Kromatografi Kolom
Kromatografi Kolom
PENDAHULUAN
KROMATOGRAFI KOLOM | 1
fisika umum dari molekul. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan
beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar
bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Berdasarkan
uraian tersebut, maka akan membahas tentang metode kromatografi kolom.
KROMATOGRAFI KOLOM | 2
12. Mengetahui manfaat dari kromatografi kolom.
13. Mengetahui kelebihan dan kekurangan dari kromatografi kolom.
KROMATOGRAFI KOLOM | 3
BAB II
PEMBAHASAN
KROMATOGRAFI KOLOM | 4
dan konstituen-konstituen yang sulit menguap. Pada kromatografi cair-padat
suatu substrat padat bertindak sebagai fase diam. Pemisahan tergantung pada
kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di antara butiran-
butiran fase diam dan fase cair yang bergerak serta pada kelarutan relatif zat
terlarut dan pelarut untuk teradsorbsi menimbulkan suatu proses dinamik
dimana molekul-molekul zat terlarut dan molekul-molekul pelarut secara
kontinyu mengadakan kontak dengan permukaan adsorben, tertahan beberapa
saat di permukaan dan kemudian masuk kembali pada fase bergerak. Pada
saat teradsorbsi, zat terlarut dipaksa untuk berpindah oleh aliran maju fase
bergerak, akibatnya hanya molekul-molekul dengan afinitas yang lebih besar
terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Gaya-gaya intramolekul
terjadi karena sifat alamiah permukaan memasukkan suatu diskontinuitas ke
dalam sistem pada setiap bidang antarmuka terdapat efek energi permukaan
pada gaya London yang relatif lemah terbentuk antara semua permukaan
dengan setiap molekul teradsorbsi ataupun antara permukaan yang bersifat
nonpolar dan molekul polar yang teradsorbsi. Ini menginduksikan suatu dwi
kutub pada molekul nonpolar yang besar dan menambah momen dwi kutub
yang sudah ada pada senyawa polar. Gaya-gaya akibat transfer muatan terjadi
antara donor elektron dan akseptor elektron, yang puncaknya mengambil
bentuk seperti ikatan hidrogen. Gaya-gaya yang kuat muncul antara atom-
atom yang terikat secara ionik dan kovalen. Adsorbsi ini adalah fenomena
fisis.
Pada kromatografi adsorbsi, koefisien partisi (Kd ) sama dengan
konsentrasi zat terlarut pada fase teradsorbsi dibagi konsentrasinya pada fase
larutan. Isotherm adsorbsi memberikan pengetahuan tentang jumlah, zat
teradsorbsi persatuan berat adsorben (x/w) dari suatu larutan dengan
konsentrasi c pada kesetimbangan
Kurva isotherm adsorbsi berbentuk lengkung dan tidak pernah linear.
Kapasitas adsorbsi linear didefinisikan sebagai muatan maksimum kolom yang
mungkin tanpa kehilangan kelinearan adsorbsinya. Dia mempunyai harga
tinggi bila luar permukaannya tinggi dan ukuran partikelnya seragam.
KROMATOGRAFI KOLOM | 5
Temperatur tinggi dan eluent yang kuat cenderung menghasilkan isotherm
yang linear. Satu faktor pada kemampuan terpisahkan dari sepasang senyawa
ditentukan oleh volume retensi masing-masing komponennya. Masalah teoritis
utamanya adalah ketergantungan volume retensi zat pada struktur molekul zat
terlarut dan kondisi eksperimental. Tinggi piringan minimum diperoleh pada
kecepatan yang rendah. Ini sebagai akibat koefisien difusi yang rendah pada
fase cairnya. Tingkat adsorpsi untuk suatu volume retensi yang spesifik adalah
volume zat cair yang lewat pada kolom tiap gram adsorben.
2.3 Jenis-Jenis Kromatografi Kolom
Kolom pak terbuat dari stainless steel atau gelas dengan garis tengah
3-6 mm dan panjang 1-5 m. kolom diisi dengan serbuk zat padat halus atau
zat padat sebagai zat pendukung yang dilapisi zat cair kental yang sukar
menguap sebagai fasa diam. Jenis kolom pak ini lebih disukai untuk tujuan
preparatif karena dapat menampung jumlah cuplikan yang banyak.
b. Kolom terbuka (open tubular column).
KROMATOGRAFI KOLOM | 6
Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi
komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap
permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara
pemisahan cair-padat. Substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase
diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase bergeraknya adalah
cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang
kolom. Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa
komponen komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai
afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Apabila kita
mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu melalui kolom yang berisi
zat contoh yang telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka yang
pertama tama dihanyutkan elutor ialah komponen yang paling lemah
terikat kepada adsorben. Komponen komponen lainnya akan dihanyutkan
menurut urutan afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan
daripada komponen komponen tersebut.
Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada
bidang antarmuka di antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak
serta kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya. Antara molekul-
molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada
permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya
secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan
masuk kembali pada fase bergerak. Pada saat teradsorpsi komponen
dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase bergerak yang ditambahkan
secara kontinyu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas
lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen
dengan afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran
pelarut.
KROMATOGRAFI KOLOM | 7
yang permukaannya dilapisi zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat padat
hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase
diamnya. Fase diam zat cair umumnya diadsorpsikan pada penyangga
padat yang sejauh mungkin inert terhadap senyawa-senyawa yang akan
dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap dan menahan fase
diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk
mengalirnya fase bergerak. Penyangga pada umumnya bersifat polar dan
fase diam lebih polar dari pada fase bergerak. Dalam kromatografi partisi
fase bergeraknya dapat berupa zat cair dan gas yang mengalir membawa
komponen-komponen campuran sepanjang kolom. Jika fase bergeraknya
dari zat cair, akan diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini
banyak digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik maupun
anorganik.
Parameter yang di gunakan dalam mengevaluasi kinerja kolom,
setelah mengoptimumkan efesiensi pemisahan secara kromatografi, mutu
kromatografi dapat di kendalikan dengan menerapkan uji kesesuian sistem
tertentu. Salah satu diantaranya adalah perhitungan pelat pelat teoritis
untuk suatu kolom dan terdapat dua parameter utama lainnya untuk
menilai kinerja.
KROMATOGRAFI KOLOM | 8
3. Absorbent mekanik harus cukup kuat untuk menahan penanganan massal
dan getaran yang merupakan fitur dari setiap unit industri. Pemilihan
pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih baik untuk
memilih suatu pelarut yang tidak tergantung pada kekuatan elusi
sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba. kekuatan dari zat
elusi adalah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom.
2.5 Persyaratan Kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di
sembarang tempat sudah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini
dapat dicapai dengan memilih adsorben yang ukuran butir butirnya sama (
diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik. Makin kecil ukuran butir
adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan makin besar
pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin
kecil butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir
melalui kolom. Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat
dipergunakan pompa vakum yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang
di bawah kolom sehingga cairan dapat mengalir lebih cepat melalui kolom.
Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang di atas kolom
dengan menggunakan pompa pneumatic.
KROMATOGRAFI KOLOM | 9
paling bawah terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur. Kapiler
beserta pancur dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah
dilepaskan guna membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga
menjadi bersih dari cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus
sekecil mungkin supaya tidak terjadi pembauran antara cairan cairan yang
keluar dari kolom.
KROMATOGRAFI KOLOM | 10
Persamaan lain yang di gunakan sebagai pengukuran adalah H, tinggi pelat
teoretis
H=L/N eff
Dengan h adalah panjang kolom yang di butuhkan untuk berlangsungnya satu
tahap partisi. (Watson 2005).
KROMATOGRAFI KOLOM | 11
2.10 Pengisian dan cara kerja kolom
Pengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam. Setelah adsorben
dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan
menggunakan vibrator atau dengan plunger. Selain itu juga dikerjakan dengan
memasukkan adsorben dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya
dibiarkan mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam akan mengasilkan
rongga-rongga di tengah-tengah kolom. Cara memecahkan masalah ini dapat
dikerjakan dengan mengadakan sintered glass disk untuk menyangga isian.
Bila kolom telah berisi bahan isian, permukaan cairan tidak boleh dibiarkan
turun ke bawah permukaan bahan isian bagian atas, karena akan memberi
peluang masuknya gelembung-gelembung udara ke dalam kolom.
Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adsorben karena telah
terikat. Ketika eluen di alirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi,
terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-masing
senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam
melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan di dapati beberapa fraksi.
Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda.
Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat di amati
menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung
senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan
spektroskopi.
KROMATOGRAFI KOLOM | 12
2.11 Penggunaan kromatografi kolom
Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan suatu campuran
senyawa organik. Kolom yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam
berupa serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam
dialiri (dielusi) dengan fase gerak berupa pelarut.
Sampel yang mengandung campuran senyawa dituangkan ke bagian atas
dari kolom, kemudian dielusi dengan pelarut sebagai fase gerak. Setiap
senyawa/komponen dalam campuran akan didorong oleh fase gerak dan
sekaligus ditahan oleh fase diam. Kekuatan senyawa ditahan oleh fase diam
akan berbeda dengan senyawa lainnya.
Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi
kolom adalah fase gerak yang digunakan (kepolaran pelarut), ukuran kolom
(diamter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi.
KROMATOGRAFI KOLOM | 13
senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek
molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam
bio-farmasi.
Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat
penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode
analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi
semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
KROMATOGRAFI KOLOM | 14
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative.
Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran.
Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi.
2. Kekurangan kromatografi kolom :
Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan
manual.
Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming).
KROMATOGRAFI KOLOM | 15