Laporan Analisis protein

Secara Kualitatif dan Kuantitatif

Disusun oleh :

Sekar nurani saptaningtyas (652016010)

Stelly Revina Prabowo (652016016)

Fransiskus Tri Wahyu H (652016021)

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA

SALATIGA

2018
 Laporan praktikum analisis protein

Nama : 1. Sekar Nurani Saptaningtyas (652016010)

2. Stelly Revina Prabowo (652016016)

3. Fransiskus Tri Wahyu H (652016021)

Kelompok : pagi

Tanggal : 1 Februari dan 8 Februari 2018

Judul : Analisis Protein Secara Kualitatif Dan Kuantitatif

Tujuan
1. Menentukan sifat fisik protein.
2. Menentukan protein yang mengalami denaturasi.
3. Menentukan protein yang mengandung asam amino.
4. Menetapkan kadar protein t dari sampel berdasarkan metoda Kjeldahl untuk protein
total dan metode Lowry untuk protein terlarut .
Pendahuluan
Pemecahan protein dalam metabolisme tidak secara khusus menghasilkan zat pembawa
energi, meskipun asam amino menghasilkan energi ketika mereka dipecah. Asam amino
penting sebagai metabolit yang dapat digunakan oleh organisme dalam proses anabolik untuk
membangun protein sendiri. Energi untuk proses ini berasal dari katabolisme karbohidrat
(Salazar, 2016).
Banyak asam amino biologis aktif dalam organisme itu sendiri (seperti glutamat atau
glisin) atau dengan perubahan kecil struktural (seperti serotonin monoamine, yang terbentuk
dari triptofan, dan katekolamin, yang berasal dari tirosin) atau asam amino Umum struktur
peptida (rantai asam amino kecil). Mereka aktif sebagai neurotransmitter dalam jaringan saraf,
di mana mereka terhubung sel saraf fungsional dengan mengirimkan impuls listrik kimia dari
akson ke reseptor pada akson atau sel tubuh dari sel berikutnya. Beberapa memiliki fungsi
penting sebagai garam empedu (glisin dalam asam glikokolat), dalam reaksi metilasi
(metionin), atau peradangan (histamin dari histidin). Tiroksin merupakan turunan dari tirosin,
dan fungsi sebagai zat hormonal penting bagi laju metabolisme. Oksitosin, vasopressin dan
insulin adalah hormon peptida, yang efek kontraksi otot polos di rahim, kontraksi otot polos
dalam pembuluh darah, dan metabolisme karbohidrat masing-masing. Banyak dari senyawa ini
juga dikenal untuk mempengaruhi kesadaran. Serotonin andhistamine dibebaskan dari
sengatan lebah memicu sensasi yang kuat dari nyeri serta localinflammation. Skizofrenia kita
menemukan tingkat peningkatan serotonin dan katekolamin, termasuk dopamin. Dalam depresi
endogen, kurangnya serotonin dan katekolamin metabolisme ditemukan. Efek merangsang
kopi pada kesadaran karena pengaruhnya merangsang metabolisme monoamine. Stimulan
kesadaran seperti kokain dan LSD meniru aksi sistem saraf pusat katekolamin dan serotonin
masing-masing. Laju metabolisme monoamine bervariasi dengan irama tidur dan bangun
dalam organisme yang sehat (Tellingen, 2001).
Protein dibangun dari asam amino yang bergabung melalui ikatan peptida antara
karboksil dan amino (dan imino dalam kasus prolin) kelompok asam amino berikutnya. Rantai
polipeptida ini dilipat ke dalam struktur tiga dimensi untuk membentuk protein. Struktur primer
atau urutan asam amino dalam protein adalah pra-ditentukan dalam kode genetik. Dua puluh
asam amino alami yang disebut asam amino proteinogenic yang membangun protein dalam
organisme hidup. Dengan beberapa pengecualian, hanya L-isomer yang dimasukkan ke dalam
protein (EFSA, 2012).
Protein adalah makromolekul polimer terbuat dari blok bangunan asam amino yang diatur
dalam rantai linear dan bergabung bersama oleh ikatan peptida. Struktur primer biasanya
diwakili oleh urutan huruf alfabet, ada 20 huruf terkait dengan 20 asam amino alami. Protein
penyusun komponen utama dan molekul fungsional sel, dengan hampir 20% dari berat sel
eukariotik yang memiliki kontribusi terbesar setelah air (70%). Salah satu masalah yang paling
penting dalam biologi komputasi modern adalah memprediksi struktur protein. Oleh karena itu
menjadi semakin penting untuk memprediksi struktur protein dari urutan asam amino, dengan
menggunakan wawasan yang diperoleh dari struktur sekunder sudah dikenal.Struktur
ditentukan oleh urutan kelompok masing-masing asam amino ke dalam elemen struktur
sekunder yang sesuai (misalnya, alpha, beta, atau gamma) (Falvo, 2015).
Struktur Protein:
a. Struktur Primer
Struktur primer merupakan struktur yang sederhana dengan urutan-urutan asam amino yang
tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi
percabangan rantai. Struktur primer terbentuk melalui ikatan antara gugus α–amino dengan
gugus α–karboksil. Ikatan tersebut dinamakan ikatan peptida atau ikatan amida. Struktur ini
dapat menentukan urutan suatu asam amino dari suatu polipeptida
b. Struktur Sekunder
Alpha helix dapat dianggap komponen utama untuk struktur sekunder. Meskipun energi
potensial tidak serendah untuk partikel beta, pembentukan ikatan H adalah intra-strand,
sehingga ada keuntungan entropis bagi partikel beta, di mana ikatan H harus terbentuk dari
struktur sekunder, dengan segmen untai yang mungkin cukup jauh di urutan polipeptida. Dua
jenis utama dari struktur sekunder,
alpha helix dan untai beta, yang diusulkan pada tahun 1951 oleh Linus Pauling dan rekan kerja.
Struktur sekunder didefinisikan oleh pola ikatan hidrogen antara kelompok peptida utama
rantai.
c. Struktur Tersier
Interaksi hidrofobik lipat didorong oleh non-spesifik (penguburan residu hidrofobik dari air),
tetapi struktur yang stabil hanya ketika bagian dari domain protein terkunci pada tempatnya
oleh interaksi tersier tertentu, seperti jembatan garam, ikatan hidrogen , dan kemasan ketat
rantai samping dan ikatan disulfida. Obligasi disulfida sangat langka dalam protein sitosolik,
karena sitosol umumnya lingkungan mengurangi.
d. Struktur Kuarter
Struktur kuartener protein dapat ditentukan dengan menggunakan berbagai teknik
eksperimental yang memerlukan sampel protein dalam berbagai kondisi eksperimental.
Percobaan sering memberikan perkiraan massa protein asli dan, bersama-sama dengan
pengetahuan tentang massa dan/atau stoikiometri dari subunit, memungkinkan struktur
kuaterner untuk diprediksi dengan akurasi yang diberikan. Hal ini tidak selalu mungkin
mendapatkan penentuan tepat komposisi subunit untuk berbagai alasan. Subunit sering
berhubungan satu sama lain dengan operasi simetri, seperti sumbu 2 kali lipat dalam dimer.
Multimers terdiri dari subunit identik disebut dengan awalan "homo" (misalnya homotetramer
) dan terdiri dari subunit yang berbeda disebut dengan awalan "hetero-" (misalnya
heterotetramer, seperti dua alpha dan dua rantai beta hemoglobin) (Tellingen, 2001).

Alat Bahan dan metode

Alat bahan :
1. Uji kualitatif protein
o Uji fisik
Alat Bahan
Tabung reaksi Bekatul
Pipet tetes Susu bubuk
Pipet ukur Putih telur
Pilius HCl 4%
Gelas beker NaOH 4%
Bunsen Aquades
Kaki tiga
Kasa

o Uji persipitasi
Alat Bahan
Tabung reaksi Bekatul
Pipet tetes Susu bubuk
Putih telur
CuSO4
 o Uji ninhidrin
Alat Bahan
Tabung reaksi Bekatul
Pipet tetes Susu bubuk
Pipet ukur Putih telur
Pilius Ninhidrin
Gelas beker Aquades
Bunsen
Kaki tiga
Kasa

2. Uji kuantitatif protein

o Metode kjeldahl
Alat Bahan
Spektrofotometrer H2SO4 pekat
Tabung reaksi Garam kjeldahl
Pemanas Kjeldahl Asam borat
Alat distilasi Bekatul
Buret Susu bubuk
Erlenmeyer Putih telur
Spatula BSA
Gelas beaker HCl
Pipet ukur aquades
Pilius
Corong

o Metode lowry
Alat Bahan
Spektofotometer Bekatul
Pipet tetes Susu bubuk
Pipet ukur Putih telur
Labu takar BSA
Spatula Reagen Lowry
Beaker glass Reagen Folin
Aquades
Metode :
1. Uji Fisik
 Masukkan sampel kedalam tabung reaksi dan beri label A,B dan C
 Tabung yang telah berisi sampel ditambahkan larutan HCl 4%,NaOH 4%,
aquades.
A + 0,5 mL HCl 4%
B + 0,5 mL NaOH 4%
C + 0,5 aquades
 Tabung C dipanaskan dalam air mebdidih 10 menit dan amati perubahan
yang terjadi.
 Tabung A dan B dinetralkan dengan basa/asam dan amati perubahan yang
terjadi.

2. Uji Persipitasi
 2 mL sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi.
 Tabung yang berisi sampel ditambahkan dengan larutan CuSO4 2%,amati
perubahan yang terjadi.
 Kemudian tambahkan CuSO4 secara berlebih dan amati juga perubahan yang
terjadi.

3. Uji Ninhidrin
 Diteteskan 5 tetes Ninhidrin 0,2% masing-masing ke dalam tabung reaksi A,
B, C, yang berisi :
Tabung A berisi 1 mL larutan sampel 0,1%.
Tabung B berisi 1 mL air
 Dipanaskan dalam air mendidih ± 1 menit.
 Diamati perubahan yang terjadi.

4. Metode Kjeldahl
a. Destruksi
 Ditimbang sampel sesberat 1 gram dan garam kjehdahl seberat 1 gram dan
dimasukan dalam gelas destruksi.
 Dimasukan H2SO4 pekat 10 mL dan batu didih ke dalam labu destruksi.
  Alat destruksi dirangkai.
 Dilakukan proses destruksi hingga warna larutan berubah menjadi bening.
 Larutan didinginkan dan ditambahkan 10 mL akuades.
b. Destilasi
 Dirangkai alat destilasi.
 Ditambahkan NaOH 30% ±5 mL pada alat destilasi.
 Dipasangkan labu destruksi pada alat destilasi.
 Dipasangkan destilat yaitu asam berupa asam borat 2% 10 mLyang ditambahkan
indikator campuran.
 Ditambahkan NaOH 30% hingga volumenya ± 200 mL.
 Ditutup aliran NaOH kemudian steam dinyalakan. Destilasi dijalankan sampai
destilat bervolume 200 mL
 Steam dimatikan dan kemudian dibuka aliran keluar untuk mengeluarkan
NaOH.
c. Titrasi
 Disiapkan larutan HCl 0,05 M di dalam buret dan distandarisasi dengan larutan
boraks.
 Dititrasi destilat dengan HCl.
 Titik akhir titrasi ditunjukkan dengan perubahan warna larutan menjadi merah
muda.

5. Metode Lowry
 Ditimbang padatan protein murni sebanyak 0,005 gram
 Dilarutkan dengan aquades.
 Dimasukkan pada lanu ukur 25 mL,lalu ditambahkan aquades hingga batas
tera.
 Diambil 0,1;0,2;0,4;0,6;0,8;1,0 mL dan dimasukkan dalam tabung reaksi
 Ditambahkan aquades sampai volume total 1 mL
 Ditambahkan 5,5 mL reagen folin,kemudian digoyangkan dan didiamkan
selama 15 menit.
 Ditambahkan 0,5 Reagen Lowry B,goyangkan dengan cepat.
 Didiamkan selama 30 menit sampai larutan menjadi biru .
 Ditimbang sampel (bekatul) sebanyak 5 gram
  Dilarutkan dengan 50 mL aquades pada gelas kimia.
 Diambil 0,1;0,2;0,4;0,6;0,8;1,0 mL dan dimasukkan dalam tabung reaksi
 Ditambahkan aquades sampai volume total 1 mL
 Ditambahkan 5,5 mL reagen folin,kemudian digoyangkan dan didiamkan
selama 15 menit.
 Ditambahkan 0,5 Reagen Lowry B,goyangkan dengan cepat.
 Didiamkan selama 30 menit sampai larutan menjadi biru .
 Dimasukkan blanko,larutan standar dan sampel kedalam kuvet.
 Dilakukan uji pada panjang gelombang 670 nm.
 Dibuat kurva standar dari hasil pengujuran tersebut.
 Diukur dan dicatat absorbansinya sampel.

Hasil Pengamatan
a. Uji fisik
o Sampel bekatul
Sampel Perubahan
A + HCl ↓Larut, Putih
B + NaOH Larut, kuning Bening
C + Akuades Tidak Larut, keruh
A + HCl + NaOH Larut, kuning bening
B + NaOH + HCl Larut,kuning bening
C + Akuades + Dipanaskan Tidak larut,kining keruh ↓

o Sampel susu bubuk

Sampel Perubahan
A + HCl ↓Larut, Putih
B + NaOH Tidak Larut, putih
C + Akuades Larut sebagian, Bening
A + HCl + NaOH Larut ,putih
B + NaOH + HCl Larut ,putih
C + Akuades + Dipanaskan Putih↓
 o Sampel putih telur
Sampel Perubahan
A + HCl ↓Larut, Putih
B + NaOH Tidak Larut, Bening
C + Akuades Tidak Larut, Bening
A + HCl + NaOH Larut ,Bening
B + NaOH + HCl Larut, Bening
C + Akuades + Dipanaskan Larur, Putih keruh

b. Uji Presipitasi
Sampel + CuSO4 +CuSO4 berlebih
Bekatul ↓ hijau muda + ↓ hijau
Susu bubuk Larut ,biru muda Larut , ↓ putih
Putih telur ↓ putih++,larutan biru ↓ putih .larutan biru

c. Uji ninhidrin
Sampel Sebelum Dipanaskan Sesudah Dipanaskan
Bekatul Bening ↓ 𝑏𝑖𝑟𝑢
Susu bubuk Kuning ++ ungu ++
Putih telur Bening Biru ++

d. Metode kjeldahl
Sampel (1) Sampel (2)
Berat sampel 1 gram 1 gram
V awal 0 0
V ahkir 34,5 35
V ditambah 34,5 35
V rata-rata 34,75
 Perhitungan % protein
Kadar Protein Bekatul 1

𝑉𝑜𝑙 𝐻𝐶𝑙 ×𝑁 𝐻𝐶𝑙×14,007

%N = × 100%
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
34,5 𝑚𝐿 ×0,05 𝑁×14,007
%N = × 100%
1𝑔
34,5 𝑚𝐿 ×0,05 𝑁×14,007
%N = × 100%
1000 𝑚𝑔

%N = 2,4162 %

% Protein = %𝑁 × 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑘𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖

% Protein = 2,4162% × 6,25
% Protein = 15,10125 %

Kadar Protein Bekatul 2

𝑉𝑜𝑙 𝐻𝐶𝑙 ×𝑁 𝐻𝐶𝑙×14,007

%N = × 100%
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
35 𝑚𝐿 ×0,05 𝑁×14,007
%N = × 100%
1𝑔
35 𝑚𝐿 ×0,05 𝑁×14,007
%N = × 100%
1000 𝑚𝑔

%N = 2,4512 %

% Protein = %𝑁 × 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑘𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖

% Protein = 2,4512% × 6,25
% Protein = 15,32 %

15,10125+15,32
Kadar protein rata-rata = = 15,2106 %
2

e. Metode lowry
o BSA
No. Volume (mL) Konsentrasi absorbansi

1 0,1 100 0,038

2 0,2 200 0,073
 3 0,4 400 0,141
aq4 0,6 600 0,216
5 0,8 800 0,270
6 1,0 1000 0,402
o Sampel (bekatul)
No. Volume (mL) Konsentrasi absorbansi

1 0,1 1000 0,094

2 0,2 2000 0,127
3 0,4 4000 0,292
4 0,6 6000 0,491
5 0,8 8000 0,695
6 1,0 10000 0,991

kurva baku
0.45
0.4 y = 0.0004x - 0.0113
R² = 0.9941
0.35
Nilai Absorbansi

0.3
0.25
0.2 Series1
0.15 Linear (Series1)
0.1
0.05
0
0 200 400 600 800 1000 1200
konsentrasi

Perhitungan kadar protein

y = 0,0004x – 0,0113
0,127 = 0,0004x – 0,0113
0,127 + 0,0113
x = 0,0004
= 345, 75
345,75
Kadar protein = × 100%
2000

= 17,28%
Pembahasan
Uji Fisik
Pada praktikum ini dilakukan uji fisik terhadap protein pada berbagai kondisi.
Sampel protein yang digunakan adalah putih telur (albumin),bekatul dan susu bubuk.
Albumin,bekatul dan susu bubuk akan di uji pada kondisi pH ekstrim serta suhu tinggi.
Dari hasil praktikum dapat diketahui bahwa pada tabung C sampel albumin,ketika albumin
berada di dalam akuades, albumin tidak dapat larut kemudian ketika dipanaskan albumin
berubah menjadi endapan atau gumpalan berwarna putih hal ini dikarenakan albumin
mengalami denaturasi. Sedangkan tabung C dengan sampel bekatul yang berada didalam
akuades bekatul tidak larut kemudian dipanaskan menimbulkan endapan kuning dan
larutan menjadi kuning jerami, Pada tabung C yang berisi sampel susu bubuk terbentuk
endapan putih .
Pada tabung A ketika albumin berada di dalam HCl, albumin dapat larut dan
terdapat endapan atau gumpalan putih namun hanya sedikit, kemudian albumin dinetralkan
dengan NaOH dan albumin menjadi larut serta endapan atau gumpalan putih tidak
terbentuk. Pada tabung B ketika albumin berada di dalam NaOH, albumin dapat larut dan
larutan tidak berwarna (bening), kemudian dinetralkan dengan HCl dan albumin tetap larut
dan larutan tidak berwarna (bening). Dari pengujian tersebut dapat dilihat bahwa putih
telur(albumin) mengalami perubahan struktur molekul protein.
Pada tabung A ketika bekatul berada di dalam HCl, bekatul dapat larut sebagian
dan terdapat endapan kuning namun hanya sedikit, kemudian bekatul dinetralkan dengan
NaOH dan bekatul menjadi larut serta endapan atau tidak terbentuk. Pada tabung B ketika
bekatul berada di dalam NaOH, bekatul dapat larut dan larutan berwarna kuning jerami,
kemudian dinetralkan dengan HCl dan bekatul tetap larut dan larutan berwarna kuning
jerami. Dari pengujian tersebut dapat dilihat bahwa bekatul mengalami perubahan struktur
molekul protein.
Pada tabung A ketika susu bubuk berada di dalam HCl, susu bubuk dapat larut
sebagian dan terdapat endapan putih namun hanya sedikit, kemudian susu bubuk
dinetralkan dengan NaOH dan susu bubuk menjadi larut serta endapan putih tidak
terbentuk. Pada tabung B ketika susu bubuk berada di dalam NaOH, susu bubuk dapat larut
dan larutan berwarna putih kemudian dinetralkan dengan HCl dan susu bubuk tetap larut
dan larutan berwarna putih. Dari pengujian tersebut dapat dilihat bahwa v mengalami
perubahan struktur molekul protein.
 Uji Presipitasi
Pada praktikum ini dilakukan uji presipitasi terhadap protein, sampel protein yang
digunakan adalah putih telur (albumin),bekatul,susu bubuk. Protein sendiri dapat
mengalami denaturasi irreversible ketika terdapat logam berat seperti Cu2+, Hg2+, Pb2+ oleh
sebab itu protein akan mudah mengendap. Jika protein yang bermuatan negative atau sering
disebut dengan protein dengan pH larutan diatas titik isoelektrik maka akan mudah di
endapkan oleh ion positif atau logam. Sebaliknya, jika protein yang bermuatan positif atau
sering disebut dengan protein dengan pH larutan di bawah titik isoelektrik maka akan
membutuhkan ion negative. Logam berat sendiri dapat menarik sulfur pada protein dan
mengganggu ikatan disulfide pada protein sehingga akan menyebabkan protein mengalami
denaturasi. Dari hasil praktikum, ketika albumin ditambahkan dengan 2 tetes CuSO4
larutan berubah warna menjadi biru dan terdapat endapan putih, hal ini menunjukkan
bahwa reaksi antara albumin dengan CuSO4 positif mengalami denaturasi. Namun ketika
ditambahkan dengan CuSO4 berlebih, endapan yang dihasilkan menjadi sedikit atau larut
sehingga hal ini menunjukkan reaksi dengan CuSO4 berlebih adalah negative mengalami
denaturasi. Pada susu bubuk ketika ditambahkan 2 tetes CuSO4 larutan menjadi berwarna
bitu muda dan tidak terdapat endapan,hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara susu bubuk
dengan CuSO4 negatif mengalami denaturasi. Namun ketika susu bubuk ditambahkan
dengan CuSO4 berlebih terbentuk endapan berwarna putih hal ini menunjukakan bahawa
reaksi dengan CuSO4 berlebih adalah positif denaturasi.
Sedangkan pada sampel bekatul ketika ditambahkan dengan CuSO4 terbentuk
endapan dan larutan hijau muda hal ini menunjukkan bahwa reaksi dengan CuSO4 adalah
positif denaturasi,namun ketika bereaksi dengan CuSO4 berlebih tidak terbentuk endapan
dan larutan berwarna hijau,hal ini menunjukan reaksi dengan CuSO4 berlebih adalah
negative denaturasi.
Uji Ninhidrin
Pada praktikum ini dilakukan uji ninhidrin pada sampel putih telur
(albumin),bekatul,susu bubuk. jika sampel berubah warna larutan menjadi ungu atau biru
 ketika diberi reagen ninhidrin, maka sampel tersebut mengandung asam amino. Reaksi dari
perubahan warna ini terjadi pada gugus amino bebas dari asam sehingga gas CO2 akan
dikeluarkan. Reagen ninhidrin sendiri merupakan reagen yang sering digunakan untuk
mendeteksi asam amino dan penetapan konsentrasi larutan, reagen ini adalah hirat dari
triketen siklik. Dari hasil praktikum dapat diketahui bahwa bekatul berubah warna menjadi
ungu dan terdapat endapanbiru ketika dipanaskan, hal ini menunjukkan bahwa bekatul
mengandung asam amino, pada susu bubuk berubah warna menjadi ungu ++ ketika
dipanaskan, hal ini menunjukkan bahwa susu bubuk mengandung asam amino dan pada
putih telur warna menjadi biru pekat ketika dipanaskan, hal ini menunjukkan bahwa putih
telur mengandung asam amino.

Metode Kjehdahl

Metode kjeldahl merupakan metode yang digunakan untuk menentukan kadar nitrogen
total. Prinsip dari penentuan kadar protein dengan metode kjedahl adalah penentuan jumlah
Nitrogen (N) yang dikandung oleh suatu bahan dengan cara mendegradasi protein bahan
organik dengan menggunakan asam sulfat pekat untuk menghasilkan nitrogen sebagai amonia,
kemudian menghitung jumlah nitrogen yang terlepas sebagai amonia lalu mengkonversikan ke
dalam kadar protein dengan mengalikannya dengan konstanta tertentu. Analisa protein dengan
metode kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan, yaitu proses destruksi, proses
destilasi, dan tahap titrasi. Pada percobaan ini, dianalisis kadar protein pada sampel yaitu
bekatul.

– Destruksi

Sampel di destruksi dengan memanaskan sampel dalam asam sulfat pekat sehingga
terjadi penguraian sampel menjadi unsur-unsurnya yaitu C, H, O, N, S, dan P. Unsur N dalam
protein ini dipakai untuk menentukan kandungan protein dalam suatu bahan. Pada saat proses
destruksi Selain asam sulfat pekat ini menguraikan sampel, asam sulfat ini juga bereaksi
dengan ion ammonium pada sampel membentuk ammonium sulfat. Ion ammonium inilah yang
menunjukkan keberadaan protein pada sampel. Reaksi di katalisis dengan adanya garam
kjeldahl.
Garam kjeldahl berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dengan menaikkan titik
didih asam sulfat saat dilakukan penambahan H2SO4 pekat, serta mempercepat kenaikan suhu
asam sulfat, sehingga destruksi berjalan lebih cepat dan lebih sempurna. Garam kjeldahl
tersebut terdiri dari campuran K2SO4 dan CuSO4●5H2O. Ion logam Cu akan menaikkan titik
didih H2SO4 sedangkan K2SO4 akan menarik air yang terdapat pada sampel. Karena titik didih
menjadi lebih tinggi, maka asam sulfat akan membutuhkan waktu yang lama untuk menguap.
Karena hal ini, kontak asam sulfat dengan sampel akan lebih lama sehingga proses destruksi
akan berjalan lebih efektif. Asam sulfat yang bersifat oksidator kuat akan mendestruksi sampel
menjadi unsur-unsurnya.

Selama proses destruksi, terjadi reaksi berikut:

K2SO4 + 2H2SO4 → 2KSO4 + 2 H2O + SO2

protein / (CHON) + On + H2SO4 → CO2 + H2O + (NH4)2SO4

Proses destruksi di tandai dengan perubahan warna larutan menjadi warna biru dan bening.
Setelah itu larutan di dalam labu kjeldahl didinginkan terlebih dahulu dan kemudian diencerkan
dengan penambahan 10 mL aquades.

– Destilasi

Tujuan destilasi adalah memisahkan zat yang diinginkan, yaitu dengan memecah
amonium sulfat menjadi amonia (NH3) dengan menambah beberapa mL NaOH hingga tepat
basa, kemudian larutan sampel ini dipanaskan. Prinsip destilasi adalah memisahkan cairan atau
larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk
memberikan suasana basa karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam keadaan asam.
Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan
penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan oleh pemanas dalam alat destilasi melalui
steam. Selain itu sifat NaOH yang apabila ditambah dengan aquadest menghasilkan panas,
meski energinya tidak terlalu besar jika dibandingkan pemanasan dari alat destilasi, ikut
memberikan masukan energi pada proses destilasi. Panas tinggi yang dihasilkan alat destilasi
juga berasal dari reaksi antara NaOH dengan (NH4)2SO4 yang merupakan reaksi yang sangat
eksoterm sehingga energinya sangat tinggi. Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan
ditangkap oleh larutan asam standar. Asam standar yang dipakai dalam percobaan ini adalah
asam borat 4 %. Erlenmeyer yang berisi 10 mL asam borat 4 % + BCG-MR (campuran brom
cresol green dan methyl red) ditempatkan menjadi destilat. Erlenmeyer ini digunakan untuk
menangkap amoniak hasil reaksi NaOH dengan (NH4)2SO4. BCG-MR merupakan indikator
yang bersifat amfoter, yaitu bisa bereaksi dengan asam maupun basa. Indikator ini digunakan
untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebih. Selain itu alasan pemilihan indikator ini
adalah karena memiliki trayek pH 6-8 (melalui suasana asam dan basa / dapat bekerja pada
suasana asam dan basa), yang berarti memiliki rentang trayek kerjanya yang luas (meliputi
asam-netral-basa). Pada suasana asam, indikator akan berwarna merah muda-ungu, sedang
pada suasana basa akan berwarna hijau-biru. Setelah ditambah BCG-MR, larutan akan
berwarna merah muda-ungu karena berada dalam kondisi asam.
Asam borat (H3BO3) berfungsi sebagai penangkap NH3 sebagai destilat berupa gas yang
bersifat basa. Selama proses destilasi lama-kelamaan larutan asam borat akan berubah warna
menjadi hijau kebiruan, hal ini karena larutan menangkap adanya ammonia dalam bahan yang
bersifat basa sehingga mengubah warna merah muda-ungu menjadi hijau-biru.
Reaksi yang terjadi :
(NH4)2SO4 + NaOH → Na2SO4 + 2 NH4OH
2NH4OH → 2NH3 + 2H2O
4NH3 + 2H3BO3 → 2(NH4)2BO3 +H2

Reaksi destilasi akan diakhiri dengan perubahan warna larutan dalam erlenmeyer menjadi
hijau-biru akibat reaksi indikator pada suasana basa akibat menangkap ammonia.

–Titrasi

Langkah terakhir dalam proses analisis protein adalah titrasi. Titrasi asam-basa
digunakan untuk menentukan kadar protein dalam sampel. Karena NH3 yang terbentuk adalah
asam lemah, digunakan HCl 0,05 N untuk menitrasi asam borat yang sudah menangkap
ammonia hasil destilasi, titik akhir di tandai dengan perubahan warna menjadi merah muda-
ungu karena adanya indikator pada kondisi sedikit basa (mendekati netral).

Reaksi yang terjadi

4NH3 + 2H3BO3 → 2(NH4)2BO3 +H2 ……………………….(1)

(NH4)2BO3 + 2 HCl → 2 NH4Cl + H2BO3 ……..…………………(2)
Reaksi 1 adalah reaksi penangkapan ammonia distilat oleh asam borat, dan reaksi (2) adalah
reaksi penetralan pada titrasi asam-basa. Dari reaksi di (2) diatas, bahwa 1 mol HCl akan
bereaksi dengan 1 mol ammonia (dalam bentuk NH4Cl). Sehingga banyaknya protein dalam
sampel dapat dihitung dari konversi HCl yang digunakan dikali dengan factor konversi
nitrogen protein.

Dari hasil penilitian, maka didapatkan kadar protein bekatul sebesar 15,2106 % pada kondisi
masih basah ( Masih perhitungan dalam larutan ).

Metode Lowry

Penentuan kadar protein dengan metode Lowry didasarkan pada reaksi antara Cu2+ dengan
ikatan peptida dan reduksi asam Fosfotungstat dan asam Fosfomolibdat oleh tirosin dan
triptofan yang merupakan residu protein yang akan memberikan warna biru. Warna biru yang
dihasilkan tergantung pada kandungan residu triptofan dan tirosinenya sehingga pengukuran
kadar sampel dapat dilakukan dengan pengukuran absorbansi sampel pada panjang gelombang
670nm. Pembanding yang digunakan yaitu adalah standar BSA dengan konsentrasi sampel
yang berbeda yaitu 0,1 ml; 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1,0 ml. Pada tiap tabung sampel
ditambahkan larutan Lowry A (reagen folin) lalu ditambahkan juga larutan Lowry B yang
terdiri dari larutan Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 M, CuSO4 1% dan Na-K-Tartrat 2% . Larutan
Na2CO3 berfungsi sebagai garam yang mengkoordinasikan reaksi dalam suasana basa bersama
NaOH, larutan Na-K-Tartrat berfungsi mencegah terjadinya pengendapan kuprooksida dalam
reagen Biuret, sedangkan larutan CuSO4 berfungsi untuk mereduksi Fosfotungstat dan
Fosfomolibdat. Adapun reagen Biuret untuk memberi suasana basa, sehingga akan
menghasilkan warna biru dimana intensitas warna ini bergantung dari kadar protein yang akan
ditentukan. Ada pun tujuan dari pembuatan larutan standar dengan berbagai konsentrasi adalah
untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan persamaan garis
lurus yang diperoleh dari grafik larutan standar. Reaksi yang terjadi yaitu :

(NH4)2SO4 + NaOH → Na2SO4 + 2 NH4OH

2NH4OH → 2NH3 + 2H2O
4NH3 + 2H3BO3 → 2(NH4)2BO3 +H2

Berdasarkan hasil percobaan analisis kadar protein, didapat kurva standar yang semakin
tinggi konsentrasi maka semakin tinggi juga absorbansinya, karena mengindikasikan protein
yang terlarut dalam larutan semakin banyak. Kemudian didapatkan persamaan y = 0,0004x +
0,0113 dengan nilai R2 = 0,9941 dan diperoleh kadar protein sampel sebanyak 17,28%. Jika
dibandingkan dengan metode Kjeldahl maka kadar protein yang diperoleh pada metode Lowry
lebih banyak dibanding dengan metode Kjeldahl yang kadar proteinnya sebesar 15,2106%. Hal
ini dikarenakan pada metode Lowry merupakan metode yang mengukur jumlah protein yang
terlarut, sedangkan pada metode Kjeldahl menghitung jumlah protein total sehingga hasil yang
didapat pada metode Lowry lebih kecil dari metode Kjeldahl.

Kesimpulan
1) Protein bila dipanaskan akan mengalami denaturasi
2) Protein yang mengalamai denaturasi ketika Protein + ion positif keadaan pH netral =
terjadi pengendapan. Yaitu pada sampel albumin dan bekatul.
3) Dari sampel yang telah diuji ,sampel yang mengandung asam amino adalah
albumin,bekatul dan susu bubuk.
4) Kadar protein total dengan metode kjeldahl didapat persentase sebesar 15,2106%
sedangkan kadar protein terlarut dengan metode lowry didapat kadar protein sebesar
17,28%

Daftar pustaka
Adugna, Solomon dkk. (2004). Medical Biochemistry. Adis Ababa: Ethiophia Public Health
Training Initiatifi

EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA) . (2012). Scientific Opinion
on Dietary Reference Values for protein1. European Food Safety Authory (EFSA)
Journal.10 (2):2557

Falvo, Michael J., Hoffman Jay R. (2004). Protein – Which Is Best?. Journal of Sports
Science and Medicine 3: 118-130

Salazar, Andrew., Michael Keusgen., Jörg von Hagen. (2016). Amino Acids In The
Cultivation Of Mammalian Cells. Amino Acids Journal. 48:1161–1171. DOI
10.1007

Tellingen, Christa Van. (2001). Biochemistry. Amsterdam: Louis Bolk Instituut

Lampiran
Foto Hasil praktikum