Protein dapat dimurnikan berdasarkan ukuran, daya larut, muatan, dan afininitas pengikatan

Protein dapat diperlihatkan dan dibeda-bedakan dengan metode-metode elektroforesis. Teknik

ini juga dapat digunakan untuk mendapatkan sejumlah kecil (microgram) polipeptida murni, tetapi tidak
menghasilkan protein asal yang murni dalam jumlah besar. Sejumlah besar protein murni sejumlah mg
diperlukan untuk mengungkapkan struktur tiga-dimensinya dan mekanisme kerjanya. Ribuan protein
telah dapat dimurnikan dalam bentuk aktif berdasarkan sifat-sifat seperti ukuran, daya larut, muatan,
dan afinitas pengkitan spesifik. Pada tiap tahap pemurnian dilakukan penetapan sifat protein yang
diminati (seperti aktivitas enzimatik) untuk menilai efisiensi prosedur yang dipilih.

Protein dapat dipisahkan dari molekul kecil dengan dialysis melalui membrane semipermeable
seperti membrane selulosa yang berpori (gambar 3-7). Molekul dengan ukuran lebih besar dari dimeter
pori akan tertahan didalam kantong dialysis, sedangkan molekul kecil dan ion dapat melewati pori
membran keluar dari kantong dialisis.

Pemisahan yang lebih tegas berdasarkan ukuran, dapat diperoleh dengan teknik kromatografi
filtrasi-gel (gambar 3-8). Sampel dimasukkan pada bagian atas kolom yang berisi butir berpori yang
terbuat dari polimer terhidrasi yang tidak larut seperti dekstran atau agarose (merupakan karbohidrat)
atau poliakrilamida. Molekul kecil dapat masuk ke dalam butir-butir, sedangkan molekul besar tidak.
Molekul kecil akan terdistribusi baik didalam butir maupun diantara butir, sedangkan molekul besar
terdistribusi hanya dalam larutan antara butir. Molekul besar akan bergerak lebih cepat melintasi kolom
dan keluar lebih dahulu kali sebab volume yang tersedia sedikit (lihat gambar 3-8). Hal yang harus
diingat adalah urutan molekul keluar dari kolom berpori merupakan kebalikan dari pergerakan molekul
pada elektroforesis gel, sebab rangka polimer pada elektroforesis bersifat menghambat pergerakan
molekul besar (lihat gambar 3-4). Jumlah protein yang dapat dipisahkan dengan kromatografi filtrasi gel
lebih besar dibanding dengan elektoforesis gel, tetapi dengan hasil resolusi kebanyakan rendah.

Daya lalur kebanyakan protein dalam larutan garam dengan konsentrasi tinggi menjadi rendah.
Efek ini dikenal salting out, walau pun dasarnya belum jelas benar. Hubungan daya larut protein dengan
kadar garam berbeda antara satu protein dengan protein lainnya. Sehingga salting out ini dapat
digunakan untuk fraksinasi protei. Misalnya, amonium sulfat 0,8M mengendapkan fibrinogen, suatu
protein penggumpalan darah, sedangkan untuk mendapatkan albumin serum digunakan amonium sulfat
2,4 M. salting out ini juga dapat digunakan untuk memekatkan larutan encer protein.

Protein juga dapat dipisahkan muatan dengan cara kromatografi pertukaran ion. Bila suatu
protein bermuatan positif pada ph 7, maka protein tersebut akan terikat dalam kolom dengan butir-
butir yang mempunyai gugus karboksilat, sedangakn protein bermuatan negatif tidak (gambar 3-9).
Protein bermuatan positif yang terikat pada kolom dapat dilepas dengan dinaikkan konsentrasi natrium
klorida atau garam lain dalam bufer elusi. Ion natrium bersain dengan gugus bermuatan positif pada
protein yang terikat pada kolom, sehingga ikatan tersebut akan lepas. Protein dengan muatan positif
lebih sedikit akan keluar terlebih dahulu, kemudian diikuti oleh protein dengan muatan positif lebih
besar. Factor lain yang mempengaruhi selain muatannya adalah afinitas protein terhadap matriks
penunjang. Protein bermuatan negatif ( protein inionik) dapat dipisahkan dengan kolom kromatografi
bermuatan positif seperti dietil-aminoetil-selulosa (DEAE-cellulose). Sebaliknya, protein bermuatan
positif ( protein kationik) dapat dipisahkan dengan menggunakan kolom bermuatan negarif
karboksimetil- selulosa ( CM-cellulose).

Kromatografi afinitas juga merupakan salah satu teknik yang umum digunakan dalam purifikasi
protein. Teknik ini berdasarkan afinitas spesifik berbagai protein terhadap gugus kimia tertentu.
Misalnya, konkanavalin A, suatu protein tumbuhan, dapat dipisahkan dengan melewatkan ekstrak kasar
protein pada kolom berisi butiran yang mengikat glukosa secara kovalen. Konkanavalin A akan terikat
pada kolom sebab konkanavalin A mempunyai afiniats yang tinggi terhadap glukosa, sedang kebanyakan
protein lain tidak. Konkanavalin A yang terikat pada kolom kemudian dapat dilepas dengan penambahan
larutan gula pekat. Gluokosa dalam peluruh akan mengganti kedudukan glukosa yang terikat pada
konkanavalin A pada umumnya, kromatografi afinitas dapat digunakan secara efektif untuk mengisolasi
protein yang mengenali gugus tertentu X dengan cara (1) mengikatkan X atau derivatnya secara kovalen
pada kolom, (2) menambahkan campuran protein pada kolom, yang kemudian diluruhkan buffer untuk
mengeluarkan protein yang tidak terikat, dan (3) mengelusi protein yang diminati dengan penambahan
larutan X dalam konsentrasi tinggi.