BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 MetodeValidasi

Sebelum dilakukan metode analisis, terlebih dahulu dilakukan validasi.Validasi

metode analisis merupakan suatu tindakan yang dilakukan sebagai pembuktian terhadap
parameter-parameter tertentu yang dipersyaratkan dan ditetapkan sehingga analisis
yang dilakukan mendapatkan hasil yang diinginkan. Suatu metode analisis baru dapat
digunakan apabila telah dilakukan validasi. Hal ini karena adanya perbedaan alat,
keterbatasan alat, bahan kimia atau kondisi lain yang menyebabkan metode tersebut
tidak dapat diterapkan secara keseluruhan. Sehingga sering dilakukan modifikasi,
penyederhanaan maupun perbaikan metode, akibatnya metode tersebut harus divalidasi
dengan cara yang benar. Apabila metode ini dapat dipertanggungjawabkan secara
keseluruhan (presisi, akurasi, selektivitas, batas deteksi, batas kuantitasi, stabilitas dan
lain-lain), tidak menyimpang, dan diakui oleh pihak yang berkompeten, maka metode
yang dimodifikasi ini dianggap valid dan dapat digunakan untuk analisis rutin.1

Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode

analisis diuraikan dan didefinisikan sesuai dengan cara penentuannya. Parameter yang
digunakan ialah batas deteksi dan kuantitasi, presisi, akurasi, dan linearitas. Selain itu
digunakan pula parameter keterulangan (repeatability) dan ketangguhan (rudgedness).
Batas deteksi ialah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang
masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi
merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis
renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat
memenuhi criteria cermat dan saksama.2 Validasi terhadap suatu metode analisa
menjadi factor penting karena hanya metode analisa yang telah dibuktikan validitasnya
maka hasil pengukurannya bias dipertanggungjawabkan dan dipergunakan sebagai
landasan dalam perhitungan berikutnya. Beberapa parameter dalam melakukan validasi
tersebut meliputi linieritas, selektivitas, ketelitian, ketepatan, limit of detection dan limit
of quantification.3
II.2 Parameter Validasi
Parameter validasi antara lain adalah kecermatan (akurasi), keseksamaan
(presisi), selektivitas, linearitas dan rentang, batas deteksi (LOD) dan batas kuantitas
(LOQ), ketangguhan metode, kekuatan metode.4
a. Linieritas

Parameter linieritas menggambarkan hubungan yang linier antara

konsentrasi dan serapan sehingga persamaan yang diperoleh dapat dipergunakan
untuk menghitung konsentrasi zat aktif dalam sampel yang diketahui
serapannya.5 Linearitas ialah kemampuan metode analisis yang memberikan
respons secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematika yang
baik dan proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas
biasanya dinyatakan dalam variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung
berdasarkan persamaan matematika menggunakan data yang diperoleh dari hasil
uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Persamaan
dinyatakan dengan rumus y = a + bx, dengan a ialah intersep, b ialah
kemiringan garis dengan koefisien korelasi 0,9995.6

b. Selektifitas
Parameter selektivitas menggambarkan kemampuan metode analisa untuk
memisahkan zataktif dari komponen lainnya.5 Selektifitas metode dapat
ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs) dengan persamaan :7

Dimana:

RtA= waktu retensi puncak pertama

RtB = waktu retensi puncak kedua

WA = lebar alas puncak pertama

WB = lebar alas puncak kedua

c. Limit of detection (LOD) dan Limit of quantification (LOQ)
Limit of detection menggambarkan jumlah minimal yang mampu dideteksi
oleh metode analisa dan limit of quantification menggambarkan jumlah minimal
yang mampu dideteksi oleh metode analisa yang dapat dipertanggungjawabkan
secara kuantitatif.5 Data yang diperoleh dari konsentrasi tiap analit yang
memberikan absorbansi berbeda diolah untuk menentukan batas deteksi (LOD)
dan batas kuantitas (LOQ).8 Limit deteksi (LOD) digunakan untuk melihat
kosentrasi terendah yang masih dapat terdeteksi oleh suatu alat.9 Batas deteksi
dihitung berdasarkan persamaan kurva baku yang sudah diperoleh. Limit of
Detection menggambarkan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang masih
dapat diukur. Limit of Quantification menggambarkan
konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat
dianalisis dengan presisi dan akurasi di bawah kondisi
percobaan tertentu.10 Batas deteksi (Limit of
Detection/LOD) dan batas kuantitas (Limit Of
Quantitation/LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus :11
SY =
LOD
LOQ

d. Presisi (Teliti)

Ketelitian menggambarkan kedekatan hasil uji dalam beberapa kali

pengulangan.5 Presisi ialah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antar
hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata
jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari
campuran yang homogen. Presisi dibagi menjadi tiga, yaitu keterulangan
(repeatability), ketertiruan (reproducibility), dan presisi antara (intermediate
precision). Keterulangan ialah presisi metode jika dilakukan berulang kali oleh
analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek.
Ketertiruan ialah presisi metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang
berbeda pada kondisi berbeda. Presisi antara merupakan ukuran ketertiruan pada
kondisi operasi normal antara laboratorium dan antaranalis.12 Luas puncak yang
 diperoleh kemudian ditentukan simpangan baku (SD) dan simpangan baku
relatifnya (RSD) :13

Presisi seringkali diukur sebagai persen Relative Standard Deviation

(RSD) atau Coefficient of Variation (CV) untuk sejumlah sampel yang berbeda
bermakna secara statistik.14 Kadar sampel ditetapkan berdasarkan kurva baku
yang sudah diperoleh. Selanjutnya dihitung kadar rata-rata, SD dan CV. Metode
dinyatakan teliti jika CV 2%.15

e. Akurasi (Tepat)

Ketepatan menggambarkan kedekatan hasil uji dengan nilai yang

sesungguhnya.5 Akurasi ialah ukuran yang menunjukkan kedekatan nilai hasil
analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai
persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan
ditentukan dengan dua cara yaitu, metodesimulasi (spiked-placebo recovery)
dan metode penambahan standar (standard addition method).16 Pengujian
dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit murni kedalam campuran
pembawa. Kemudian campuran dianalisis dan hasilnya dibandingkan terhadap
kadar analit yang ditambahkan (kadar sebenarnya). Kriteria tepat diberikan jika
hasil analisis memberikan perolehan kembali antara 98-102%. Jumlah analit
yang ditambahkan ke dalam sampel atau selisih antara rata-rata dan nilai
sebenarnya yang dapat diterima menunjukkan ketepatan. Dalam hal ini
ketepatan dihitung sebagai persen recovery (perolehan kembali).17 Range
tersebut bersifat fleksibel tergantung dari kondisi analit yang di periksa
berdasarkan jumlah sampel dan kondisi laboratorium.18
II.10 Validasi metode

II.10.1 Pengertian Validasi metode

Validasi metode analisis merupakan suatu proses untuk menilai suatu metode dan membuktikan
bahwa metode tersebut sudah cocok untuk tujuannya. Penilaian tersebut dapat dilihat dengan
menggunakan parameter-parameter tertentu yang berdasarkan percobaan di laboratorium (49).

a. Akurasi

Akurasi merupakan suatu prosedur analisis untuk melihat ketelitian metode analisis atau
kesesuaian antara nilai yang diperoleh dari hasil analisis dan nilai sebenarnya (50).

Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali. Akurasi dapat ditentukan dengan dua cara,
yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) dan metode penambahan baku (standard
addition method). Metode penambahan baku dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah
baku standar ke dalam sampel. Sebelumnya sampel telah dianalisis terlebih dahulu. Selisih 21
kedua hasil yang didapat dibandingkan dengan kadar sebenarnya baku standar yang ditambahkan
(49).

b. Presisi

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual,
diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang
pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen(49). Kriteria seksama diberikan
jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koevisien variasi 2% atau kurang. Akan
tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah
sampel, dan kondisi laboratorium.

Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit
yang dianalisis. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya
konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih standar deviasi relatif antara laboratorium adalah
sekitar 2,5%, pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) Relative Standard
Deviation (RSD)nya adalah 16%, dan pada kadar part perbilion (ppb) adalah 32%. Pada metode
yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih kecil atau sama dengan < 2%
(49).

c. Linearitas

Linearitas menggambarkan kemampuan suatu metode analisis untuk mendapatkan hasil uji yang
secara langsung proporsional konsentrasi kurva baku dengan analit di dalam sampel. Pengukuran
linearitas dapat dilakukan langsung pada analit atau dapat dilakukan pada sampel yang telah
ditambah baku standar. 22
Linearitas dapat dilihat dengan dua cara, yaitu secara evaluasi lansung pada garis persamaaan
kurva baku dan secara statistika menggunakan regresi linear (50).

Pengukuran linearitas dilakukan dengan cara membuat seri baku standar terlebih dahulu. Seri
baku yang dibuat biasanya memiliki rentang antara 50-150% dari kadar analit di dalam sampel.
Suatu metode analisis dikatakan linear apabila memenuhi persyaratan nilai koefisien korelasi (r)
0,999 linear (50).

d. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Batas deteksi (LOD) adalah konsentrasi terendah yang masih dapat terdeteksi. Batas deteksi
dapat dipeoleh dari kalibrasi yang diukur sebanyak 6 sampai 10 kali. Batas kuantitasi (LOQ)
adalah jumlah terkecil yang masih dapat diukur dalam kondisi percobaan yang sama dan masih
memenuhi kriteria cermat (50,51).

Validasi metode merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada prosedur
penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan
untuk penggunaannya(49). Penelitian ini menggunakan spektofotometer ultraviolet sebagai metode
yang digunakan pada pengukuran kadar NAF dalam pengujian efisiensi penjeratan, pengukuran
kadar NAF dalam sediaan gel dan pengujian penetrasi secara in vitro. Karena metode ini
memiliki banyak keuntungan antara lain dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam jumlah
kecil, pengerjaannya mudah, sederhana, cukup sensitif dan selektif, biayanya relatif murah serta
mempunyai kepekaan analisi cukup tinggi(57). 25

Parameter analisis yang ditentukan pada uji validasi adalah akurasi, presisi, linearitas, limit
deteksi ( LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) (50).