Purifikasi dan analisis protein

a. Pertimbangan umum
1. Suatu protein dalam cairan biologis memerlukan derajat kemurnian tertentu sebelum dapat
diukur secara spesifik. Prosedur kemurnian mula-mula dikembangkan untuk diperoleh
protein yang cukup murni untuk memungkinkan dilakukan penetapan struktur.
2. 2. Pemisahan dasar protein dari protein lain atau dari molekul yang lebih kecil dicapai
dengan dengan menerapkan suatu kombinasi dari beberapa cara yang didasarkan kepada
berbagai sifat seperti kelarutan, ukuran molekul, muatan molekul atau peningkatan spesifik
dari protein dengan suatu zat spesifik.
3. Banyak dari teknik digunakan dalam penetapan struktur protein yang diterapkan secara lusa
dalam praktik laboratorium klinik. Pola protein plasma misalnya, secara rutin diperiksa
dengan elektroforesis gel, dan penetapan dengan penggunaan teknik terikat afinitas secara
luas (termasuk radioimmunoassay). Untuk hormone dan obat-obatan yang menggunakan
ikatan spesifik dari suatu zat ke zat lain.
b. Prosedur pemisahan
1. Kelarutan protein dipengaruhi oleh konsentrasi garam dalam larutan.
a. Pengendapan dengan garam (salting out). Penambahan garam divalen seperti
ammonium sulfat ke suatu larutan campuran protein akan mengendapkan beberapa
jenis protein pada konsentrasi garam tertentu, bukan yang lain. Pemisahan cara ini
dilakukan untuk memperoleh lebih banyak protein tertentu yang terdapat dalam fraksi
tertentu dari campuran yang sangat kompleks seperti lumatan jaringan atau suatu
sampel plasma darah.
b. Pelarutan dengan garam (salting in). beberapa protein memerlukan ion-ion anorganik
supaya dapat larut dalam air dialysis yang intensif (lihat bagian IV B2a) dapat
menyebabkan protein tertentu dari suatu campuran protein untuk mengendap keluar
dari larutan.
2. Pemisahan berdasarkan ukuran molekul
a. Dialysis
1) Molekul-molekul kecil dapat disingkirkan dari suatu larutan protein dengan cara
dialysis melalui suatu membrane semipermeable.
2) Larutan protein ditempatkan dalam suatu kantong selofan dan kantong itu
direndam didalam air. Pada membrane selofan terdapat pori-pori yang dapat
dilalui oleh molekul air dan molekul-molekul kecil lainnya, tetapi bukan molekul
protein.
3) Kebanyakan tabung dialysis membatasi aliran molekul yang lebih besar dari
15kdal.
b. Filtrasi gel (kromatografi pemisahan molekul, penyaringan molekul)
1) Filtrasi gel menggunakan suatu kolom berisi polimer karbohidrat yang tidak
larut dalam air akan tetapi sangat terhidrasi, dibuat dalam bentuk butir-butir
berpori dengan ukuran 100 mikrometer. Molekul-molekul kecil dapat masuk ke
dalam pori-pori, tetapi molekul besar tidak dapat. Karena itu, volume pelarut
 yang tersedi (volume distribusi) untuk molekul kecil lebih besar daripada bagi
molekul besar, dan dengan demikian molekul kecil mengalir lebih lambat
didalam kolom.
2) Untuk memperkirakan berat molekul suatu protein, kolom gel ditera dengan
suatu protein yang diketahui berat molekulnya.
3) Bentuk suatu molekul mempengaruhi volume distribusinya dan dengan
demikian kecepatannya melewati kolom maka prosedur ini paling sesuai untuk
protein globuler.