I.

TUJUAN
1. Mahasiswa memahami prinsip pemisahan dengan metode elektroforesis.
2. Mahasiswa dapat melaksanakan pemisahan dengan metode elektroforesis.

II. DASAR TEORI

Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip
kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan
negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif
(katoda), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (anoda). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil
amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya
band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan
potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings, 1994).
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
bermigrasinya molekul-molekul biologi. Media penyangganya ada bermacam-
macam tergantung tujuan dan bahan yang akan dianalisis. Media penyangga
yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain kertas, selulose, asetat, dan
gel.Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan (Anonim, 2008).
Jika suatu fase zat bermuatan diberi beda potensial, fase tersebut akan
berpindah sepanjang medium kontinyu ke arah katoda atau anoda sesuai
dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukkan suatu
ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein
enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang
dapat digunakan untuk identifikasi zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan jika
senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat
sirkulasi konvektif (Tim Penyusun, 2011).
Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda
negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel

1
poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat
molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi.
Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak
yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Soemitro, dkk, 1996).
Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan
berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita
protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai
berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini
sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul
bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul
dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita
yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).
Kecepatan migrasi dari molekul protein tergantung pada beberapa faktor,
diantaranya ukuran molekul protein, konsentrasi gel, buffer, medium
penyangga, kekuatan voltase, dan temperatur medium disaat proses
elektroforesis berlangsung (Soedarmadji, 1996).
Pemisahan melalui metode elektroforesis memerlukan waktu yang relatif
lama dalam kisaran jam. Kecepatan pemisahan dapat ditingkatkan melalui
penambahan tegangan listrik searah yang digunakan. Akan tetapi, peningkatan
tegangan listrik searah dapat menyebabkan noda hasil pemisahan menjadi tidak
jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan oleh tegangan listrik
searah yang tinggi (Hendayana, 2006).
Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan
berdasarkan perbedaan transport fisik zat terlarut yang bermuatan di dalam
medium kertas sebagai akibat pengaruh gradient potensial.Perpindahan partikel
bermuatan dalam kertas bergantung pada tanda besarnya muatan pada zat
terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit,
kuat ion, pH, temperature, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat fisika
kimia medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga
mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang

2
 berlawanan. Lintasan yang ditempuh oleh suatu pertikel bermuatan sesuai
dengan: (Tim Penyusun, 2011).
Ut e Ut V
d
qk L
Dimana d = Lintasan yang ditempuh; k = konduktifitas;
Ut = Mobilitas ion pada saat t; V = Tegangan;
e = Arus listrik; L = Panjang saluran;
q = Luas penampang

III. ALAT DAN BAHAN

3.1. Alat
Elektroforesis set (chamber dan power supply)
Transluminator (lampu UV)
Cetakan Gel
Parafilm
Sisir untuk membuat gel (comb)
Power supply
Pipet mikro dengan tips kuning 200L ; tips kristal 20 L
Magnetic stirrer
Stirrer bar
Microwave
3.2. Bahan
Loading buffer
Buffer TAE (Tris Asetil EDTA)
Ethidium bromida (EtBr)
DNA hasil isolasi
Agarose 1,2%
Aquades
Marker DNA loader 100 bp

3
IV. PROSEDUR KERJA
4.1. Penyiapan Agarose
Agarose dimasukkan ke dalam wadah yang sudah terdapat magnetic stirrer.
Kemudian dipanaskan di dalam microwave hingga mencair.

Agarose yang telah cair diletakkan di atas stirrer bar hingga suhunya 50oC.

Comb dipasang pada cetakan tray untuk membuat sumur (well).

Kemudian agarose yang telah cukup dingin dituang hingga kurang lebih 2/3
bagian tray, dan ditunggu 15 menit hingga agarose mengeras.

Setelah mengeras, lapisan agar ditambahkan dengan sedikit buffer TAE

sehingga mudah diangkat

Kemudian, comb diangkat (untuk membuat sumur sampel) ke arah vertikal

secara perlahan-lahan

4.2. Penempatan Sampel

Tray yang sudah terisi agar yang telah mengeras dipindahkandengan hati-
hati kedalam chamber yang telah berisi buffer TAE.

Sumur dicuci dengan TAE

Dipipet 1 L loading buffer dan diletakkan di atas parafilm yang bersih

kemudian ditambah 5 L DNA marker yang telah disiapkan

Campuran tersebut dihomogenkan dengan memipetnya (pipet 6 L)

berulang kali. Kemudian campuran dimasukkan secara vertikal tepat ke
dalam sumur. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati agar DNA marker
tidak menyebar di atas agarose.

4
Proses yang sama dilakukan pada ke-3 sampel DNA yang lain.

4.3. Elektroforesis
Agarose ditempatkan pada kotak elektroforesis yang berisi buffer TAE

Tangki elektroforesis dihubungkan dengan sumber arus. Kutub negatif pada

sisi yang dekat dengan sumuran. Sumber arus dengan voltase konstan (100
volt).

Dilakukan elektroforesis selama 30 menit.

Setelah 30 menit, mesin elektroforesis dimatikan,agar diangkat dan

dimasukkan kedalam larutan Ethidium Bromida (10 L dalam 200 ml air)
selama 5 menit.

Gel diangkat dan direndam dalam aquades selama beberapa menit

(destaining, agar kelebihan EtBr tercuci).

Pita kemudian dilihat di UV (transluminator)

5
V. HASIL

sample 1 sample 2 DNA marker

sample 4 sample 5

Hasil Pengamatan dengan Sinar UV

Dari senyawa marker didapatkan:

Sample BP 1 BP 2
1 - -
2 200 - 300 600
3 100 - 200 300
4 100 - 200 300

VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum elektroforesis ini, metode elektroforesis yang
digunakan adalah elektroforesis gel dengan memisahkan molekul DNA yang
dibuat dalam empat jenis sampel yaitu sampel 1, 2, 3, dan 4. Medium injeksi
untuk pemisahan dengan elektroforesis yang digunakan adalah gel agarose

6
dengan konsentrasi 1,2%. Agarose dipilih karena memiliki tingkat
kemurnian yang sangat tinggi.
Pembuatan agarose tidak dilakukan karena telah tersedia. Lapisan
agar yang telah mengeras ditambahkan buffer TAE agar mudah diangkat.
Comb (sisir)yang berfungsi untuk membuat sumur (well) diangkat ke arah
vertikal secara perlahan-lahan. Setelah mengeras, agarosa membentuk
matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika
medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan
negatif pada pH netral akan bergerak ke katoda (+). Kecepatan migrasi ini
ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi
agarosa, dan besaran tegangan yang digunakan. (David G. Watson, 2007).
Comb harus diberikan jarak 1 cm dari dasar cetakan agar sumur yang
terbentuk baik. Caranya yaitu kedua ujungnya dipegang. Mediumnya
diangkat dari cetakan dengan cara memegang kedua sisinya sambil bagian
bawahnya dibersihkan dengan menggesekkan pada pinggir tray agar sisa-
sisa agar (pengotor) tidak terangkat yang akan dapat merusak medium
utuhnya. Medium yang telah diangkat dipindahkan ke dalam chamber
elektroforesis yang telah diisi dengan buffer TAE. Bagian sumur
ditempatkan pada sisi kutub negatif.
Sebelum dilakukan elektroforesis, terlebih dahulu dilakukan
pencucian sumur dan penempatan sampel pada sumur. Pencucian dilakukan
dengan menggunakan buffer TAE secara perlahan-lahan dengan pipet mikro
dengan tips kuning 200L. Tujuan dari pencucian ini adalah untuk
membersihkan kotoran yang terdapat dalam sumur. Pada saat penempatan
sampel, hal yg dilakukan pertama yaitu dibuat campuran untuk masing-
masing sampel yang terdiri dari 1 L loading buffer, 5 L sampel (pada
praktikum kali ini sudah disediakan). Pembuatannya dilakukan di atas
parafilm. Parafilm berfungsi sebagai tempat pensuspensian loading buffer
dengan sampel. Parafilm bersifat mudah merenggang, moldable, tahan air,
tidak berbau, semitransparan dan self-adhering. Sifat self-adhering ini
menyebabkan campuran sampel dan loading buffer dapat melekat secara

7
fleksibel dan dapat menyatu. Penambahan Loading buffer berfungsi sebagai
pemberat dan digunakan agar sampel DNA tidak meluber ke larutan buffer
TAE karena sampel DNA sangat ringan. Loading buffer memiliki kekuatan
sampai 6 kali dimana 1 L loading buffer dapat digunakan sebagai pemberat
untuk 5 L sampel DNA. DNA marker ditambahkan 1 L loading buffer
untuk 5 L DNA dan diresuspensi kembali dengan pipet mikro (pada
praktikum kali ini sudah disediakan). Fungsi DNA marker adalah sebagai
tolak ukur dalam penentuan berat molekul sampel DNA.
Sampel DNA dan Marker masing-masing disentrifugasi terlebih
dahulu agar semua sampel tidak menempel dan berada di dasar wadah
sampel. Kemudian sample DNA dan Marker ditempatkan pada sumur
dengan pipet mikro bervolume 6 L. Saat penempatan sampel harus
dilakukan dengan hati-hati untuk mencegah robeknya dinding dan dasar
sumur karena robeknya dinding dan dasar sumur dapat menyebabkan sampel
akan meluber ke larutan TAE dan proses elektroforesis menjadi tidak
maksimal. Satu sumur ditotolkan dengan larutan marker yaitu suatu DNA
yang telah diketahui bobot molekulnya yang nantinya akan digunakan
sebagai pembanding terhadap sampel yang akan diuji. Pada praktikum ini
larutan DNA marker yang digunakan memiliki rentang nilai bobot molekul
100-1500 bp. Marker ditempatkan pada sumur keempat, diikuti dengan
sampel 1 pada sumur kedua, sampel 2 pada sumur ketiga, sampel 3 pada
sumur 5, dan sampel 4 pada sumur 6. Tujuan penempatan marker dan sampel
DNA seperti di atas adalah untuk memudahkan praktikan dalam pengamatan
sampel yang telah di run.
Pada praktikum ini voltase yang digunakan sebesar 100 volt selama
30 menit. Pada proses elektroforesis ini akan terjadi pergerakan DNA dari
kutub negatif (anoda) ke kutub positif (katode). Hal ini dikarenakan DNA
yang dipisahkan bermuatan negatif. Selama proses ini akan terjadi
pemisahan dari DNA tersebut. Setelah proses elektroforesis selesai, medium
agarosa dikeluarkan dari chamber dan dilakukan staining (pewarnaan)
dengan EtBr (Ethidium Bromida) selama 5 menit yang bertujuan untuk

8
 visualisasi asam nukleat yaitu dapat berikatan dengan asam nukleat dengan
cara masuk diantara basa nukleotida dan berfluoresensi pada sinar UV saat
berikatan dengan DNA.
Berdasarkan hasil running dan identifikasi elektroforesis, terdapat
pita-pita yang memiliki kejelasan warna yang berbeda-beda. Dari hasil
pengamatan, sumur 4 merupakan DNA marker yang memiliki rentang bobot
molekul 100-1500 bp. Dari gambar hasil visualisasi, dapat diperkirakan
bobot molekul masing-masing pita. Sumur ke-2 tempat penotolan sampel
pertama tidak menunjukkan adanya pita. Hal ini dikarenakan robeknya
dinding dan dasar sumur pada saat loading sampel. Sumur ke-3 tempat
penotolan sampel kedua memiliki bobot molekul 200-300 bp pada pita 1
(jauh dari sumur) dan 600 bp pada pita 2 (dekat dengan sumur). Sumur ke-5
tempat penotolan sampel ketiga memiliki bobot molekul 100-2000 bp pada
pita 1 dan 300 bp pada pita 2. Sumur ke-6 tempat penotolan sampel ke-4
memiliki bobot molekul 100-200 bp pada pita 1 dam 300 bp pada pita 2.
Sampel dengan bobot molekul (BM) besar berada pada bagian bawah dekat
dengan sumur, sedangkan sampel dengan bobot molekul kecil berada lebih
jauh dari sumur.

VII. KESIMPULAN
1. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul
bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan
listriknya. Khusus untuk DNA, pemisahan tidak didasarkan atas
perbedaan muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi atau
struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan adalah agarose.
2. Pemisahan dengan metode elektroforesis dilakukan dengan menotolkan
sampel pada well gel agarosa yang telah diberi buffer, kemudian
dilakukan running untuk proses pemisahannya. Molekul DNA
bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran
molekulnya,makin rendah laju migrasinya.