Abstrak
Metoda uji aktivitas enzim kolagenase tidak sepenuhnya dapat digunakan untuk uji
enzim yang sama pada organisme yang berbeda. Metode uji aktivitas enzim mengacu pada
Moore dan Stein (1954). Optimalisasi uji aktivitas enzim kolagenase dilakukan agar dapat
diperoleh data aktivitas enzim kolagenase yang valid. Optimalisasi uji ini dilakukan dengan
memodifikasi konsentrasi reagen yang digunakan dalam uji aktivitas enzim. Tujuan dari
penelitian ini adalah menentukan uji aktivitas enzim kolagenase dari organ dalam bandeng
(Chanos chanos, Forskal). Dari hasil penelitian, diperoleh konsentrasi dan volume reagen yang
digunakan dalam uji aktivitas enzim kolagenase yaitu 5 ml substrat kolagen; 1 ml buffer tris
50 mM dengan CaCl2 5 mM; 0,2 ml enzim kolagenase; TCA 0,5% sebanyak 0,2 ml; 1 ml
ninhidrin 0,2%; isopropanol 50% sebanyak 5 ml.
PENDAHULUAN
Berbagai macam metode digunakan untuk memperoleh data aktivitas enzim yang
akurat. Bila penelitian utama adalah purifikasi enzim atau biokimia klinis enzim, maka
penelitian akan terfokus pada kondisi optimal aktivitas enzim dan data yang diperlukan
adalah keseluruhan substrat dan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim seperti pH
optimal, temperature, buffering agent, ionic strength dan substrate instability. Bila focus
penelitian adalah kinetika reaksi enzim, maka data yang diperlukan adalah kecepatan
katalisasi reaksi enzim. Hal yang lebih penting lagi adalah penentuan metode aktivitas enzim
yang dapat diperoleh dari literature atau penelitian pendahuluan (Allison 1996).
Uji aktivitas enzim tergantung pada asal enzim, jenis substrat, tujuan dari uji enzim
(Allison 1996). Hal tersebut dikarenakan enzim merupakan biokatalisator yang bekerja
dengan spesifitas yang tinggi sehingga metode uji aktivitas berbeda, reagen yang
digunakan, konsentrasi reagen dan volume reagen yang digunakan serta modifikasi lain
(Beynon dan Bond 2001). Metode uji aktivitas enzim kolagenase (EC 3.4.24.X dan EC
3.4.21.X) juga berbeda-beda. Nathery et al. (2004) menggunakan metode spektrofotometri
pada panjang gelombang 590 nm dan pewarna commasiie blue untuk menentukan uji
aktivitas enzim kolagenase dari 5-10 g kolagenase bakteri dan hewan mamalia selama 2
jam. Lim et al. (1993) menentukan aktivitas kolagenase menggunakan radioaktif [14C].
Uji aktivitas enzim kolagenase dari Moore dan Stein (1954) digunakan pada uji
aktivitas enzim kolagenase dari ikan makarel (Scromber japanicus) (Park et al. 2002) dan ikan
METODE
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan pada penelitian adalah organ dalam bandeng fase
post rigor yaitu pilorik kaeka, hepatopankreas dan usus. Kolagen untuk substrat enzim, dibuat
dari kulit ikan bandeng dengan metode Lestari (2005). Bahan-bahan kimia yang digunakan
adalah Triton-X 100, CaCl2, asam trikloro asetat, L-leusin, 1-propanol, dan pereaksi
Bradford. Logam-logam yang digunakan untuk karakterisasi yaitu NaCl, CaCl2, MnCl2 dan
CoCl2, inhibitor yang digunakan adalah EDTA, PMSF dan pepstatin. Peralatan yang
digunakan antara lain spektrofotometer sinar tampak, sentrifus dingin, shaker inkubator, oven,
mikropipet, homogenizer.
Metode Penelitian
Ektraksi enzim kolagenase diperoleh dari organ dalam bandeng, mengacu pada
metode Kim et al. (2002) yang dimodifikasi. Substrat kolagen terbuat dari kulit bandeng.
Pada penelitian ini akan dilakukan modifikasi konsentrasi ninhidrin, konsentrasi TCA dan
jumlah enzim kolagenase yang ditambahkan secara bertahap.
Optimalisasi metode uji aktivitas kolagenase mengacu pada metoda spektrofotometri
(Moore dan Stein 1954, diacu dalam Kim et al. 2002) yaitu sebanyak (0,2; 5; 10) ml larutan
kolagenase ditambah dengan 5 mlml kolagen dan 1 ml 0,05 mM tris-HCl pada pH 7,5 yang
mengandung 5 mM CaCl2. Reaksi ini dilakukan pada suhu 37 C selama 1 jam. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 0,2 ml; (0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 50)% TCA. Setelah 10 menit
pada suhu ruang, larutan disentrifus pada 1.800 rpm selama 20 menit. Supernatan, sebanyak
0,2 ml dicampur dengan 1,0 ml larutan ninhidrin (0,2; 0,5; 1; 1,5; 2%), diinkubasi pada suhu
100 C selama 20 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Campuran kemudian
ditambah dengan 5 ml 50% 1-propanol dan diukur serapannya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer Tris-HCl digunakan
sebagai blanko, dan L-leusin digunakan sebagai standar (asam amino hasil hidrolisis
kolagenase). Satu unit aktivitas kolagenase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
menyebabkan perubahan 1 mol substrat per menit.
Aktivitas
Kode TCA Ninhidrin Enzim Absorban rata-rata
(unit/waktu)
AAA 0,2 0,1 0,2 0,039 0,179
ABA 0,2 0,2 0,2 0,473 3,049
ACA 0,2 0,5 0,2 1,783 11,713
BAA 0,5 0,1 0,2 0,040 0,185
BBA 0,5 0,2 0,2 0,377 2,414
CCA 0,5 0,5 0,2 1,999 13,142
AAB 0,2 0,1 5 0,010 ttd
AAC 0,2 0,1 10 0,011 ttd
ABB 0,2 0,2 5 0,037 0,165
ABC 0,2 0,2 10 0,037 0,165
ACB 0,2 0,5 5 0,090 0,516
ACC 0,2 0,5 10 0,100 0,582
BAB 0,5 0,1 5 0,018 0,040
BAC 0,5 0,1 10 0,015 0,020
BBB 0,5 0,2 5 0,048 0,238
BBC 0,5 0,2 10 0,053 0,271
BCB 0,5 0,5 5 0,085 0,483
CCC 0,5 0,5 10 0,129 0,774
KESIMPULAN
Uji aktivitas kolagenase metoda Moore dan Stein (1954) dapat diterapkan pada uji
aktivitas enzim kolagenase dari organ dalam bandeng, tetapi memerlukan modifikasi.
Modifikasi yang dilakukan adalah konsentrasi TCA sebesar 0,5%, konsentrasi ninhidrin
sebesar 0,2% dan jumlah enzim 0,2 ml.
DAFTAR PUSTAKA
Allison RD. 1996. Current Protocols in Protein Science: New York, John Wiley & Sons, Inc.
Beynon RJ, Bond JS. 2001. Proteolisis Enzymes: a Practical Approach. New York: Oxford
University Press.
Biscak TA, Harper E. 1984. Purification and Characterization of Tadpole Back-skin
Collagenasewith Low Gelatinase Activity. The Journal Of Biological Chemist 259 (21):
13145-13150.
Bleeg HS. 1976. Collagenolytic enzymes assayed by spectrophotometry with suspensions of
reconstituted collagen fibrils. Biochem. Biophys. Acta 445(3): 753-62.
Byun HG, Park JP, Sung NI, Kim SK. 2002. Purification and characterization of a serine
proteinase from the tuna piloric caeca. J Food Biochem 26(6): 479-494.
Chondrex, Inc. 2008. Collagenase Assay Kit. Catalog # 3001 and 3002. USA.
Kim SK, Park PJ, Kim JB dan Sahidi F. 2002. Purification and characterization of a
collagenolytic protease from filefish (Novodon modestrus). J. Biochem Mol Bio 35(2):
165-171.
Lim DV, Jackson RJ, Von Gruenigen. 1993. Purification and assay of bacterial collagenases.
Journal of microbiologi methods 18(3): 241-253.
Nathery A, Lyons JG, Grady RLO. 1984. A spectrophotometric collagenase assay. Analitical
Biochemistry 159: 390-395.
Park PJ, Lee SH, Byun HG, Kim SH, Kim SK. 2002. Purification and characterization of a
collagenase from the Mackarel, Scomber japonicus. J Biochem Mol Bio. 35(6): 576-582.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: IPB.
Yuniarti T, Nurhayati T, Jacoeb AM. 2010. Purifikasi dan karakterisasi kolagenase dari organ
dalam bandeng (Chanos chanos Forskal). Biota. 15(3): 379-384