BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang
terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi
atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam
bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian
sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan,
kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan
dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir,
ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat
dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu
disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga
jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk
antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada
suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang
non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan
oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA).
Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks
dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat
dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui
biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plateharus dicuci dengan larutan deterjen lembut
untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap
pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi
sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA
yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif .
2.2 Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim,
dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan
sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan
dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif
ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA
tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa
macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain : ELISA Direct, ELISA
Indirect, ELISA Sandwich, dll.
1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRECT
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini
seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel
ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi
keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada ELISA direct,
pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan,
sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang
microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel
pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan
antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk
membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu,
ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan
menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan
antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri,
chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan
enzim.
b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada
percobaan yang berbeda.
d. Amplifikasi signal hanya sedikit.
e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum
digunakan untuk uji ELISA direct.

Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :

a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan
antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.

2. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRECT

ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling
sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur
konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik
(monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi
keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada
permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang
diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi
konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA)
atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang platemikrotiter. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein
lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum
dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi
karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan
antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi
pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang
terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,
ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim
dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi
dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat
enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal.
Kerugian utama dari metodeindirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-
spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada
lubang platemikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus
berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.

ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

a. Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct
karena ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi
interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara
antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut enzim signal,
sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada
saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik tertaut
enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di
pasar.
b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh
penautan enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah
berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki
beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
3. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) SANDWICH
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap
antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich
mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang
diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut
harus dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik
tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada
antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen
yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich,
antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody
sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder
seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu
larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki
tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari
antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody.
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan
dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang.
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat

sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain :
Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-
dinding microtiter.
Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen
sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA
terdahulu, yaitu ELISA direct.
 Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody
detector, kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat
secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap,
semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara
kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang
terimobilisasi.
Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu
teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent
serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama
pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

4. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA

Modern)
Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan
untuk mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini
dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama
dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen
penangkap dan antigen detector (antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila
antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin
biotin yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin
menjadi antibody streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat
molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi
menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi
semakin banyak.

5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Multiplex

Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk
pengujian secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA
terdahulu.

6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) COMPETITIVE

Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahulu.Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor
ke dalam lubang mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk
mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.
Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim
signal, sehingga antibody spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-
dinding lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah
ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang
diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antigen spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat
berinteraksi dengan antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak
berinteraksi dengan antibody spesifik.
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang
tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses
pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signak yang
ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi
dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik
yang dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik
tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian
dinding-dinding mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen
spesifik yang tidak menempel pada dinding-dinding mikrotiter.
Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan
enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara
antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak
berinteraksi dengan antigen spesifik.
Lalu, kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang
tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses
pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin
lemah sinyal yang dihasilkan.
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi
hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari
antibody dan antigen.

2.3 Prinsip Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu
permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua
cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter,
dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang
bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik
ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan
suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka
digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan
antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi
interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas
permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut
dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen
sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat
dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa
pendaran flourescense.

2.4 Contoh Cara Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
a. Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-
60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan
protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan
antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibody yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang
spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG
manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke
enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna, dan
11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin
besar kadar antibody spesifik dalam sampel.

b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-
60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan
protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi
untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik
untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke
enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka
makin besar kadarantigen spesifi dalam sampel.

2.5 Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
Teknik pengerjaan relatif sederhana
Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen
tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen
yang bersifat sangat spesifik)
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis
antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol
negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan
blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan
antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.
Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan
harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan
memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).