JOURNAL READING

DIAGNOSIS OF COMMON BACTERIAL CAUSES OF

URETHRITIS IN MEN BY
GRAM STAIN, CULTURE AND MULTIPLEX PCR

Disusun oleh:
Rezky Putri Wahyu A
012116501

PEMBIMBING
dr. Hj. Pasid Harlisa, Sp. KK

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG
SEMARANG
2015
Malaysian J Pathol 2014; 36(3) : 175 – 180

ORIGINAL ARTIKEL

Diagnosis bakteri penyebab urethritis tersering pada laki-laki dengan

pengecatan gram, kultur dan PCR multiplex
Ferdush JAHAN MPhll, SM SHAMSUZZAMAN MPhll, PhD, dan Sonia AKTER MPhll

Departemen Mikrobiologi, Universitas Kedokteran Dhaka, Dhaka

Abstrak

Urethritis adalah salah satu penyebab tersering morbiditas dan mortalitas di negara yang
sedang berkembang. Tujuan dari penelitian ini untuk mendeteksi bakteri penyebab urethritis
tersering berdasarkan pengecatan gram, kultur dan PCR multiplex. Sebanyak 185 pasien laki-
laki yang berada di Klinik kulit dan kelamin Universitas Kedokteran Dhaka, Bangladesh
menunjukkan gejala klinis sebagai urethritis yang terdaftar pada penelitian ini. Duh tubuh
urethra di periksa untuk mendeteksi Neisseria gonorrhoeae dengan pengecatan gram, kultur
dan PCR. Pemeriksaan PCR multiplex digunakan untuk mendeteksi DNA dari Chlamydia
trachomatis, Ureaplasma urealyticum dan Mycoplasma genitalium. Dari 185 pasien, 30,27%
dan 14,6% masing-masing terinfeksi Neisseria gonorrhoeae dan Chlamydia trachomatis. Dari
pasien yang positif terinfeksi Neisseria gonorrhoeae sebanyak 27,57% menunjukkan hasil
positif dengan pengecatan gram, 26,49% menunjukkan hasil positif dengan kultur, 330,27%
menunjukkan hasil positif dengan PCR (p<0,001). 32,65% dari isolasi Neisseria gonorrhoeae
memproduksi penisilinase dan 83,67% rentan terhadap ceftriaxone. Saat ini kultur merupakan
gold standar, tetapi sensitivitas dan spesifisitas penggunaan PCR untuk mendeteksi Neisseria
gonorrhoeae adalah 100%, dan masing-masing 94,85% dengan ketepatan 96,22%. 3,73%
dari 134 dengan hasil negatif dan 5,15% dari 136 sampel memberikan hasil negatif dengan
kultur menjadi positif dengan PCR. PCR merupakan yang paling sensitif dan metode yang
cepat untuk mendiagnosis urethritis. PCR multiplex mungkin berguna sebagai pendekatan
diagnosis laboratorium pada pasien urethritis dengan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi.

Kata kunci: Urethritis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, pengecatan gram,

kultur, PCR, Bangladesh.

PENDAHULUAN kasus baru gonorrhea setiap tahunnya. 5 Di

Penyakit Menular Seksual (PMS)
disebabkan sejumlah besar agen mikroba
yang menyebabkan morbiditas dan
mortalitas di seluruh dunia.1 Neisseria
gonorrhoeae dan Chlamydia trachomatis
adalah dua bakteri tersering penyebab
PMS. 2-4 Secara umum, didapatkan 88 juta
Bangladesh, prevalensi infeksi Neisseria
gonorrhoeae sebesar 35,5% - 42%.6-8
Jumlah keseluruhan dari kasus baru infeksi
Chlamydial sekitar 101 juta. 5 Prevalensi C.
trachomatis di India yaitu 30,8% diantara
gejala laki-laki dan perempuan, 9 12,3% di
Afrika Selatan terjadi pada laki-laki
dengan urethritis, 10 25 – 43% pada pekerja
seksual di Bangladesh. 7-8
Gonorrhoea pada umumnya
menunjukkan gejala urethritis akut pada
laki-laki11 dan C. trachomatis sering
menginfeksi urethra. 12 Diantara populasi
yang terinfeksi C. Trachomatis, 70-80%
wanita dan sampai 50% pada laki-laki
tidak menunjukkan gejala. 13 N.
gonorrhoeae biasanya menunjukkan
gejala urethritis pada laki-laki, dan kadang-
kadang menjadi epididimitis. 14
Pemeriksaan mikroskopi adalah
pemeriksaan yang cepat, murah dan dapat
dipercaya sebagai metode diagnosis untuk
Neisseria gonorrhoeae jika diperiksa oleh
pemeriksa yang terampil, tetapi biasanya
hanya dapat dipercaya jika dilakukan swab
urethra pada laki-laki yang menunjukkan
gejala. 15 Sensitivitas kultur sampai 85-
95% dan spesifisitas yang tinggi, tetapi
pemeriksaan ini mahal dan membutuhkan
pemeriksa yang terlatih jika terdapat
organisme yang tidak spesifik. 16 Disisi
lain, polymerase chain reaction (PCR)
merupakan metode cepat untuk
17
mengidentifikasi dalam sehari dan
memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang
tinggi. 18 Identifikasi secara langsung pada
organisme penyebab dari bahan PCR telah
mengalami perubahan untuk mendiagnosis
penyakit infeksi. Oleh karena itu,
penelitian ini dibuat untuk
mengidentifikasi agen penyebab umum
dari urethritis yaitu Neisseria gonorrhoeae,
Chlamydia trachomatis, Ureaplasma
urealyticum dan Mycoplasma genitalium
secara langsung dari duh urethra dengan
pengecatan gram, kultur dan PCR
multiplex.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini merupakan penelitian
cross-sectional yang dilakukan pada 185
pasien di Rumah Sakit bagian Kulit dan
Kelamin Universitas Kedokteran Dhaka
periode 1 Juli 2011 sampai 30 Juni 2012.
Pasien laki-laki yang aktif secara seksual
yang menunjukkan gejala klinis urethritis
dengan duh urethra termasuk dalam
kriteria inklusi pada penelitian ini.
Penelitian ini telah disetujui oleh Reseach
Review Committee (RRC) dan Ethical
Review Committee (ERC) Universitas
Kedokteran Dhaka, Dhaka, Bangladesh.
Persetujuan tertulis telah diberikan
sebelum pengambilan sampel. Data
mengenai usia, tingkat pendidikan,
pekerjaan, perilaku berisiko tinggi
misalnya riwayat pajanan dan frekuensi
pajanan, jumlah pasangan seksual dan
riwayat pengguanaan kondom telah dicatat.
Pasien yang mengkonsumsi terapi
antibiotik atau setelah mengkonsumsi
antibiotik dalam tiga hari terakhir
merupakan kriteria eksklusi dari penelitian
ini.
Pengumpulan sampel
Swab urethra yang telah diambil dari 185
pasien dengan membersihkan secara
melingkar pada meatus urethra eksterna
menggunakan swab kapas steril yang
dibasahi dengan larutan saline normal steril
dan melakukan pemijatan sepanjang garis
tengah urethra dari atas kebawah. Tiga
sampel dari duh urethra diperoleh dari
masing-masing pasien. Swab pertama
segera digunakan untuk membuat apusan
pada gelas objek. Swab kedua digunakan
untuk kultur dan swab ketiga dicampur
dengan 2 ml phosphatase buffer saline
(PBS) steril dan disimpan pada suhu 200 C
sampai digunakan untuk PCR.
Proses laboratorium kultur dan sensitivitas
Neisseria gonorrhoeae
Anggapan bahwa untuk mengidentifikasi
Neisseria gonorrhoeae berdasarkan
morfologi koloni, tes oksidasi positif, tes
superoxol positif dan adanya gram negatif
diplococcus intraseluler. Identifikasi
dilakukan dengan uji gula-gula dan PCR.
Semua bahan diperiksa untuk
mengetahui adanya Neisseria gonorrhoeae
dengan pengecatan gram dan kultur
menggunakan media Thayer Martin. Gram
negatif diplococcus intraseluler dan banyak
sel-sel inflamasi ditemukan pada
pengecatan gram menunjukkan Neisseria
gonorrhoeae. Cawan inokulasi diinkubasi
pada suhu 370 C di atmosfer CO2 selama
24-48 jam.
Semua gonococcus yang diisolasi
di tes produksi β-laktamase (penisilinase)
dengan metode paper acidometric.19
Pengujian kerentanan antimikroba
dilakukan dengan pedoman CLSI. Tes
antibiotik dengan penisilin (10 unit),
tetracycline (30µg), ceftriaxone (30µg),
ciprofloxacin (5µg), cefixime (5µg) dan
cefuroxime (30µg).
Ekstraksi DNA
Sampel dicairkan kemudian diberi
vortexed untuk menghomogenkan suspensi
dan sekitar satu mililiter diletakkan di
tabung mikrosentrifuse. Sampel ini
disentrifuse dengan kecepatan 13000rpm
selama 10 menit dan supernatan dibuang.
Setelah supernatan dibuang dengan
aspirasi, pellet dihentikan menggunakan
buffer 100 µl litik dengan non ion detergen
tween 20 (0,45%) dan proteinase K (200
µg/ml), diinkubasi 600 C selama satu jam,
kemudian tabung disimpat blok pemanas
(DAIHA, Scientific, Seoul, Korea) pada
950 C selama 10 menit untuk
menginaktivasi proteinase K. Setelah di
sentrifuse dengan kecepatan 13500 rpm
selama 10 menit supernatan dipindah
kedalam tabung sentrifuse lain dan
disimpan di dalam es atau disimpan dalam
suhu -200 C untuk PCR amplifikasi.
DNA Amplifikasi
Oligonukletida primer digunakan untuk
PCR amplifikasi DNA dari Neisseria
gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis,
Ureaplasma urealyticum dan Mycoplasma
genitalium. DNA Neisseria gonorrhoeae
dideteksi dengan PCR yang akan
mengurutkan gen cppB menggunakan HO1
primer
(5’GCTACGCATACCCGCGTTGC3’),
HO2
(5’CGAAGACCTTCGAGCAGAC3’). 20
DNA Chlamydia trachomatis di deteksi
dengan PCR yang akan mengurutkan
cryptic plasmid menggunakan KL 1 primer
(5’TCCGGAGCGAGTTACGAAGA3’),
KL 2
(5’AATCAATGCCCGGGATTGGT3’). 21
DNA Ureaplasma urealyticum dideteksi
dengan PCR yang akan mengurutkan gen
urease menggunakan U4 primer
(5’ACGACGTCCATAAGCAACT3’), U5
(5’CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC3’).
22
DNA Mycoplasma genitalium dideteksi
dengan PCR yang akan mengurutkan gen
adhesin menggunakan MgPa-1 primer
(5’AGTTGTGAAACCTTAACCCCTTGG
3’), MgPa-3
(5’CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTT
GC3’). 23 Produk amplifikasi dari Neisseria
gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis,
Ureaplasma urealyticum dan Mycoplasma
genitalium masing-masing adalah 390bp,
241bp, 429bp dan 281bp. Untuk masing-
masing sampel, campuran total 12,5 µl
dibuat dengan mencampur 12,5 µl dari
mastermix (campuran dari dNTP, taq
polimerase Mgcl2 dan PCR buffer), 2 µl
dari forward primer (Promega Corporation,
USA), 2 µl dari reverse primer, 2 µl dari
DNA template dan 6,5 µl dari destilasi air
steril di tabung PCR untuk N.
gonorrhoeae. PCR multiplex, volume
reaksi 25 µl mengandung 12,5 µl dari
mastermix, 1 µl dari forward dan reverse
primer dari Chlamydia trachomatis,
Ureaplasma urealyticum dan Mycoplasma
genitalium, 2 µl dari masing-masing DNA
template dan nuclease free water
ditambahkan untuk membuat volume 25
µl.
Semua reagen ditempatkan di 0,2
ml tabung PCR, kemudian di sentrifuse
secara singkat untuk membuang
gelembung. Tiga puluh enam siklus dari
amplifikasi dilakukan di DNA thermal
cycler (Eppendorf AG, Mastercycler
gradient, Hamburg, Germany). Masing-
masing siklus terdiri dari tahap denaturasi
selama satu menit pada suhu 940C, tahap
annealing selama 45 detik pada suhu 620
C, dan tahap amplifikasi selama satu menit
tiga puluh detik pada suhu 720 C untuk N.
gonorrhoeae. Untuk PCR multiplex,
masing-masing siklus terdiri dari tahap
denaturasi selama satu menit pada suhu
940C, tahap annealing selama 45 detik
pada suhu 550 C, dan tahap amplifikasi
selama satu menit tiga puluh detik pada
suhu 720 C. Masing-masing reaksi
didahului initial denaturasi selama 10
menit dan diikuti tahap extension akhir
selama 10 menit. Amplifikasi DNA dimuat
dalam 1,5% gel agarose, elektroforesis
dengan tegangan 100 volt selamat 30
menit, pewarnaan dengan 1% ethium
bromide, destained di destilasi air selama
20 menit dan terlihat dibawah sinar UV
(Gambar 1).
HASIL
Usia rata-rata pasien 27 ± 7 tahun (rentan
15-50 tahun). Dari 83 pasien yang
terinfeksi, sebanyak 54 (65,06%) pasien
berusia 21-40 tahun dan 51,81% berusia
21-30 tahun. Sebagian besar pasien yang
terinfeksi bekeja sebagai sopir (28,57%
terinfeksi gonococcus dan 29,63%
terinfeksi chlamydial). 55,36% terinfeksi
gonococcus dan 51,85% terinfeksi
chlamydial dengan tingkat pendidikan
dibawah sekolah menengah. Sebagian
besar pasien yang terinfeksi (60,24%)
terjadi pada kelompok dengan pendapatan
rendah. Dari 56 pasien yang terinfeksi, 32
(57,14%) pasien melakukan hubungan
seksual diluar nikah, 3 (5,36%) pasien
tidak melakukan hubungan seksual diluar
nikah dan 21 (37,50%) pasien belum
menikah. Dari 27 pasien yang terinfeksi
Chlamydial, 14 (51,85%) pasien
melakukan hubungan seksual diluar nikah,
2 (7,41%) pasien tidak melakukan
hubungan seksual diluar nikah dan 11
(40,74%) pasien yang belum menikah.
Dari 185 partisipan, 7 partisipan
selalu menggunakan kondom dan satu
(14,28%) pasien yang terinfeksi N.
gonorrhoeae. Dari 70 partisipan yang
kadang-kadang menggunakan kondom, 14
(20%) pasien terinfeksi N. gonorrhoeae
dan 9 (12,86%) terinfeksi Chlamydia
trachomatis. Dari 108 partisipan yang
tidak pernah menggunakan kondom, 41
(37,96%) pasien terinfeksi N. gonorrhoeae
dan 18 (16,67%) terinfeksi Chlamydia
trachomatis. Dari 5 individu yang
memiliki lebih dari 3 pasangan seksual
perminggu, 3 (60%) dan 2 (40%) pasien
masing-masing mengalami infeksi
gonococcus dan chlamydia. Dari 68 pasien
yang memiliki 2-3 pasangan seksual
perminggu, 38 (55,88%) dan 15 (22,06%)
Gambar 1: PCR multiplex menunjukkan
gel elektriforesis DNA amplifikasi dari N.
gonorrhoeae dan C. trachomatis. L1 dan
L3: N. gonorrhoeae sampel positif; L2:
Streptococcus pneumoniae (kontrol
negatif); L4: N. gonorrhoeae (kontrol
positif); L5: 100bp DNA ladder; L6: C.
trachomatis (kontrol positif); L7: C.
trachomatis sampel positif; L8: H.
influenzae (kontrol negatif).
pasien masing-masing mengalami infeksi
gonococcus dan chlamydial.
N. gonorrhoeae yang dideteksi
dengan pengecatan gram dari 27,57%
kasus yang kemudian dikonfirmasi dengan
kultur menjadi 26,49% kasus. PCR
multiplex menunjukkan hasil positif untuk
N. gonorrhoeae pada 56 (30,27%) kasus
dan pada C. trachomatis sebanyak 27
(14,6%) kasus (Tabel 1). PCR lebih baik
untuk mendeteksi N. gonorrhoeae
dibandingkan kultur dan pewarnaan gram
(p<0,001). PCR multiplex dapat
mendeteksi Ureaplasma urealyticum dan
Mycoplasma genitalium tetapi dalam
sampel penelitian ini tidak didapatkan hasil
yang positif. Tidak ada pasien yang secara
bersamaan didapatkan positif terinfeksi N.
gonorrhoeae dan C. Trachomatis. Dari 114
kasus diduga memiliki riwayat paparan, 68
(59,65%) kasus ditemukan terinfeksi; dari
keseluruhan 47 (41,23%) kasus dan 21
(18,42%) kasus masing-masing terinfeksi
N. gonorrhoeae dan C. Trachomatis. Dari
71 kasus yang tidak memiliki riwayat
terpapar, 15 (21,13%) kasus yang
terinfeksi; dari 9 (12,68%) kasus dan 6
(8,45%) kasus yang masing-masing
terinfeksi N. gonorrhoeae dan C.
Trachomatis (Tabel 2).
Dari 185 sampel, 49 sampel positif
dengan pemeriksaan PCR dan kultur, 7
dari 136 hasil kultur negatif tetapi dengan
PCR memberikan hasil positif (Tabel 3).
Mengingat baku eman saat ini adalah
kultur, tetapi PCR memiliki sensitivitas
100% dan spesifisitas 94,85% dengan
positive predictive value sebesar 87,5%,
negative predictive value sebesar 100%
dan ketepatan 96,22%. Dari isolasi N.
gonorrhoeae, 83,67% sensitif terhadap
pemberian ceftriaxone; 75,51% cefixime
dan 55,10% ciprofloxacin. Resisten untuk
ciprofloxacin tetracycline masing-masing
sebesar 44,90% dan 46,94%.
DISKUSI
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
menemukan tes diagnostik yang cepat
untuk mendeteksi agen mikroba yang
berbeda peyebab urethritis dari 185 laki-
laki secara klinis diduga urethritis. Pada
penelitian ini, angka infeksi gonococcus
sebesar 30,27% dari 185 pasien laki-laki
yang aktif secara seksual. Angka infeksi N.
gonorrhoeae pada penelitian ini konsisten
dengan penelitian sebelumnya yang
dilakukan pada pekerja seks komersial
yang ditemukan dengan angka isolasi N.
gonorrhoeae masing-masing sebesar
35,8% dan 35,5% pada pekerja seksual di
hotel dan tepi jalan. 7,8 Di sisi lain, jumlah
yang sangat sedikit 11% dari 669 pasien
positif terinfeksi gonococcus pada
24
penelitian lain. Adanya perbedaan angka
infeksi gonococcus dimungkinkan karena
perbedaan populasi, daerah, sosial dan
kebiasaan seksual pasien.
Pada penelitian ini Chlamydia
Trachomatis dideteksi sebesar 14,6%
dengan duh pada urethra. Infeksi
Chlamydial positif pada 12,3% pada pasien
dengan duh pada urethra di Afrika
Selatan10 yang sesuai dengan penelitian ini.
Pada penelitian ini menunjukkan, tidak
adanya infeksi akibat Ureaplasma
urealyticum dan Mycoplasma genitalium
yang dideteksi dengan PCR. Penelitian lain
mendeteksi angka M. genitalium sekitar
10% tetapi U. urealyticum tidak terdeteksi
pada populasi Afrika. 25 Di sisi lain,
penelitian di Teheran dilaporkan prevalensi
M. genitalium sekitar 7,2% dan U.
urealyticum 19,2%.26
 Pada penelitian ini, dari isolasi N.
gonorrhoeae, yang sensitif terhadap
ceftriaxone sebesar 83,67%.
Dari 185 kasus, 56 kasus N.
gonorrhoeae didiagnosis dengan PCR, 49
didiagnosis dengan kultur dan 49 positif
dengan PCR dan kultur, sebanyak 7 kasus
positif dengan PCR tetapi negatif dengan
kultur. Perbedaan ini dimungkinkan karena
adanya bakteri yang mati atau
pertumbuhan terhambat. Mengingat baku
eman saat ini adalah kultur, tetapi PCR
memiliki sensitivitas 100% dan spesifisitas
94,85% dengan positive predictive value
sebesar 87,5%, negative predictive value
sebesar 100% dan ketepatan 96,22%.
Perbedaan hasil positif antara kultur dan
PCR secara statistik signifikan (p<0,0001).
Penelitian sebelumnya menunjukkan nilai
sensitivitas antara 96,6% sampai 100%.27,28
Pada penelitian ini, sampel urethra
tidak subjektif untuk kultur Chlamydia
Trachomatis dan Mycoplasma genitalium.
Hal ini dikarenakan kurang terpenuhinya
fasilitas kultur dan skill untuk
menumbuhkan organisme ini di
laboratorium.
Penelitian ini, 14,28% pasien
gonorrhoea memiliki riwayat penggunaan
kondom selama melakukan hubungan
seksual. Penelitian lain, infeksi gonococcus
dari pasien yang dilaporkan menggunakan
kondom terus-menerus sebanyak 8% dan
23% pasien dilaporkan menggunakan
kondom secara tidak teratur. 29 Temuan ini
sesuai dengan penelitian ini. Beberapa
diantara kasus infeksi yang didapat
meskipun menggunakan kondom secara
tertaur dan kegagalan dikarenakan 1)
penggunaan kondom yang mungkin masih
dapat menembus dan menuju urethra untuk
menginfeksi 2) memberikan keterangan
palsu sehingga menyebabkan positif palsu
3) kondom yang rusak. Telah cukup
terbukti bahwa kondom yang digunakan
dengan benar dan konsisten efektif untuk
memberikan perlindungan terhadap semua
PMS termasuk infeksi gonococcus.
Deteksi akurat untuk mengetahui
penyebab urethritis diperlukan karena
pilihan terapi untuk urethritis gonococcus
berbeda dengan urethritis nongonococcus.
Penelitian ini menunjukkan bahwa PCR
multiplex merupakan alat yang berguna
untuk mendeteksi cepat dari N.
gonorrhoeae, C. Trachomatis, Ureaplasma
urealyticum dan Mycoplasma genitalium
dari duh urethra pada laki-laki dengan
urethritis.
PCR multiplex merupakan teknik
yang paling cepat dan sensitif untuk
mendiagnosis urethritis gonococcus dan
non-gonococcus. PCR multiplex dapat
direkomendasikan terutama pada pasien
yang diduga secara klinis urethritis tetapi
memberikan hasil yang negatif pada
metode konvensional. Peneliti
menyarankan untuk penelitian yang akan
datang dilakukan di Bangladesh untuk
mengidentifikasi Mycoplasma genitalium
dan Ureaplasma urealyticum yang tidak
terdeteksi pada penelitian ini sebagai
organisme yang diketahui dapat
menyebabkan urethritis non-gonococcus.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terima kasih kepada

Rumah Sakit bagian Departemen Penyakit
Kulit dan Kelamin Universitas Dhaka
karena mengizinkan untuk mengambil data
penelitian. Kami sangat berterima kasih
kepada Departemen Mikrobiologi
Universitas Kedokteran Dhaka untuk
membantu secara teknis.