High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)
Indah Solihah
 HPLC
Merupakan teknik pemisahan senyawa
dengan cara melewatkan senyawa melalui
fase diam (stationary phase)

Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi

dengan fase gerak (mobile phase)

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom

atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga
akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-
wa dengan fase diam dan fase gerak
 HPLC
Senyawa yang keluar dari kolom akan
dideteksi dengan detektor yang sesuai dan
dilaporkan sebagai kromatogram

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu

retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

Untuk:
- analisis kualitatif digunakan informasi tR,
- analisis kuantitatif digunakan informasi luas
area/tinggi puncak kromatogram
Kualitatif vs Kuantitatif
 Kegunaan HPLC :
Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik,
maupun seny.biologis
Analisis ketidakmurnian (impurities)
Analisis senyawa tdk mudah menguap (non volatile)
Penentuan molekul2 netral, ionik, maupun zwitter
ion
Isolasi dan pemurnian senyawa
Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir sama
Pemisahan seny2 dlm jml sekelumit (trace
elements)
Menetapkan kadar seny2 tertentu
 Kelebihan HPLC
KCKT dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan senyawa
berbobot molekul tinggi.
KCKT dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian
besar non volatile.
KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman
bagi senyawa yg tidak tahan panas
Pada KCKT kemungkikan antaraksi antara fase gerak dan
linarut besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen dan
reaksi ion) proses pemisahan lebih optimal
Fase gerak pada KCKT dapat diubah dengan mencampur
pelarut dalam berbagai gradient
Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa
sekaligus (secara simultan)
 Keterbatasan HPLC
Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali
jika HPLC dihubungkan dg spektrometer
massa
Jika sampel yang digunakan sangat kompleks,
maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit
diperoleh
Tujuan Akhir HPLC

HPLC

Pemisahan
 Resolusi
Tingkat pemisahan komponen dalam suatu
campuran dengan metode kromatografi
direfleksikan dalam kromatogram yang
dihasilkan
Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-
puncak dalam kromatogram harus terpisah
secara sempurna dari puncak lainnya dengan
sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak
tumpang tindih
Resolusi
Ukuran Daya Pisah
Resolusi
Instrumentasi HPLC
 Komponen instrumen HPLC :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak = Pompa
3. Alat utk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Suatu komputer atau integrator atau perekam
 Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang secara keseluruhan berperan dalam daya
elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun
dengan meningkatnya polaritas pelarut.
 Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak
yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut
jenis alkohol.
Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum
dibanding dengan fase terbalik.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi)
 Catatan
Fase gerak sebelum digunakan harus
dilakukan degassing (penghilangan gas)
Pelarut yg digunakan harus dg kemurnian
tinggi (HPLC grade)
 Pelarut UV cut off (nm)

n-heksana 195
Sikloheksana 200

Tetraklorometan 265

Metilbenzen 285
Triklorometan 245

Diklorometan 230

Tetrahidrofuran 212
Propanon 330

Asetonitril 190

Iso-propanol 205

Etanol 205
Metanol 205

Asam etanoat 255

Air 170
 Pompa
Syarat Pompa HPLC: inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat,
teflon, dan batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif,
20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan
tekanan konstan.
 Alat untuk memasukkan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan
secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
Rheodyne Loop Injector
 Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional
dan kolom mikrobor.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama
dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau
lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena
pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10 -100 l/menit).
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat
kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan
spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut
lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat
bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Parameter Kolom Konvensional Kolom Mikrobor

Stanless steel Stanless steel

P = 3,10,15,20, dan 25 cm P = 25 dan 50 cm
Tabung Kolom
o.d = 0,25 inci o.d = 0,25 inci
i.d = 4,6mm i.d = 1 atau 2 mm

Tek. Operasional 500-3000 psi (35-215 bar) 1000-5000 psi (70-350 bar)

NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi
atau alkohol .
NP : hidrokarbon+pelarut2
RP : metanol atau asetonitril + air atau
terklorinasi atau alkohol .
buffer
Fase Gerak RP : metanol atau asetonitril +
Kec.Alir : 10-100L/menit
air atau buffer
Modifikasi Instrumen :
Kec.Alir : 1-3mL/menit
Aliran < 10L/menit. Katup injeksi sampel
dan sel detektor bervolume kecil

Efisiensi meningkat dg
Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi
berkurangnya uk.partikel fase
lambat.
Kinerja diam, akan tetapi umur kolom
Konsumsi fase gerak hanya dari kolom
dg ukuran partikel 3m lbh
konvensional
pendek
 Dalam prakteknya, kolom mikrobor tidak
setahan kolom kovensional dan kurang
bermanfaat untuk analisis rutin
 Bagaimana memilih kolom???
Untuk memilih kolom (fase diam),
perhatikan beberapa sifat senyawa seperti:
- kelarutan
- kepolaran

Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut,

kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut
ini
Kolom Fase Diam HPLC
Particle Size
Beda Ukuran Partikel
 Kolom
Performance kolom menurun seiring
dengan lamanya waktu penggunaan,
yang ditandai dengan peningkatan
backpressure dan lebar puncak
kromatogram
 Pengoperasian Kolom
Untuk kolom Reversed-Phase [C8, C18, fenil,
dll], gunakan petunjuk berikut:
- simpan kolom dalam asetonitril atau metanol
atau campuran air dan pelarut organik

- jangan mengoperasikan kolom melebihi pH

yang diperbolehkan (untuk kolom berbasis
silika, disarankan pH 2,5 8).
pH > 8 silika terlarut
pH < 2 bonded silika terhidrolisis
 Pengoperasian Kolom
Selalu flush (aliri) kolom dengan pelarut
kuat (strong solvent) seperti metanol
sebelum digunakan untuk mengeliminasi
setiap anlit yang tertahan kuat

Jangan pernah biarkan komponen bufer

tertinggal dalam dalam pompa atau
kolom, karena komponen bufer dapat
mengendap dan menimbulkan kerusakan
 Pencucian Kolom
Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.
- Untuk kolom Reversed-phase:
gunakan campuran 96% diklorometan dan 4%
metanol dengan 0,1% amonium hidroksida

- Untuk kolom Normal-phase:

gunakan metanol
Pada keadaan yang sulit:
- lakukan back-flushing kolom dengan kece-
patan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]