METODE EKSTRAKSI DAN ISOLASI

METODA PEMISAHAN

METODA IDENTIFIKASI

ANALISA HASIL
Metoda Ekstraksi Dan Isolasi

Untuk analisis fitokimia , harus digunakan jaringan

tumbuhan segar ; cara lain : tumbuhan dapat
dikeringkan sebelum diekstraksi.

Pertama-tama dilakukan ekstraksi ( bisa dengan alat

soxhlet) dengan pelarut non polar ( eter minyak bumi,
heksana ) , pelarut kurang polar ( eter , CHCl3 ) ,
pelarut polar ( air , etanol ).

Kandungan kimia simplisia pada umumnya dike-

lompokkan sebagai berikut :
Minyak atsiri; karotenoid; steroid; triterpenoid;
alkaloid; asam lemak; senyawa fenol; asam organik;
glikosida; saponin; tanin; karbohidrat, dll.
Setelah dilakukan ekstraksi maka didapat sari, ada 3
macam sari :

Sari dalam eter minyak bumi , heksana :

Minyak atsiri , lemak , asam lemak tinggi , steroid ,
triterpenoid , karotenoid.

Sari dalam eter , CHCL3 :

Alkaloid , fenol , asam lemak , minyak atsiri tertentu .

Sari dalam air, etanol :

garam alkaloid , antosian , glikosida , saponin , tanin ,
karbohidrat.
Sari dalam eter minyak tanah atau heksana :

Cara penyarian : sejumlah 25 g sampai 50 g serbuk simplisia

disari dengan eter minyak tanah P dengan cara pengocokan
berkali-kali , sehingga pengocokan terakhir bila diuapkan
tidak meninggalkan sisa. Sari yang diperoleh kemudian
dipekatkan sampai 25 ml.

Minyak atsiri :
o Cara pengujian : 10 g sampai 50 g simplisia nabati
yang bersangkutan disuling dengan air dalam alat
destilasi Stahl.
o Minyak atsiri yang diperoleh kemudian dipisahkan dan
dilakukan uji pemerian, warna dan sifat kimia dan
fisika.
 Cara penyarian

10 ml sari dalam eter minyak tanah diuapkan, sampai kering

dan kemudian ditambahkan 10 ml larutan Kalium
hidroksida P 0,5 N dalam etanol, kemudian di reflux
diatas tanggas air sehingga tidak terlihat tetesan minyak
pada permukaan cairan.

Lakukan penyulingan untuk menghilangkan etanol, dan

sisanya dilarutkan kembali ke dalam 20 ml air panas,
kemudian di tuang kedalam corong pemisah. Sesudah dingin
dicuci dengan eter P secukupnya.

Larutan dalam eter dituangkan pada corong pisah yang sama

di atas larutan air alkalis. Corong pemisah digojok-gojok
untuk menyari zat-2 yang tidak tersabunkan, diulang sebanyak
2 kali masing-2 dengan 8 ml eter P.
 Sari dalam eter tersebut digunakan untuk
identifikasi steroid , triterpenoid dan karotenoid.
Sari dalam air alkalis digunakan untuk identifikasi
selanjutnya terhadap asam lemak tinggi.

Sari dalam air alkalis diasamkan dengan asam

khlorida pekat P hingga pH 3 sampai 4 , asam
lemak disari berulang-ulang dengan sedikit eter
dalam corong pemisah.

Sari eter ini dikumpulkan , kemudian diuapkan

sampai kering. Jika sisa berminyak maka sari eter
tersebut mengandung asam lemak.
 Steroid dan Triterpenoid

10 ml sari dalam eter pada identifikasi lemak dan

asam lemak tinggi diuapkan sampai kering. Sisanya
dilarutkan dalm 0,5 ml anhidrida asam asetat P,
kemudian ditambahkan 0,5 ml khloroform P.

Larutan tersebut kemudian dituangkan kedalam tabung

yang kering. Melalui dinding tabung diteteskan 1 ml
sampai 2 ml asam sulfat P dengan menggunakan pipet
(Reaksi Liebermann-Burchard).

Pada batas kedua larutan terjadi cincin merah

kecoklatan atau ungu , sedangkan larutan pada bagian
atas menjadi hijau atau ungu, hal ini menunjukkan
adanya steroid atau triterpenoid.
 Karotenoid

10 ml sari dalam eter pada identifikasi lemak dan

asam lemak tinggi. Sisanya ditambah 2 tetes sampai
3 tetes larutan jenuh antimon (III) klorida P dalam
kloroform P (Reaksi Carr Price).

Warna mula-mula biru kemudian menjadi merah.

Selain itu dengan asam sulfat pekat P, karotenoid
akan memberikan warna biru atau hijau kebiruan.
Sari dalam eter

Cara penyarian : serbuk sisa penyarian dengan eter

minyak tanah disari kembali dengan eter P dengan cara
pengocokan berkali-kali , sehingga hasil pengocokan
terakhir bila diuapkan tidak meninggalkan sisa. Sari
dipekatkan sampai menjadi 50 ml.

Alkaloid
o 10 ml sari dalam eter diuapkan , sisa larutkan dalam 1,5 ml
asam klorida P 2 %. Larutkan dibagi menjadi 3 sama
banyak dalam tabung reaksi.
o Tabung reaksi pertama sebagai pembanding. Tabung reaksi
II ditetesi 2 tetes sampai 3 tetes larutan Dragendorff LP.
Tabung reaksi III ditetesi dengan 2 tetes sampai 3 tetes
larutan Mayer P atau pereaksi pengendapan yang lain.
 o Adanya alkaloid dalam simplisia ditunjukkan dengan terjadinya
kekeruhan atau endapan jingga kecoklatan untuk pereaksi dragendorff
dan endapan putih kekuningan untuk pereaksi Mayer.

Senyawa Fenolik
o 1 ml sari dalam eter diuapkan. Sisa ditetesi dengan larutan besi (III)
klorida LP. Apabila terjadi warna hijau, ungu, biru sampai hitam,
menunjukkan adanya senyawa fenolik terutama fenol-fenol bebas.

Fenol fenol
o 1 ml sari dalam eter diuapkan. Sisa ditetesi dengan campuran kalium
heksasianoferat (III) dan larutan besi (III) klorida LP. Adanya fenol
ditunjukkan oleh timbulnya warna biru sampai hitam.

Asam fenolat
o Identifikasi asam fenolat dilakukan dengan pemeriksaan secara KLT.
 Fenil propanoid

o Meliputi kumarin dan turunannya.

o 3 ml sari dalam eter diuapkan sampai kering. Sisa dilarutkan

dalam air panas. Setelah dingin larutan dibagi dalam 2 tabung
reaksi.

o Tabung reaksi I untuk pembanding. Tabung reaksi II

ditambah 0,5 ml amonia encer P agar larutan menjadi alkalis.
Bila terjadi pemendaran biru atau hijau yang kuat dibawah sinar
ultra violet menunjukkan adanya senyawa kumarin dan derivat-
2nya.
 Flavonoid

o 3 ml sari dalam eter diuapkan sampai kering. Sisa

dilarutkan dalam 1 ml sampai 2 ml metanol 50 %
P dengan bantuan pemanasan. Pada larutan tersebut
ditambahkan logam magnesium P dan 4 tetes sampai
5 tetes asam klorida pekat P. Adanya aglukon
flavonoid ditunjukkan dengan terjadinya warna
merah atau jingga ( reaksi sianidin atau reaksi
shibata ).
 Antrakinon

o 3 ml sari dalam eter dituangkan dalam tabung reaksi.

Larutan ditambah 1 ml larutan amonia 25 % atau
larutan natrium hidroksida P 10 % kemudian dikocok.
Bila larutan tersebut berubah menjadi merah, menunjukkan
adanya antrakuinon . ( Reaksi Bortrager )

Xanton dan Stilben

o Identifikasixanton dan stilben dilakukan dengan

pemeriksaan secara KLT.
 Komponen minyak atsiri tertentu

o Komponen minyak atsiri tertentu , terutama yang mempunyai

kerangka aromatik atau non terpenik lebih larut dalam eter atau
alkohol karena bersifat sedikit polar, tetapi masih tetap tidak
larut dalam air.

o Contoh : eugenol , anetol , sinamalaldehide , vanilin. Untuk

identifikasi dilakukan menurut cara yang tertera pada
monografi masing-masing dalam Farmakope.
 Asam lemak

o 5 ml sari dalam eter diuapkan sampai kering. Jika

sisa berminyak maka pada sari eter tersebut
terdapat asam lemak . Identifikasi asam lemak
dilakukan dengan kromatografi lapisan tipis.
Sari dalam etanol - air

Cara penyarian : serbuk sisa penyarian dengan eter disari

dengan campuran etanol air (70:30) atau lebih lazim disebut
etanol 70 % P dengan cara pengocokan berkali-kali. Sehingga
hasil pengocokan terakhir bila diuapkan tidak meninggalkan sisa.
Sari dalam etanol dipekatkan menjadi 50 ml.

Garam alkaloid

o 20 ml sari etanol air dituang ke dalam gelas piala

kemudian diuapkan di atas tangas air atau tangas pasir.
Pada sisa ditambahkan 10 ml larutan asam klorida P 10%
sambil dipanaskan dan diaduk.
o Larutan yang diperoleh dibagi ke dalam 2 tabung, yang
satu untuk garam alkaloid dan yang lain untuk basa
kuarterner dan amina teroksidasi

o Alkaloid dalam bentuk garam asam organik diubah menjadi

garam asam mineral. Larutan alkaloid dalam tabung I
diendapkan dalam bentuk basa dengan bantuan amonia
encer P hingga pH 8 9.

o Kemudian di sari dengan pelarut kurang polar seperti eter

atau kloroform. Sari eter atau kloroform tersebut kemudian
diuapkan sampai kering.

o Sisa yang diperoleh dilarutkan kembali dengan 1,5 ml

asam klorida (2%) P. Larutan yang bersifat asam tersebut
dibagi dalam 3 tabung reaksi.
o Tabung I untuk pembanding. Tabung II ditambah 3 tetes
larutan Mayer LP. Tabung III ditambah 3 tetes larutan
Dragendorff LP. Adanya alkaloid ditunjukkan dengan
terjadinya kekeruhan atau endapan putih kekuningan untuk
pereaksi Mayer dan endapan jingga untuk perekasi
Dragendorff.

o Larutan asam pada tabung II ditambah 0,5 g natrium klorida

P sambil diaduk. Larutan disaring melalui kertas saring
kemudian kertas saring dicuci dengan 3 ml larutan asam
klorida 10 % LP.

o 1 ml larutan yang bersifat asam tersebut ditambah reagen

Mayer LP atau larutan Dragendorff LP. Jika terjadi endapan
berlebih, maka sisa larutan yang bersifat asam dipindah
kedalam corong pemisah kecil, kemudian ditambah amonia
pekat P hingga pH 8 9.
 o Pada larutan ditambahkan eter P atau kloroform P yang
volumenya sama dengan volume larutan air alkalis,
kemudian dikocok.

o Setelah didiamkan akan terjadi dua lapisan.

o Lapisan eter atau kloroform digunakan untuk

menunjukkan adanya alkaloid, sedang lapisan air yang
alkalis untuk menunjukkan adanya basa kuarterner dan
amina teroksidasi.

Antosian
o Jika sari dalam etanol air bereaksi asam, maka warna
larutan merah, jika sari dengan pH netral maka warna larutan
menjadi ungu, dan pada suasana alkalis warna larutan
menjadi hijau atau biru. Perubahan warna yang demikian
menunjukkan adanya antosian.
 Glikosida

o 20 ml sari dalam etanol air ditambah 15 ml asam

klorida 10 % LP, kemudian direfluks selama 30 menit.
Terjadi hidrolisis, yaitu pemecahan glikosida menjadi
aglikon dan gula.

o Setelah didinginkan larutan disari 3 kali, masing-masing

dengan 12 ml eter P dalam corong pemisah. Lapisan eter
dipisahkan dari lapisan air yang bersifat asam,
dikumpulkan kemudian ditambah natrium sulfat,
dikumpulkan, kemudian ditambah natrium sulfat anhidrat
P untuk menghilangkan air yang terserap oleh sari dalam
eter tersebut.
o Selanjutnya sari dalam eter digunakan untuk pengujian
aglikon steroid, triterpenoid , kumarin , flavonoid , dan
antrakinon.

o Sedangkan larutan air yang bersifat asam , setelah di

netralkan digunakan untuk pengujian gula dengan cara
KLT.

o Untuk pengujian steroid dapat ditambahkan pengujian

terhadap adanya aglikon glikosida jantung , yaitu dengan
reaksi Kedde.
 Saponin
o 2 ml sari etanol air diuapkan hingga kira-2 tinggal
separuhnya. Sisa diencerkan dengan air volume sama dan
dituangkan dalam tabung reaksi, kemudian dikocok
selama 15 menit. Terbentuknya buih yang stabil
menunjukkan adanya saponin.

Tanin
o 1 ml sari etanol air diencerkan dengan 2 ml air. Pada
larutan ditambahkan 3 tetes larutan besi (III) klorida P, warna
larutan akan berubah menjadi biru kehitaman atau hijau
kehitaman.
o Warna biru kehitaman menunjukkan bahwa simplisia
mengandung tanin galat . Warna hijau kehitaman
menunjukkan bahwa simplisia mengandung tanin katekol.
o Bila terdapat campuran keduanya masing-masing tanin dapat
ditunjukkan sebagai berikut : 5 ml sari ditambah 1 ml
larutan Stiassny LP (larutan formol klorida) kemudian
direfluks selama 30 menit.

o Bila terjadi endapan merah menunjukkan adanya tanin

katekol. Endapan disaring, filtrat yang diperoleh dinetralkan
dengan natrium asetat. Sedikit larutan tersebut ditetesi
dengan larutan besi (III) amonium sulfat P, bila terjadi
warna biru tua menunjukkan adanya tanin galat.
 Karbohidrat

o Senyawa karbohidrat yang tersari ke dalam sari etanol air

meliputi osa dan monosa atau disebut juga gula reduktor
(glukosa, galaktosa, ramnosa) oligosa yang merupakan rantai
yang terdiri dari kurang dari 10 unit monosa (sakarosa,
gentiobiosa, rafinosa, stasiosa) dan poliosa yaitu rantai yang
tersusun oleh lebih dari 10 unit monosa (gom, lendir,
pektin, pati).

o 2 ml sari dalam etanol air dituangkan ke dalam cawan

porselen. Sari diuapkan hingga kering. Sisa ditambah 2
tetes sampai 3 tetes asam sulfat pekat P dan didiamkan
selama 4 menit.
o Dengan terjadinya dehidrasi akan terbentuk furfural dari
pentosa atau hidroksimetilfurfural dari heksosa.

o Kemudian ditambahkan 4 tetes larutan jenuh timol P

dalam etanol (Reaksi Molisch).

o Bila terjadi warna merah menunjukkan adanya

karbohidrat.

o 1 ml sari dienaptuangkan dan diencerkan, pada larutan

tersebut ditambahkan 3 tetes larutan Lugol P.

o Jika terjadi warna biru menunjukkan adanya pati.

 METODA PEMISAHAN

Kromatografi : adalah suatu tehnik pemisahan tertentu, yang pada

dasarnya menggunakan dua fase yaitu satu fase tetap (stationary)
dan yang lain fase bergerak (mobile).

Kromatografi kertas (KKt)

Kromatografi lapisan tipis (KLT)

Kromatografi gas cair (KGC)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

 KKt untuk senyawa yang mudah larut dalam air (misalnya :
karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik, senyawa
fenolat).

KLT untuk senyawa yang larut dalam lipid (misalnya : lipid, steroid,
karotenoid, kuinon).

KGC untuk pemisahan senyawa atsiri yaitu asam lemah,

seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang.

KCKT untuk senyawa yang keatsiriannya kecil.

 POLA KROMATOGRAM

Ekstrak ditinbang, diekstraksi dengan pelarut dan cara tertentu,

kemudian dilakukan analisis kromatografi sehingga memberikan
pola kromatogram yang khas.

Kadar Total Golongan Kandungan Kimia

Dengan penerapan metode spektrofotometri, titrimetri, volumetri,

gravimetri atau lainnya, dapat ditetapkan kadar golongan
kandungan kimia.
 Ada beberapa golongan kandungan kimia yang dapat
dikembangkan dan ditetapkan metodenya, yaitu :

Golongan minyak atsiri

Golongan steroid

Golongan tanin

Golongan flavonoid

Golongan triterpenoid (saponin)

Golongan alkaloid

Golongan antrakinon
 Kadar Kandungan Kimia Tertentu

Dengan tersedianya suatu kandungan kimia yang berupa senyawa

identitas atau senyawa kimia utama ataupun kandungan kimia
lainnya, maka secara kromatografi instrumental dapat dilakukan
penetapan kadar kandungan kimia tersebut.

TUJUAN :

Memberikan data kadar kandungan kimia tertentu sebagai senyawa

yang diduga bertanggung jawab pada efek farmakologi.
 Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

Umumnya dibuat kromatogram pada lempeng silika dengan

berbagai jenis fase gerak sesuai dengan golongan kandungan kimia
sebagai sasaran analisis.

Kromatografi Gas Cair (KGC)

Sistem kromatografi gas cair mempunyai resolusi tinggi sehingga

optimal untuk pemisahan komponen yang stabil dengan
pemanasan.
 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT / HPLC)

Umumnya pola kromatogram kandungan kimia yang termolabil

dibuat dengan HPLC

Penetapan Kadar :

Minyak atsiri : destilasi

Steroid : spektrofotometri
Tanin : titrasi dengan KMnO4 (Permanganometri)
Flavonoid : hidrolisis, ekstraksi dan spektrofotometri
Saponin : hemolisa
Alkaloid : ekstraksi dan spektrofotometri
Antrakuinon : ekstraksi dan spektrofotometri
 Kromatografi Lapisan Tipis ( KLT )

KLT lebih baik dari KKt yaitu dalam keserbagunaan, kecepatan dan
kepekaannya. Ini karena pada KLT dapat digunakan bermacam-
macam zat penyerap lainnya selain cellulosa, yaitu : silika gel,
aluminium oksida, kalsium hidroksida, damar penukar ion,
magnesium fosfat, poliamida, polivinil pirolidon.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT / HPLC )

Hampir sama dengan KGC

KCKT dilakukan dalam suhu kamar

KCKT digunakan untuk senyawa-senyawa : terpemoid, fenol ,

alkaloid , lipid , gula.
 METODA IDENTIFIKASI

Setelah senyawa diisolasi dan dimurnikan , pertama-tama

ditentukan golongannya dulu, kemudian baru ditentukan jenis
senyawa dalam golongan tersebut.

Metoda Identifikasi dilakukan dengan spektrofotometri :

Spektroskopi UV (Ultra Violet)

Spektroskopi IM (Infra Merah)

Spektroskopi Massa ( S.M. )

Spektroskopi RMI ( Resonansi Magnet Inti )

 Spektroskopi UV ( Ultra Violet )

Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam

larutan yang sangat encer dengan pembanding blanko pelarut serta
menggunakan spektrofotometer yang merekam otomatis. Senyawa
tak berwarna diukur pada jangka 200 sampai 400 nm, senyawa
berwarna pada jangka 200 sampai 700 nm.

Spektroskopi IM ( Infra Merah )

Spektrum infra merah tumbuhan dapat diukur dengan

spektrofotometri infra merah yang merekam secara otomatis
dalam bentuk larutan ( dalam khloroform, karbontetrakhlorida,
1-5 % ), bentuk gerusan dalam minyak nuyol, atau bentuk padat
yang dicampur dengan kalium bromida.
 Spektroskopi Massa (S.M. )

Spektroskopi Massa adalah penguraian sesepora senyawa

organik dan perekaman pola fragmentasi menurut massanya.

Spektroskopi RMI

Spektroskopi RMI merupakan sarana untuk menentukan

struktur senyawa organik dengan mengukur momen magnet
atom hidrogennya.
 ANALISA HASIL

Pada analisa hasil yang dilakukan adalah :

Analisa kualitatif

Analisa kuantitatif

Analisa kualitatif : Pada analisa kulaitatif, ini diharapkan

ditemukan beberapa kandungan yang mempunyai struktur baru.

Analisa kuantitatif : Yaitu penentuan banyaknya ( jumlah gram

) senyawa yang ditemukan, biasanya ditentukan dalam
persentase.