunakan untuk fraksinasi ukur, corong, spatel, pipet tetes, botol coklat,
berupa erlenmeyer berbagai ukuran, gelas vial, corong pisah, rotary evaporator.
Alat-alat yang digunakan untuk uji Bahan yang digunakan untuk fraksinasi
aktivitas sitotoksik berupa sarung tangan berupa ekstrak etanol kulit buah asam kandis,
karet, botol semprot, labu Erlenmeyer, gelas heksan, etil asetat, dan aquadest.
piala, flask T-25 (Iwaki), botol Duran, Bahan yang digunakan untuk uji efek
tabung Appendorf (Iwaki), pipet mikro sitotoksik yaitu sel kanker payudara manusia
(Ecopipette), hemasitometer, timbangan T47D, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol
analitik, autoklaf (Hirayama), lemari es 70%, air ultrapurifikasi, medium Roswell
(Nasional), inkubator 370C/5% CO2 Park Memorial Institute (RPMI) 1640
(Thermo Scientific), microbiological safety (Sigma-Aldrich), Fetal Bovine Serum (FBS)
cabinet air flow kelas II (Thermo (Sigma-Aldrich), Penicillin-Streptomycin,
Scientific), vortex (Etech), penangas air Trypsin-EDTA, Phosphate buffer Saline
(Memert), sentrifus (Thermo Scientific), (PBS) (Sigma-Aldrich), dan reagen 3-(4,5-
tabung sentrifugal, mikroskop inverted dimetilthiazol-2- il)-2,5- difeniltetrazolium
(Zeiss), plat 96 sumuran, dan bromida (reagen MTT).
spektrofotometer microplate (xMarkTM).
lapisan heksan terlihat jernih sehingga
Fraksinasi Ekstrak Etanol Kulit Buah diperoleh fraksi heksan. Hasil fraksi heksan
Asam Kandis diuapkan dengan rotary evaporator sehingga
Ekstrak etanol kulit buah asam kandis didapatkan ekstrak kental dari fraksi tersebut.
difraksinasi dengan heksan dan air dalam Lapisan air kemudian difraksinasi dengan etil
corong pisah, dikocok secukupnya. Setelah asetat dilakukan beberapa kali pengulangan
itu dibiarkan sampai terbentuk 2 lapisan yaitu seperti perlakuan diatas sehingga diperoleh
lapisan heksan dan lapisan air. Perlakuan ini fraksi air dan fraksi etil asetat. Hasil fraksi
dilakukan beberapa kali pengulangan sampai etil asetat diuapkan dengan rotary
79
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
80
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
Uji Proliferasi Sel (Uji MTT) ditentukan persentase sel yang terhambat
a) Peletakan Larutan Uji dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Plat uji yang telah berisi sel dan telah
diinkubasi selama 24 jam, dibagi menjadi 3 Rumus % viabilitas sel
bagian. Setiap bagian dirancang untuk empat
kali replikasi. Peletakan larutan uji dimulai
dari konsentrasi paling rendah. Pindahkan 20
l larutan uji ke dalam masing-masing sumur Dari % viabilitas sel ini,lalu dilakukan
kecuali sumur kontrol dan sumur blanko . perhitungan IC50. IC50 merupankan gambaran
Plat kembali diinkubasi selama 24 jam dalam efek sitiotoksik yang diberikan oleh fraksi,
inkubator 370C/ 5% CO2. Amati perubahan yaitu kadar yang dapat menghambat
yang terjadi pada sel selama masa inkubasi. proliferasi sel sebesar 50%.
Hubungan antara log konsentrasi
b) Peletakan Larutan MTT larutan uji dengan viabilitas sel dapat
Larutan MTT 5 mg/ml dipipet 20 l ditampilkan dalam bentuk grafik. Dari grafik
ke dalam masing-masing sumur. Inkubasi tersebut dapat ditentukan harga IC50 dengan
selama 3-4 jam pada 370C, 5% CO2. Setelah persamaan regresi linier dengan syarat r lebih
3-4 jam, akan terlihat adanya endapan ungu besar dari r tabel, kemudian masukan y = 50
kristal formazan. Medium yang mengandung pada persamaan regresi linier dan cari x nya
reagen MTT dibuang dengan cara dihisap kemudian dihitung, antilog dari konsentrasi
dari setiap sumur, sehingga yang tertinggal tersebut sehingga diperoleh IC50 (konsentrasi
hanya endapan ungu kristal formazan. yang dapat menghambat 50 pertumbuhan sel)
Larutkan endapan pada setiap sumur dengan larutan uji (CCRC, 2009).
100 l DMSO. Ukur serapannya dengan Selanjutnya, data hubungan antara
spektrofotometer micrroplate pada 550 konsentrasi sediaan uji dengan absorban
nm. dianalisis secara statistik menggunakan
analisa varian (ANOVA) satu arah yang
Analisis Data dilanjutkan dengan uji wilayah berganda
Dengan menggunakan data absorban Duncan (Duncans Multiple Range Test).
yang diperoleh dari pengukuran, dapat
81
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
Gambar 2. Grafik Hubungan Konsentrasi Fraksi Etil Vs % Viabilitas Sel Kanker Payudara
T47D
Gambar 3. Grafik Hubungan Konsentrasi Fraksi Etil Vs % Viabilitas Sel Kanker Payudara
T47D
82
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
Nilai IC50 didapatkan dari grafik Dengan demikian fraksi heksan dan
antara log konsentrasi larutan uji vs % fraksi etil asetat kulit buah asam kandis
viabilitas sel dengan persamaan regresi linier dinyatakan memiliki aktivitas sitotoksik
dengan syarat r lebih besar dari r tabel, terhadap sel kanker T47D, sedangkan pada
kemudian masukan y = 50 pada persamaan fraksi air tidak memiliki efek sitotoksik
regresi linier dan cari x nya kemudian terhadap sel kanker payudara T47D dengan
dihitung, antilog dari konsentrasi tersebut nilai IC50 di atas 20 g/ml.
sehingga diperoleh IC50. Sebelumnya telah dilakukan
Menurut The American National Cancer penelitian mengenai uji sitotoksik dari
Institute, suatu ekstrak dikatakan memiliki ekstrak etanol kulit buah asam kandis
aktivitas sitotoksik apabila nilai IC50 < 20 dengan nilai IC50 19,33 g/ml (Sutma,
g/ml (Lee & Houghton, 2005). Perlakuan 2012).
dengan fraksi heksan dan etil asetat juga Sehingga dari pernyataan tersebut
memberikan pengaruh terhadap marfologi dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 dari
sel. Sel yang hidup tampak masih banyak ekstrak etanol kulit buah asam kandis lebih
dan berbentuk seperti daun (Gambar 4 A), tinggi dibandingkan dengan nilai IC50 dari
sedangkan sel yang sudah mengalami hasil fraksinasi ekstrak etanol kulit buah
kematian tampak berbentuk bulat dan asam kandis dan bisa dikatakan bahwa hasil
mengapung (Gambar 4 B,C). Sementara fraksinasi dari ekstrak etanol kulit buah
farksi air (D) masih menyerupai control, asam kandis lebih besar khasiat nya sebagai
baik dari segi bentuk sel dan jumlahnya. Hal anti kanker dibandingkan dengan ekstrak
ini menunjukkan bahwa pemberian fraksi etanol kulit buah asam kandis tersebut.
heksan dan etil asetat dapat menginduksi Dari pemeriksaan metabolit yang
terjadinya kematian sel pada sel kanker telah dilakukan diketahui bahwa kulit buah
payudara T47D, sementara fraksi air tidak asam kandis mengandung senyawa fenolik.
menunjukan aktifitas sitotoksik. Senyawa fenolik dikenal dengan
aktivitasnya sebagai antioksidan.
Kemungkinan, efek sitotoksik dari kulit
buah asam kandis ini, salah satunya
berkaitan dengan kandungan fenoliknya.
Fenolik berperan sebagai antioksidan karena
dapat menangkap radikal bebas dengan
melepaskan atom hidrogen dari gugus
hidroksilnya. Pemberian atom hidrogen ini
akan menyebabkan radikal bebas menjadi
stabil dan berhenti melakukan gerakan
ekstrim, sehingga tak merusak lipida,
protein, dan DNA (materi genetik) yang
menjadi target kerusakan seluler. Dengan
mekanisme seperti itu, radikal bebas dapat
dihancurkan atau distabilkan yang pada
Gambar 4. Foto sel kanker payudara T47D akhirnya dapat menekan terjadinya kanker
di sumuran plate sebagai control (Shahidi, et al., 1995).
(A) dan diberi perlakuan dengan
fraksi heksan (B), fraksi etil b) Pengolahan data menggunakan
asetat (C) dan fraksi air (D), ANOVA satu arah
masing-masing pada Dari hasil pengolahan data
konsentrasi10 ug/mL menggunakan uji Analisa Varian (Anova)
(perbesaran 10x). satu arah yang membandingkan antara
persentase viabilitas sel kanker payudara
83
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
T47D dengan konsentrasi sediaan uji fraksi nyata antar kelompok konsentrasi sediaan uji
heksan kulit buah asam kandis didapatkan terhadap persentase viabilitas sel kanker
nilai yang signifikan (p = 0,002) < 0,05 payudara T47D.
dengan nilai F hitungnya 12,519, dan fraksi Hasil pengolahan data lanjutan yang
etil asetat kulit buah asam kandis didapatkan menggunakan uji wilayah berganda duncan
nilai yang signifikan juga yaitu (p = 0,001) < menunjukkan dua subset yang berbeda
0,05 dengan nilai F hitungnya 15,290, hal ini antara fraksi heksan kulit buah asam kandis
menunjukkan bahwa terdapat perbedaan pada kelompok yang memiliki konsentrasi
yang bermakna dari masing-masing 100 dan 10 g/ml dengan kelompok yang
konsentrasi sediaan uji dan menunjukkan memiliki konsentrasi 1 dan 0,1 g/ml, dan
bahwa pemaparan fraksi heksan dan fraksi demikian pula pada fraksi etil asetat kulit
etil asetat kulit buah asam kandis buah asam kandis menunjukkan dua subset
memberikan pengaruh yang berbeda nyata yang berbeda antara kelompok yang
antar kelompok konsentrasi sediaan uji memiliki konsentrasi 100 dan 10 g/ml
terhadap persentase viabilitas sel kanker dengan kelompok yang memiliki
payudara T47D. Sedangkan hasil yang konsentrasi 1 dan 0,1 g/ml, nilai persentase
didapat dari fraksi air kulit buah asam kandis viabilitas dari tiap subset menunjukkan
ternyata tidak signifikan yaitu (p = 0,169) > adanya penurunan, dimulai dari konsentrasi
0,05 dengan nilai F hitungnya 2,176, hal ini 0,1 g/ml sampai ke konsentrasi 100 g/ml.
menunjukkan bahwa terdapat perbedaan Sedangkan pada fraksi air kulit buah asam
yang tidak bermakna dari masing-masing kandis tidak memiliki perbedaan dan hanya
konsentrasi sediaan uji dan menunjukkan menunjukkan satu subset saja pada
bahwa pemaparan fraksi air kulit buah asam kelompok yang memiliki konsentrasi
kandis tidak memberikan pengaruh yang 100,10,1 dan 0,1 g/ml.
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Abcam. (2007). T47D (Human ductal breast American Cancer Society. Breast Cancer
epithelial tumor cell line) Whole Facts & Figures. (2009-2010).
Cell Lysate (ab 14899) data sheet. Atlanta: American Cancer Society,
http://www.abcam.com/index.html Inc.; 2009
data sheet = 14899, diakses American Cancer Society. Cancer Facts &
November 2012 Figures . (2010). Atlanta: American
Abcams, G.D. (1994). Gangguan Cancer Society; 2010.
pertumbuhan, proliferasi dan Burdall, E.S., Hanby M.A., Landsdown,
differensiasi sel. In S.A. Price, L.M. R.J.M., dan Speirs, V. (2003),
Wilson (Eds). Patofisiologi, konsep Bereast Cancer Cell Line, Breast
klinis proses-proses penyakit. (Edisi Cancer Res., 5(2): 89-95.
4). Buku I. Penerjemah: P. Burkill, I. (1966). A Dictionary of the
Anugerah. Jakarta: EGC. Economic Products of the Malay
84
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
Peninsula., 2nd ed. Ministry of Freshney, R.I., (2004), Animal Cell Culture,
Agriculture and Co-Operatives, A Practical Approach, 4th Ed. IRL
Kuala Lumpur, Malaysia. Press: Washington DC.
Campbell, A. N, J. B. Reece, L.G. Mitchell. Guyton, A. C. (1997). Buku ajar fisiologi
(2002). Biology. Erlangga. Jakarta kedokteran. Setiawan, I. (Ed IX).
Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG, and Jakarta : EGC.
Taylor MR. (2008). Biology. 4th Ed. , Guyton, A. C. & Hall, J. E. (2006). Buku
Addison Wesley World Student Ajar Fisiologi Kedokteran (Edisi X).
Series, San Fransisco. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran
CCRC. (2009). Prosedur Tetap Uji EGC.
Sitotoksik Metoda MTT. Hanahan,D., R. A. Weinberg,. (2000) The
Yogyakarta:. Fakultas Farmasi, Halfmark of Cancer, Cell, 100:57-
UGM. 70.
Clarke RB, Howell A, Anderson E. (1997). Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna
Breast Cancer Res. Treat., 45: 121- Indonesia. Jilid III. Jakarta: Yayasan
133. SaranaWana Jaya.
Corner, J. (2001). What is the cancer. In. J. Hirshaut & Pressman, (1992).
Corner C. Bailey Cancer nursing http://id.wikipedia.org. Diakses pada
care in context. Oxford : Blackwell tanggal 1 Oktober 2010.
Publishing. Jabit, Md. Lip, Wahyuni, F.S, Rozida, K.,
Darwito, Suwito. (2009). Omega-3 dan Ahmad, I.D., Khozirah, S., Lajis
Kanker Payudara. Nordin H, & Johnson, S. (2009).
http://darwitosuwitosaridinsangpemb Cytotoxic and nitric oxide inhibitory
aharu.blogspot.com/2009/03/pengerti activities of methanol extracts of
an-kanker-payudara-kanker. html. Garcinia species. Pharmaceutical
(diakses tanggal 27 November 2012). Biology. 47(11): 10191026.
Departemen Kesehatan, (2009). Profil Jena, B. S., Jayaprakasha, G. K., and
Kesehatan Indonesia 2008. Jakarta: Sakariah, K. K. (2002). Organic
Departemen Kesehatan RI acids from leaves, fruits, and rinds of
Djajanegara, I. & Wahyudi, P. (2010). Uji Garcinia cowa. Journal of
Sitotoksisitas Ekstrak etanol Herba Agricultural and food chemistry 50
ceplukan (Physalis angulata Linn.) (12): 3431-3434.
terhadap Sel T47D secara In Vitro. J. Jochems, Carlo. (2009). Fetal Bovine
Ilmu Kefarmasian Ind. 8, (1), 41-47. Serum: Are Cell Cultures Cruelty
Dipiro Joseph., Talbert, Robert L., Yee, Free. Diakses dari: http://www.all-
Gary C (2008). Pharmacotherapy: A creatures.org/clct/ar-fetal.html.
Pathophysiology Approach (7th Diakses tanggal: 29 Mei 2012.
Edition). New York: The Mc Graw- Jong, Wim de. (2004). Kanker, apakah itu?
Hill Companies Inc. pengobatan, harapan hidup dan
Dipiro Joseph T., Barbara G.Wells, Terry dukungan keluarga. Terjemahan:
L. Schwinghammer and Cecily V. Astoeti Suharto Heerdjan, Arcan:
(2009). Pharmacotherapy Handbook, Jakarta. Hal 2-16.
2009, 7th Edition. New York: The Kasugai S, Hasegawa N and Ogura
Mc Graw-Hill Companies Inc. H.(1991). Application of the MTT
Doyle, A., dan Griffiths, J. B. (2000). Cell colorimetric assay to measure
and Tissue Culture for Medical cytotxic effect of phenolic compound
Research. John Willey and Sons Ltd. on established rat pulp cells. J. Dent
: New York. Res. 70: 127-130.
Kenji, M., Yukihiro, A., Emi, K., Tetsuro, I.,
Kenji, O., Toshiyuki, T., Munekazu,
85
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
86
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
87